This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).

NOTA: Etica Dichiarazione: Il protocollo per la gestione degli animali è stato approvato dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) della University of California, Irvine, il protocollo # 2010-2943. 1. Rimozione del midollo spinale <ol><li> Posizionare asciugamani di carta bagnati con ~ 100% di liquido isoflurano, USP di eutanasia da camera e mettere gli asciugamani di carta a secco in cima. Posizionare il mouse nella camera in cima ai tovaglioli di carta a secco in modo da mouse non sia a contatto con l&#39;isoflurano e assicurarsi che la camera è coperto. Attendere almeno un minuto dopo la cessazione della respirazione per garantire che il mouse è eutanasia. </li><li> Eseguire una sezione spinale del collo per assicurare il mouse è eutanasia. Non eseguire una dislocazione cervicale in quanto ciò potrebbe danneggiare il midollo spinale. </li><li> Spruzzare il mouse con etanolo al 70% per bagnare i capelli. </li><li> Utilizzare forbici Belle taglienti per rimuovere i capelli e la pelle dalla parte posteriore del mouse per esporre la colonna vertebrale cervicale lamina da circa 1 (C1) A lamina sacrale 4 (S4). </li><li> Usando un bisturi con lama # 10, fare incisioni a sinistra ea destra della colonna vertebrale per separarlo dal muscolo e grasso. Questo renderà la rimozione del midollo spinale molto più facile. </li><li> optional: a curve rongeurs Luer possono essere utilizzati per scavare via la carne supplementare. </li><li> Tenendo la parte superiore delle vertebre spinali con seghettati pinze Graefe, inserto in titanio curva Vännäs forbici con il lato curvo in alto nella colonna vertebrale esposta a C1, facendo attenzione a non toccare il midollo spinale. </li><li> Far scorrere il titanio curva forbici Vännäs tutta la strada a destra e fare un piccolo taglio. Un piccolo suono crunch deve essere ascoltato e sentito come le forbici tagliano le vertebre. Ripetere questo taglio sul lato più a sinistra del cavo. Fare attenzione a non andare troppo in fretta o fare troppo grande di un taglio come questo rischiare di danneggiare il cavo con le forbici. </li><li> Il singolo lamina deve poter essere sollevato con la pinza una volta che i lati delle vertebre sono tagliate. REPEAT questo passaggio per ogni lamina fino S4, continuando a tenere e tirare indietro le vertebre del midollo spinale. NOTA: le vertebre di sopra del sito di trapianto probabilmente verrà fuori una volta che è tagliato al sito di trapianto. Continuare la procedura di avviamento appena sotto il sito di trapianto. </li><li> optional: gettare le vertebre verso il basso per vedere dove il sito di trapianto è e misura e tagliare ~ 20 millimetri rostrale e caudale al sito di trapianto. NOTA: Quando si trapiantano NPC più non saranno necessari come gli NPC trapiantati in genere non migrano più lontano di 15 mm. La quantità di midollo spinale necessaria dipenderà esperimento e migrazione caratteristiche del tipo di cellula trapiantato. Effettuare tagli rostrale e caudale equidistanti al sito di trapianto consentirà al sito di trapianto di essere poste più facilmente durante l&#39;imaging. </li><li> Usando un bisturi con lama # 11 tagliare accuratamente i gangli a destra e sinistra del lato ventrale del midollo spinale a partire dalla fine rostrale. Questo will consentire il midollo spinale per essere rimosso dalle vertebre ventrale più facilmente. NOTA: