Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio canadese istituti di ricerca sulla salute, scienze naturali e ingegneria ricerca (NSERC Discovery Grant) e la Fondazione di Savoia. OC è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato di ricerca da NSERC.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti conformemente agli orientamenti del Comitato di protezione animale Université Laval e del Consiglio canadese su Animal Care sul benessere degli animali.
1. preparazione preliminare (opzionale: preparare 1 giorno in anticipo)
<ol><li>Preparare tre tipi di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) soluzione (normale, saccarosio e soluzioni di recupero, 1L; si veda tabella 1). Regolare l'osmolalità delle soluzioni a 300 ± 10 mOsm25 e raffreddare il saccarosio ACSF giù un punto vicino allo zero (0-4 ° C). Nota: L'uso di una soluzione di taglio basso-sodio (ACSF-saccarosio) aiuta a preservare la vitalità dei neuroni negli strati superficiali di fettine acute26.</li>
	<li>Preparare 0,75 mL di soluzione di patch contenente un fluoroforo rosso (ad es., Alexa-594) e un indicatore verde sintetico calcio (ad es., Oregon Green BAPTA-1; si veda tabella 1). Includono biocitina (Vedi tabella 1) nella soluzione di patch se post hoc, identificazione morfologica delle cellule registrate è necessario.</li>
	<li>Regolare l'osmolarità della soluzione a 280 ± 5 mOsm e pH a 7,35 ± 0,5. Conservare la soluzione in frigorifero o su ghiaccio in ogni momento. Nota: Scelta dell'indicatore del calcio dovrebbe essere basata sulla sua gamma dinamica e la natura degli esaminatori Ca2 + eventi.</li>
	<li>Utilizzando un estrattore micropipetta, preparare pipette patch dai vasi capillari di vetro borosilicato (Vedi Tabella materiali) con una punta di 2 µm ≈ (pipetta resistenza di 3-5 MΩ) e stimolazione pipette da capillari di teta-vetro borosilicato (Vedi tabella di Materiali) con una punta di 2-5 µm. Nota: Le impostazioni di estrattore per rendere pipette di un determinato diametro e la forma saranno determinate dal tipo di filamento di estrattore e i risultati del test di rampa per un determinato tipo di vetro.</li>
</ol>2. hippocampal fetta preparazione
<ol><li>Anestetizzare il mouse (P13-20; il ceppo e sesso del mouse è determinata dalla questione sperimentale affrontata) con 1 mL di isoflurane collocata su un tovagliolo di carta all'interno di una camera di narcosi per inalazione. Quando l'animale è anestetizzato, come evidenziato da una mancanza di movimento e respirazione lenta, rimuoverlo dalla camera di narcosi e decapitare utilizzando una ghigliottina.</li>
	<li>Esporre il cranio tagliando la pelle con un piccolo paio di forbici dalla parte posteriore del cranio al naso. Utilizzare un piccolo paio di Pinze ossivore mini osso per fare un buco a livello di bregma. Quindi utilizzare le forbici per fare un taglio caudale--rostrale lungo la sutura sagittale. Con le Pinze ossivore afferrare sul retro di ogni lembo di cranio e ascensore verso l'alto e verso l'esterno per rimuovere il teschio che coprono ogni emisfero.</li>
	<li>Dopo che il cervello è completamente esposto, inferiori a quelli dei nervi ottici con una spatolina. Rimuovere il cervello dal cranio e metterlo in una capsula di Petri contenente continuamente ossigenato, freddo ACSF-saccarosio (Vedi tabella 1 per la concentrazione di saccarosio).<ol>
<li>Se il tessuto da più vecchi topi è richiesto, eseguire una perfusione intracardiaca usando una siringa (25G) riempita con 20 mL di gelida ACSF-saccarosio prima dell'estrazione del cervello per ottenere fette di buona qualità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare fette hippocampal del cervello animale estratti.<ol>
<li>Posizionare un pezzo di carta da filtro su una piastra di Petri ricco di ghiaccio, trasferire il cervello sulla carta da filtro, lasciare che il freddo di cervello per circa 2 min. Sezionare i due emisferi.</li>
		<li>Incollare gli emisferi dissecati (l'orientamento è determinato dallo scopo sperimentale per ottenere fette di coronale, trasversale o orizzontale) su una tabella del vibratome e immergetelo nel vassoio vibratome riempito con gelida ossigenato ACSF-saccarosio. Fare 300 µm fette spesse ad una temperatura di circa 1 ° C utilizzando un dispositivo di raffreddamento del vibratome o mettendo il ghiaccio intorno il vassoio del vibratome.</li>
		<li>Utilizzando un pennello piatto, si accumulano le fette contenente l'ippocampo (fino a 6 fette per emisfero) in un bagno contenente ossigenato ACSF-recupero riscaldato a 37 ° C.</li>
		<li>Lasciare le fette nel bagno ACSF-recupero per almeno 45 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cellule intere Patch-clamp registrazioni
<ol><li>Impostare una fetta hippocampal in posto in un bagno posizionato sotto l'obiettivo (ingrandimento: 40x, apertura numerica: 0.8) di un microscopio a due fotoni scansione laser. Irrorare continuamente il bagno con ossigenato ACSF-normale riscaldata a 30-32 ° C a una velocità di 2,5-3 mL/min.</li>
	<li>Utilizzare contrasto differenziale di interferenza a infrarossi (IR-DIC) o microscopia Dodt-SGC per individuare una cella di interesse utilizzando la dimensione, la forma e la posizione. Nota: A seconda della popolazione mirata del neurone, un modello di topo transgenico può essere utilizzato per individuare facilmente le celle di interesse. In questo caso, questo passaggio può essere sostituito con l'uso di una fonte di luce fluorescente.</li>
	<li>Riempire una pipetta di stimolazione con una soluzione di ACSF-normale che contiene il fluoroforo rosso (ad es., Alexa-594).</li>
	<li>Impostare la pipetta di stimolazione (collegata a un'unità di stimolazione elettrica) sopra la fetta in modo che la punta è nella stessa regione come la cellula di interesse.</li>
	<li>Dopo aver compilato la pipetta patch con soluzione di patch e allegarlo ad una fase di testa, impostarlo sulla fetta in modo che la sua punta è direttamente sopra la cella di interesse.</li>
	<li>Inserire una siringa un rubinetto a tre vie e collegarlo al patch-pipetta attraverso il tubo di plastica. Iniettare una pressione positiva costante nella pipetta patch (≈ 0,1 mL) usando la siringa. Tenere il rubinetto in posizione "close".</li>
	<li>Attivare il modulo di software di controllo amplificatore e passare alla modalità tensione-morsetto cliccando sul pulsante "VC". Aprire il software di acquisizione dati di elettrofisiologia (ad esempio, clampex) per l'acquisizione di segnali elettrofisiologici e cliccare sull'icona "Membrana Test" di averlo continuamente invia un impulso di tensione quadrati (5 mV, 10 ms), che è necessario monitorare cambiamenti nella resistenza pipetta.</li>
	<li>Abbassare la pipetta patch fino a quando non è proprio sulla cima della cella mirata. Al momento di fare contatto con la membrana cellulare, rimuovere la pressione ruotando il rubinetto nella posizione "aperta". Nota: Il contatto con la membrana cellulare viene rilevato quando un piccolo aumento nella resistenza pipetta (≈ 0.2 MΩ) è visto e una piccola rientranza sulla cella è causata da pressione positiva.</li>
	<li>Esercitare una leggera pressione negativa per la pipetta patch usando una siringa vuota nel rubinetto fino a quando la resistenza di pipetta fornita dal software raggiunge 1 GΩ. Nella finestra 'Membrana Test' dei software di acquisizione dati, fissare la cella a -60 mV.</li>
	<li>Continuare ad applicare pressione negativa fino a quando la cella viene aperta e la configurazione di cellule intere è raggiunto. Rilevamento di questo stato della cellula si basa sull'improvviso cambiamento nella resistenza pipetta (da 1 GΩ a MΩ 70-500 a seconda del tipo di Interneurone) e la comparsa di grandi capacitivi transitori nella finestra 'Membrana Test'.</li>
</ol>4. due-fotone Ca2 + Imaging