Fatto rapidamente (passaggi 1,7-1,11), il midollo spinale non si asciugherà. Tuttavia, 1x PBS può essere somministrato al cavo per mantenerlo umido. </li><li> Capovolgere il mouse e tenere premuto il mouse verso l&#39;alto in modo che il midollo spinale è rivolto verso il basso. Sbucciare cautela il midollo spinale con pinze Graefe seghettate chiusi. Senza intaccare il midollo spinale, tagliare accuratamente ogni gangli rimanenti per consentire al midollo spinale da sollevare in un unico pezzo integro. </li><li> Assicurarsi che il midollo spinale è in RPMI-1640 e posizionarlo sul ghiaccio per il trasporto al microscopio 2P. </li></ol> 2. Preparazione di Spinal Cord for Imaging <ol><li> Incorporare midollo spinale in agarosio <ol><li> Tenere il midollo spinale isolato in refrigerate RPMI-1640 sul ghiaccio prima di imaging. </li><li> Pesare agarosio (bassa temperatura di gelificazione) e preparare una soluzione al 5% in 5 ml di PBS 1x. Microonde la soluzione di agarosio 5% per 15 secondi per sciogliere la agnata e lasciar raffreddare la soluzione a 37 ° C. </li><li> Preparare il midollo spinale appoggiandolo su un foglio di Parafilm con il lato ventrale rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Pipettare circa 5 ml di soluzione di agarosio 5% sopra il lato ventrale del midollo spinale. Sia l&#39;agarosio solidificare per raffreddamento a temperatura ambiente. Solidificazione completa richiede circa 5 minuti. </li><li> Applicare un leggero strato di adesivo di tessuto per una copertura di slittamento piazza 22 millimetri. </li><li> Invertire il midollo spinale incorporato, posizionando il lato ventrale su parafilm. Il lato dorsale sarà ora rivolta verso l&#39;alto. Rispettare la polizza di copertura sul lato dorsale, e immergere l&#39;agarosio incorporato midollo spinale / copertura preparazione slittamento in RMPI per solidificare l&#39;adesivo. Rimuovere l&#39;eccesso solidificato agarosio con una lama di rasoio. </li></ol></li><li> Montaggio del midollo spinale sul palco microscopio <ol><li> Applicare vaselina sul fondo del vetrino. Questo stabilizzerà la preparazione durante la perfusione. </li><li> Posizionare la preparazione del midollo spinale in unl&#39;imaging bene sul palco microscopio con il lato ventrale rivolto verso l&#39;alto verso l&#39;obiettivo immersione 25X. Il pozzo di imaging costruito su misura è di circa 20 mm di profondità, 50 mm di lunghezza, e 50 mm di diametro. </li><li> Immagine mentre superfusing la preparazione con riscaldato (37 ° C), ossigenato (95: 5 ossigeno: anidride carbonica-CarboGen) medium RPMI-1640 senza siero. <ol><li> Supporti Pre-calda a 37 ° C nel bagnomaria e collegarlo alla pompa tubo inserendo il tubo nella bottiglia media. </li><li> Mantenere la temperatura del fluido a 37 ° C un dispositivo riscaldatore al collegamento del tubo alla camera. Mezzi Superfuse attraverso bene a 3 ml / min usando tubo collegato alla pompa tubo (Figura 1B). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 2P Imaging di ventrale del midollo spinale <ol><li> Setup Microscopio <ol><li> Acquisire le immagini da Thy1-EYFP midollo spinale con un Ultra Ti Chameleon: laser Sapphire sintonizzati a 900 nm. Attenuare potenza del laser inesemplare a &lt;5% per garantire la fototossicità minimo 16. Mantenere la temperatura mediante perfusione di ossigeno-perfuso RPMI-1640 ad una costante di 37 ° C utilizzando un unico riscaldatore soluzione di linea di garantire immagini stabili, e da evitare la dispersione dei tessuti e danno cellulare. </li><li> Per separare segnale fluorescente eGFP e EYFP, posizionare una 520 nm dicroico singolo-edge e un nm singolo bordo beam splitter dicroico 560 in serie per separare 2P emissione in tre canali, volutamente dividendo l&#39;emissione verde per migliorare la visibilità. NOTA: Questi canali sono indicati come blu-verde (emissione &lt;520 nm), verde-giallo (520-560 nm), e il rosso (emissione&gt; 560 nm). Tubi fotomoltiplicatori rilevano emessi luce in ogni canale. </li></ol></li><li> Aree di imaging di posizionamento di interesse <ol><li> Utilizzando l&#39;oculare e una fonte di luce campo chiaro, mettere a fuoco l&#39;obiettivo di immersione a bordo ventrale del midollo spinale per impostare un punto di riferimento. </li><li> Assicurarsi fonte di luce ambiente è sicuro spento e swprurito a 2P eccitazione aprendo l&#39;otturatore laser. </li><li> Se disponibile, durante la ricerca dei tessuti per le aree di interesse, di utilizzare un valore inferiore di risoluzione, un volume più alto senza zoom digitale, e velocità di scansione più elevata rispetto a quando l&#39;acquisizione di immagini finali. Le impostazioni tipiche con questo sistema durante la ricerca dei tessuti per una regione di interesse sono: Risoluzione: 256 pixels; Volume: x = 600 micron, y = 600 micron, z = 0-300 micron. </li><li> Osservare gli assoni EYFP vicino al bordo ventrale del midollo spinale. Secondo segnale armonico da collagene (blu) sarà più luminoso sul bordo del tessuto del midollo spinale. Individuare gli assoni EYFP solo dorsale per il secondo segnale armonica dal collagene e il segnale EYFP viene visualizzati nel canale verde-giallo. </li><li> Individuare il sito di trapianto nel centro longitudinale della preparazione del midollo spinale 14. Per i topi 1 giorno dopo eGFP-NPC trapianto, individuare il sito di trapianto puntando il percorso del fascio nel piano z in profondità nei tessuti. Il sito trapianto will variare leggermente tra gli animali, ma è generalmente trova ~ 200 micron dal bordo ventrale. Osservare i gruppi di eGFP-NPC nei tratti di sostanza bianca, più vicino ai bordi ventrali e laterali nei topi dopo giorno 1 post-trapianto. </li></ol></li><li> Acquisizione immagini finali <ol><li> Acquisire risoluzione di 512 pixel; Volume: x = 270 micron, y = 212 micron, e z = 100 micron utilizzando il software Slidebook 6. Compilare z-stack con l&#39;acquisizione di piani focali sequenziali in incrementi di 2,5 micron. </li><li> Eseguire una scansione bidirezionale con adeguata compensazione per garantire una rapida quantificazione di tutti gli oggetti che migrano nel midollo spinale interlacciato. Assicurarsi che il frame rate di acquisizione ideale per determinare la velocità cellulari all&#39;interno del midollo spinale è di circa 1 frame / sec. NOTA: le impostazioni di imaging possono essere modificate per le preferenze dei singoli utenti, quali frame rate di acquisizione, la risoluzione delle immagini e dei volumi di imaging. Volumi di imaging più grandi in genere più tempo per acquisire a un GIVRisoluzione en. </li><li> Analizzare, colture, liscio, e PseudoColor file immagine Slidebook con il software di analisi di immagine, come Bitplane Imaris 7.7. Produrre video finali time-lapse da pettinatura volumi di imaging consecutivi utilizzando un processo automatizzato in Slidebook e Imaris. </li></ol></li></ol>