<ol><li>Se ti interessa le risposte postsinaptiche eccitatori, aggiungere il gabazine di blocco del recettore GABAA (10 µM) e il blocco del recettore GABAB CGP55845 (2 µM) nel bagno ACSF.</li>
	<li>Nel modulo amplificatore software di controllo, impostare la configurazione di patch al corrente-morsetto cliccando sul pulsante "CC" e registrare schema di attivazione della cellula in risposta alle iniezioni somatiche di depolarizzanti corrente (0.8-1.0 nA, 1 s). Aspettare almeno 30 minuti per la cella per essere riempito con gli indicatori presenti nella soluzione patch. Nota: Schema di attivazione della cellula e la proprietà attive possono essere utilizzate per identificare il sottotipo della cella; per esempio, cellule fast-chiodare. È importante per la concentrazione di indicatore stabilizzare attraverso diffusione prima di avviare la registrazione gatti (Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).</li>
	<li>AP-evocato gatti<ol>
<li>Utilizzando il software di acquisizione immagini, avviare l'acquisizione delle immagini. Individuare un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rossa. Per garantire una risposta visibile, in primo luogo, scegliere un dendrite prossimale (≤ 50 µm) come l'efficienza di AP backpropagation può diminuire in modo significativo con distanza di interneuroni GABAergici22.</li>
		<li>Utilizzando lo strumento rettangolare nel software di acquisizione immagini, ingrandire la regione di destinazione e passare per il "xt" (linescan) modalità. Posizionare la scansione attraverso il ramo dendritico di interesse. Con i controllori di intensità laser del software di acquisizione, è necessario impostare il laser del due-fotone ad un livello di potenza minimo cui fluorescenza verde della linea di base è solo leggermente visibile, per evitare di fototossicità.</li>
		<li>Nel software di elettrofisiologia per la acquisizione di dati software di acquisizione di finestra e l'immagine di «Protocollo», creare una registrazione di prova della durata desiderata contenente un'iniezione di corrente somatica dell'ampiezza desiderata.<ol>
<li>Utilizzando il software di acquisizione immagini, fare clic sul pulsante "Start record" e acquisire la fluorescenza continuamente per 1-2 s. Ripetere l'acquisizione dell'immagine 3 - 10 volte. Attendere almeno 30 s tra singole scansioni per evitare photodamage. Se l'acquisizione di scansioni in più punti lungo un dendrite, portarli in ordine casuale per evitare effetti di ordine.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sinapticamente-evocato gatti<ol>
<li>Individuare un dendrite di interesse utilizzando il segnale di fluorescenza rossa.</li>
		<li>Impostare la pipetta di stimolazione sulla superficie della fetta sopra il dendrite di interesse. Abbassare lentamente la pipetta di stimolazione in posizione, riducendo al minimo movimento per evitare di disturbare la configurazione di cellule intere. Posizione la pipetta a 10-15 µm dal dendrite.</li>
		<li>Per visualizzare la posizione di microdomini sinaptici nei dendriti di Soma, il software di acquisizione immagine passare ai 'xt' (linescan) modalità e posizionare la linea lungo il ramo dendritico di interesse.</li>
		<li>Nella finestra 'Protocollo' (di software di acquisizione dati di elettrofisiologia) e software di acquisizione immagini, creare un processo di registrazione che attiva l'unità di stimolazione dopo l'inizio della prova.</li>
		<li>Utilizzando il software di acquisizione, fare clic sul pulsante "Start record" per eseguire la scansione lungo dendrite continuamente per 1-2 s. Repeat acquisizione 3 - 5 volte, in attesa di 30 s tra le scansioni per impedire il photodamage. Nota: La lunghezza di scansione può essere regolata a seconda della cinetica dell'evento evocati, ma deve essere ridotto al minimo per impedire il photodamage (Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.5.5 in condizioni diverse (ad esempio, diversa intensità/durata della stimolazione, l'introduzione di un blocco farmacologico, ecc.) a seconda della specifica domanda affrontata.</li>
		<li>Interrompere l'acquisizione quando la cella Mostra segni di deterioramento della salute: depolarizzazione sotto -45 mV, aumento della linea di base livello di Ca2 + , deterioramento morfologico dei dendriti (ad es., blebbing, frammentazione; Vedi tabella 2 per la risoluzione dei problemi).</li>
		<li>Per ottenere informazioni preliminari sulla morfologia della cella e tenere traccia della posizione della pipetta stimolazione, acquisire uno Z -stack della cella nel canale del rosso. Utilizzando il software di acquisizione in 'xyz' modalità, impostare i limiti superiore e inferiore dello stack per l'intera cella di immagine con tutti i processi inclusi. Dimensionare la ' passo ' a 1 µm e avvia l'acquisizione dello stack utilizzando il pulsante "Start record".</li>
		<li>Quando la Z-stack acquisizione è completo, utilizzare l'opzione di "Proiezione massima" nel software per sovrapporre tutti i piani focali dello stack e verificare la qualità di acquisizione. Quindi, ritirare lentamente la pipetta patch fuori la fetta.</li>
		<li>Per correggere la fetta per post hoc, identificazione morfologica, rapidamente rimuovere la fetta dal bagno utilizzando un pennello piatto e posizionarlo tra due fogli di carta filtro, in una capsula di Petri ACSF-riempito. Sostituire il ACSF con una soluzione di paraformaldeide (PFA) di 4% e lasciare il piatto in una camera di 4 ° C o in frigorifero durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. esame immuno-istochimico per Post Hoc identificazione morfologica delle cellule registrate
Nota: Dopo 1 notte della fissazione in PFA, la fetta può essere conservata in tampone fosfato (PB) con sodio azide (0,5%) per fino a 1 mese.
<ol><li>Mettere la fetta in soluzione salina tamponata (TBS) con Triton X-100 (0,3%) ed effettuare 4 lavaggi (5-10 min).</li>
	<li>Mettere la fetta in TBS-Triton 0,3% con 10% siero di capra normale (NGS) per 1 h.</li>
	<li>Mettere la fetta in TBS-Triton 0,3% con 1% NGS ed un fluoroforo streptavidina coniugata (ad es., Alexa Fluor 546-coniugato streptavidina, 1: 200) per incubazione di notte.</li>
	<li>Lavare 4 volte (5-10 min) in TBS.</li>
	<li>Montare fette su vetrini da microscopio e immagine utilizzando un microscopio confocale. Per una ricostruzione completa delle cellule, acquisire un Z-stack (passo dimensioni: 1 µm) utilizzando un obiettivo 20x. Per l'imaging di un'etichetta di Alexa-546-coniugato, utilizzare che un laser a 543 nm e una rilevazione di 515-560 nm filtro impostato.</li>
</ol>6. analisi dei gatti
<ol><li>Estrarre i valori di fluorescenza da regioni di interesse (ROI) nelle immagini linescan dai canali rossi e verde e media dei valori delle ripetizioni multiple per ogni condizione per ridurre il rumore. Nota: Quando acquisizione linescan viene eseguito lungo dendrite, è possibile estrarre dati da ROIs multipli, che possono corrispondere a dendritiche microdomini (2-5 µm), e consentendo così lo studio della compartimentazione di segnale Ca2 + .</li>
	<li>Per ogni ROI, esprimere le variazioni di Ca2 + ampiezza come: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> Nota: Qui G è il valore di fluorescenza dal canale verde; G0 è il valore di fluorescenza di base dal canale verde durante il periodo di pre-stimolazione; R è il valore di fluorescenza dal canale rosso18. Come eccitazione del due-fotone è altamente localizzato e non genera un significativo background, sottrazione di fluorescenza di fondo non è necessario.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. 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C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. 