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The authors have no competing interests.

In tempo reale 2P imaging tessuto intatto è necessario per indagare cinetica NPC e interazioni seguenti trapianto nel topo demyelinated midollo spinale. L&#39;imaging intravitale 2P è comunemente usato per determinare le dinamiche cellulari sul lato dorsale del midollo spinale nei topi viventi, ed è stato utilizzato per studiare demielinizzazione dorsale in malattia demielinizzante 17-19. Tuttavia, poiché NPC trapiantate migrano alla materia bianca ventrale, che si trova troppo in profondità all&#39;immagine in situ utilizzando la microscopia 2P, un preparato ex vivo è necessario. Questa metodologia è stata utilizzata nel nostro laboratorio per determinare la motilità e rimielinizzazione cinetica di NPC trapiantate nel midollo spinale danneggiato e non danneggiata 6. Ex vivo preparazioni abilitare la scansione del midollo spinale non solo longitudinalmente, ma anche trasversalmente dal lato ventrale 6,20 . Ciò consente l&#39;analisi delle differenze di movimento cellulare (velocità e direzione) e interazioni a tsito ransplant, adiacente al sito di trapianto, e a varie distanze dal sito di trapianto 6. Considerando inizialmente ideato questa preparazione di immagine trapiantato eGFP-NPC sul lato ventrale del midollo spinale, che può essere utilizzato per qualsiasi immagine fluorescente o cella tinto a ventrale, dorsale, o fianchi laterali modificando l&#39;orientamento del midollo spinale è montata. I vantaggi di questa preparazione sopra di imaging intravitale comprendono la possibilità di imaging lato ventrale e manca la necessità di anestesia e la chirurgia di sopravvivenza, che è ancora necessario con le nuove preparazioni intravitale utilizzando una configurazione &#39;finestra di vetro&#39; che consentono di più sessioni di imaging senza ripetuti interventi chirurgici 19,21 . Va notato che una limitazione di questa procedura rispetto all&#39;approccio &#39;finestra di vetro&#39; in combinazione con l&#39;imaging intravitale è l&#39;incapacità di ottenere molteplici punti di tempo da un singolo mouse, poiché il midollo spinale viene rimosso e il mouse è eutanasia. Immagini 2P è ideale per risolvere le dinamiche di singole cellule nei tessuti intatti 22,23. 2P eccitazione utilizza fotoni nel vicino infrarosso che permettono per lunghi periodi di imaging dei tessuti profondi con fototossicità minima. 2P eccitazione avviene sull&#39;assorbimento simultanea di due fotoni da un fluoroforo. L&#39;elevata concentrazione di fotoni necessari per 2P eccitazione si ottiene la compressione spazio-temporale dell&#39;uscita laser 2P in un unico piano focale. Ciò limita eccitazione fluorescente al punto focale, riducendo ulteriormente fototossicità in regioni midollo spinale di fuori del piano focale. Fotoni nel vicino infrarosso hanno anche ridotto la dispersione, consentendo immagini fino a circa 300 micron dal lato ventrale del midollo spinale 16. Come per ogni nuova tecnica, invece, 2P di imaging del midollo spinale espiantato ha dei limiti che devono essere tenuti in considerazione. Questo protocollo di imaging utilizza un dichro 520 nmspecchio ic che consente la separazione di eGFP e EYFP fluorescenza deviando emissione eGFP nel canale di fluorescenza di solito riservato a luce blu. Generazione di seconda armonica creato da collagene nel midollo spinale appare anche nel canale blu, ma è facilmente distinguibili dalle cellule eGFP marcate che sono significativamente più luminoso in questa preparazione, e hanno una parte della loro emissione identificabile nel canale verde-giallo come collagene non lo fa. Questa tecnica di miscelazione canale e separazione delle diverse porzioni di un spettri di emissione utilizzando dicroici specifici è spesso utile per l&#39;identificazione visiva o automatica di fluorofori individuali con spettri di emissione vicino o quasi sovrapposizione. Fototossicità è un altro limite di questo protocollo di imaging 2P. Le cellule all&#39;interno di un unico volume di imaging sono sensibili a fototossicità; quindi, sperimentatore deve essere pienamente consapevole dei segni di fototossicità. Fototossicità è tipicamente prima evidente nella riduzione o assenza di cellulemotilità, seguita da photobleaching e / o cambiamenti morfologici nei tessuti locali. Diversi fattori possono danneggiare il tessuto che porta alla fototossicità o renderlo inadatto per live-cell imaging. È fondamentale per monitorare la potenza del laser e la temperatura ed ossigenazione del perfuso RPMI-1640. È inoltre indispensabile per garantire la corretta rimozione del midollo spinale dal mouse senza eccessivo stiramento o compressione del midollo spinale e senza tagliare il midollo spinale con le lame. Se gestita correttamente, la preparazione del midollo spinale espiantato rimarrà valida fino a dieci ore, come stabilito dal robusto motilità cellulare all&#39;interno del midollo spinale ventrale senza diminuzione in dieci ore post-estrattivi. Una varietà di tessuto estratto viene comunemente immaginata per lunghi periodi di tempo e considerata valida 23-26. Pertanto, la quantificazione delle dinamiche cellulari in più regioni all&#39;interno di un singolo midollo spinale è possibile. Infine, va osservato che la stragrande maggioranza delle cellule that non sono fluorescente non verrà visualizzato da questa preparazione (salvo naturalmente autofluorescenti), ed è importante riconoscere che le cellule marcate interagiscono con un ambiente complesso di altri, apparentemente invisibili cellule endogene senza etichetta ed elementi strutturali.