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T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Il metodo illustrato di seguito viene illustrato l'utilizzo della combinazione del due-fotone Ca2 + imaging ed elettrofisiologia di patch-clamp per lo studio dendritiche Ca2 + segnalazione nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto. Questo metodo consente per il monitoraggio di entrambi i locali Ca2 + prospetti evocati da AP elettrici di stimolazione o backpropagating in segmenti dendritiche e risposta somatica della cella. Questo lo rende un ottimo strumento per studiare come le varie parti dell'albero dendritico integrano ingressi e comunicano con il soma. Ma data la lunghezza dell'esperimento, particolare attenzione deve essere pagato per la salute delle cellule limitando l'uso di potere del laser per l'imaging in modo da evitare il photodamage di dendriti. Questo può essere ottenuto anche diminuendo il livello di zoom, fare diminuire la durata della scansione, e aumentando la velocità di scansione durante l'acquisizione di immagini. Imaging dei dendrites Interneurone introduce ulteriori sfide. Come dendriti di queste cellule non sono spine, scansione lungo dendrite è consigliabile per facilitare la localizzazione di Ca2 + microdomini postsinaptici. Inoltre, dato un'alto Ca2 + associazione capacità endogena, Ca2 + aumenti nei dendriti Interneurone sono più piccoli e più lento rispetto a quelli generati in dendriti delle cellule piramidali. Ciò richiede l'acquisizione di diverse immagini di linescan per una media di oltre una durata sufficientemente lunga di scansioni individuali al fine di descrivere in modo appropriato la cinetica di segnale Ca2 + .
La stimolazione elettrica locale con elettrodo bipolare Teta-vetro rappresenta un utile strumento per la caratterizzazione di Ca2 + microdomini postsinaptici dendritiche. Tuttavia, si può ancora attivare diversi "en passant" assoni si trovano in una determinata regione. In questo caso, il numero di ingressi attivati è sconosciuto e può essere valutato solo con ulteriori strumenti computazionali. Due-fotone glutammato uncaging27, che consente per la stimolazione simultanea di più singole sinapsi, rappresenta una buona alternativa per suscitare dendritiche Ca2 + risposte locali. Questo metodo è ampiamente usato per lo studio delle cellule principali, che hanno chiaramente definito strutture postsinaptici eccitatori (spine), ma non è adatto allo studio di interneuroni, che nel complesso hanno una densità bassa della spina dorsale. Uncaging glutammato lungo dendrite Interneurone come viene applicato alle cellule principali sarebbe inevitabilmente attivare meccanismi multipli extrasynaptic di Ca2 + segnalazione9,10, rendendo difficile l'interpretazione del osservazioni.
Nell'ultimo decennio, i progressi nelle tecnologie ottiche offerto una migliore risoluzione temporale per due-fotone Ca2 + imaging. Uno dei più promettenti è la microscopia ad accesso casuale (rampa) attraverso deflettori acusto-ottico (ordinatori)28,29. A differenza dei convenzionali raster di scansione, rampa scansioni selezionati punti di interesse ad alta frequenza, che è attivata per la velocità veloce di ordinatori privo di inerzia. È ideale per lo studio simultaneo di più rami dentritici, dato che non è limitata ai punti disposti in un modello lineare. Tuttavia, la maggiore risoluzione temporale offerta dall'od può essere inutile quando la formazione immagine di Ca2 + eventi che durano centinaia di millisecondi all'interno dello stesso piano focale. Inoltre, la posizione di punti all'interno della stessa struttura di interesse di scansione può essere difficile da controllare a causa di micro-derive nelle preparazioni di fetta associati con un tasso di alta perfusione, che è necessario per la fetta di buona qualità. Quindi, il metodo di acquisizione basato su linescan alta risoluzione temporale (500-700 Hz) presentato in questo articolo è ancora preferibile quando Ca2 + segnali in singoli rami dentritici di imaging.

Il contributo di un neurone per attività di rete è in gran parte determinato dalla natura dinamica degli ingressi sinaptici che riceve. Tradizionalmente, il metodo predominante di caratterizzare l'attività sinaptica nei neuroni è invocata da registrazioni di intero-cellula somatica patch clamp di correnti postsinaptiche evocate da stimolazione elettrica degli assoni di passaggio. Tuttavia, unica attività delle sinapsi prossimalmente trova veritiero è segnalato in questo caso1. Inoltre, per valutare i meccanismi specifici di sinapsi, registrazioni da coppie di neuroni e da dendriti in una posizione specifica sono state utilizzate per indirizzare le sinapsi di interesse e i meccanismi di integrazione dendritiche, rispettivamente. Un importante passo avanti nel campo della fisiologia sinaptica è stato realizzato attraverso un connubio di tecniche ottiche ed elettrofisiologiche. Microscopia (2PLSM) in combinazione con Ca2 + imaging e optogenetica strumenti a scansione laser di eccitazione del due-fotone può rivelare dettagli tremende dell'organizzazione dinamica dell'attività sinaptica alle connessioni neuronali specifiche nelle fette del cervello in vitro ed in vivo.
Parecchi vantaggi chiave ha reso 2PLSM risaltare dalla microscopia convenzionale, uno-fotone eccitazione2: (1) a causa di una natura non lineare del due-fotone eccitazione, la fluorescenza viene generata solo nel volume focale, e rappresentano tutti i fotoni emessi segnali utili (senza bisogno di foro di spillo); (2) lunghezze d'onda, utilizzato in 2PLSM, penetra il tessuto di dispersione in modo più efficiente; Inoltre, sparsi i fotoni sono troppo diluiti per produrre eccitazione del due-fotone e fluorescenza di fondo; (3) photodamage e fototossicità sono limitate al piano focale. Di conseguenza, nonostante l'alto costo dei sistemi di 2 fotoni rispetto ai convenzionali microscopi confocali, il 2PLSM rimane un metodo di scelta per le indagini ad alta risoluzione della struttura neuronale e funzione nel tessuto vivente spessa.
La prima applicazione del 2PLSM nel tessuto di scattering è stato all'immagine della struttura e la funzione delle spine dendritiche3. 2PLSM in combinazione con Ca2 + formazione immagine ha rivelato tale funzione di spine come compartimenti biochimici isolati. Poiché in molti tipi di un neurone c'è una corrispondenza univoca tra spine e singole sinapsi4, due-fotone Ca2 + imaging presto divenne un utile strumento di reporting dell'attività delle singole sinapsi in tessuto intatto5, 6,7,8. Inoltre, 2PLSM-Ca2 + l'imaging basato su è stato usato con successo per monitorare l'attività dei canali del calcio singolo e le interazioni non lineari tra le conduttanze intrinseche e sinaptiche, nonché di valutare lo stato - e attività-dipendente regolamento del Ca2 + segnalazione nei dendriti neuronali5,6,7,8,9,10,11.
Il calcio è un secondo messaggero intracellulare onnipresente, e relativa organizzazione subcellulare spatiotemporal determina la direzione di reazioni fisiologiche, da cambiamenti nella forza sinaptica del regolamento dello ione di canali, crescita dendrite e della colonna vertebrale, come così come la morte delle cellule e la sopravvivenza. Dendritiche Ca2 + quote altimetriche si verificano attraverso l'attivazione di vie multiple. Potenziali di azione (APs), backpropagating per i dendrites, aperto tensione-gated del calcio canali12 e produrre relativamente global Ca2 + transitori (gatti) in dendriti e spine13. Trasmissione sinaptica è associata con l'attivazione di postsinaptica Ca2 +-permeabili recettori (NMDA, Ca2 +-permeabile AMPA e kainato), attivazione sinaptica gatti6,14,15. Infine, gli eventi possono Ca2 + possono essere generati nei dendriti sotto determinate circostanze11,12,13,16.
Si avvale di due fotoni Ca2 + imaging in combinazione con le registrazioni elettrofisiologiche patch clamp sintetico Ca2 +-sensibili indicatori fluorescenti, che in genere sono trasportati attraverso l'elettrodo di patch durante le registrazioni