Modelli murini di demielinizzazione, tra cui l&#39;encefalomielite sperimentale autoimmune (EAE) e l&#39;infezione intracranica con neuroadapted mouse virus dell&#39;epatite (MHV), sono ottimi strumenti per studiare percorsi molecolari e interazioni cellulari associati con la malattia. Essi hanno portato e sostenuto l&#39;efficacia della FDA ha approvato terapie farmacologiche, rivolti principalmente la cessazione di autoimmunità e infiammazione 1. Tuttavia, una volta che la rimielinizzazione endogena ha fallito, le terapie attualmente approvate non riparano efficacemente lesioni demielinizzati nel sistema nervoso centrale. Pertanto, le terapie di riparazione focalizzato in questa fase della malattia sono fondamentali per la riduzione dei sintomi cronici e il miglioramento della qualità della vita. Recentemente, le cellule precursori neurali (NPC) sono venuti alla ribalta come un potenziale rigenerativo modalità terapeutica per aree di infiammazione e demielinizzazione bersaglio. Diversi studi hanno evidenziato la capacità di NPC di indurre endogenonoi rimielinizzazione e partecipare direttamente rimielinizzazione 2-8. Perché NPC sono coinvolti in rimielinizzazione diretta, è fondamentale per capire le loro cinetiche e le interazioni con le cellule endogene successivi al trapianto. Dopo il trapianto, NPC migrano ventralmente ad aree di danno sostanza bianca, poi rostralmente e caudalmente relativi al sito di trapianto 5,9. La cinetica della migrazione differiscono in risposta a stimoli ambientali; NPC trapiantati in un midollo spinale danneggiato non hanno velocità maggiori rispetto NPC trapiantate in un midollo spinale danneggiato 6. Dopo un periodo migratorio, trasferiti NPC proliferano ampiamente, ad un tasso più elevato in un cavo danneggiato rispetto spinale per un midollo spinale intatto 6. Infine, la maggior parte degli NPC differenziarsi in oligodendrociti e avviare 4,6,9 rimielinizzazione diretta. La lesione demyelinated è complesso e può includere una popolazione eterogenea di cellule in diverse fasi di unctivation. Ad esempio, un sclerosi multipla (MS) lesione attiva può includere una frazione significativa di cellule T attivate, microglia e dei macrofagi M1 M1, ma un MS lesione cronica silente può essere costituito principalmente da astrociti reattivi con poche cellule infiammatorie 10-13. A causa della diversità delle cellule effettrici, a due fotoni (2P) per immagini in modelli murini di demielinizzazione è uno strumento estremamente utile per aiutare a capire le interazioni cellulari locali all&#39;interno della lesione. In MS e molti modelli di ricerca MS ampiamente utilizzati, la maggior parte delle lesioni si trovano sul lato ventrale del midollo spinale, una regione inaccessibile per l&#39;imaging intravitale 2P grazie alla profondità della lesione e l&#39;alto contenuto lipidico del midollo spinale. Per aggirare questi problemi e interazioni studio cellula-cellula all&#39;interno lesioni lungo il midollo spinale ventrale abbiamo sviluppato un semplice vivo 2P preparazione di imaging 6 ex. Questo studio fa seguito ad una precedente pubblicazione metodi, che ha mostratola procedura per il trapianto di proteine ​​maggiore fluorescente verde (eGFP) NPC esprimente nel midollo spinale dei topi dopo JHMV ceppo di demielinizzazione MHV-indotta 14. Cinque settimane di età i topi sono infettati con JHMV e trapiantati con eGFP-NPC a livello toracico 9 al giorno 14 dopo l&#39;infezione. Il protocollo presentato qui fornisce la procedura dettagliata su come estrarre il midollo spinale, fare un ex vivo agarosio preparazione, e di immagine trapiantato interazioni eGFP-NPC con proteine ​​maggiore giallo fluorescente (EYFP) assoni esprimente. Mice esprimenti EYFP sotto il promotore Thy1 specifico-neuronale sono stati utilizzati in questa procedura 15. Solo alcuni degli assoni esprimono EYFP, rendendolo utile per l&#39;imaging singoli assoni. Qui vi mostriamo midollo spinale rimossi a 7 giorni dopo il trapianto; tuttavia, midollo spinale possono essere estratti in qualsiasi punto nel tempo dopo il trapianto. Mentre noi mostriamo interazioni di NPC con assoni danneggiati, il nostro protocollo può essere utilizzato in combinazione con marcatori fluorescenti geneticidi altri tipi di cellule per indagare una moltitudine di interazioni cellulari che si verificano durante il mouse midollo spinale.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>sharp</td></tr><tr><td>scalpel blade #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Luer rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>agarose, low gelling temperature</td><td>Sigma</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (tissue adhesive)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 mm square cover slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td></td></tr><tr><td>25X dipping objective, 1.1 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>Single inline solution heater</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>520 nm single-edge dichroic beam splitter</td><td>Semrock</td><td>FF520-Di02-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>560 nm single-edge dichroic beam splitter</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>photomultiplier tubes</td><td>Hamamatsu</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C/L variable-speed tubing pump</td><td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>digital thermometer</td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 software</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 software</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

<html> Mentre il protocollo di imaging midollo spinale espiantato può essere utilizzato per visualizzare alcuna fluorescenza all&#39;interno del midollo spinale, i nostri risultati dimostrano rappresentativi interazioni eGFP-NPC con EYFP-assoni. In primo luogo, noi mostriamo la preparazione ventrale del midollo spinale incorporato nella Figura 1A. Avanti, mostriamo la configurazione 2P microscopio e componenti chiave nella Figura 1B. Figura 2 dimostra eGFP e EYFP fluorescenza in una singola z-stack all&#39;interno del midollo spinale ventrale. Acquisizione di consecutivi z-stack può essere compilato per la produzione di video time-lapse per analizzare le dinamiche cellulari in tempo reale all&#39;interno del tessuto intatto. Utilizzando un 520 nm dicroico singolo bordo e una 560 nm a singolo bordo beam splitter dicroico, come notato nel protocollo, in grado di separare il segnale eGFP e EYFP. I singoli canali possono essere pseudocolored software di imaging con verde e giallo. 80 / 52580fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: midollo spinale e la configurazione microscopio. (A) A midollo spinale incorporato in un gel di agarosio al 5% (a sinistra) e montato su un vetrino coprioggetto dopo la rimozione di agarosio eccesso (destra). (B) Un&#39;immagine di setup microscopio con componenti chiave etichettati. 1. Bagnomaria impostato a 37 ° C. 2. Pre-riscaldato RPMI-1640. 3. C / L tubi a velocità variabile della pompa. 4. Singolo riscaldatore soluzione in linea. 5. Obiettivo immersione. 6. Termometro digitale. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52580/52580fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52580/52580fig2.jpg" /> Figura 2: immagine Esempio 2P acquisita all&#39;interno del midollo spinale ventrale ricostruzioni 3D del lato ventrale di un infetto, non danneggiate (A) e JHMV-infetti, demyelinated (B) del midollo spinale.da un mouse Thy1-EYFP seguito al trapianto con gli NPC eGFP-etichettati. Assoni fluorescenza marcata sono pseudocolored giallo e PNG sono pseudocolored verde. Risoluzione dell&#39;immagine: 512 pixel; volume dell&#39;immagine: (A) x = 239 micron, y = 259 micron, z = 65 micron costruiti utilizzando 26 z-stacks distanziate 2,5 micron a parte e (B) x = 497 micron, y = 389 micron, z = 127,5 micron costruiti usando 51 z-stacks distanziati 2,5 micron a parte.

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Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Un nuovo ex vivo preparazione per l&#39;imaging del midollo spinale di topo. Questo protocollo consente a due fotoni imaging interazioni cellulari vivi tutto il midollo spinale.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K Views.  University of California, Irvine.  Un nuovo ex vivo preparazione per l'imaging del midollo spinale di topo. Questo protocollo consente a due fotoni imaging interazioni cellulari vivi tutto il midollo spinale. 

Video: Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Ricerca

Neuroscienze

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del cavo del mouse spinale

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Imaging intravitale di assonale Interazioni con Microglia e macrofagi in un mouse Dorsale colonna Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

In Vivo Duo-colore metodo di Imaging vascolare dinamica dopo la lesione del midollo spinale contusivi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Bioingegneria

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

Two-Photon

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale

Imaging intravitale di assonale Interazioni con Microglia e macrofagi in un mouse Dorsale colonna Crush Injury

Simultanea a due fotoni

In Vivo Duo-colore metodo di Imaging vascolare dinamica dopo la lesione del midollo spinale contusivi

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli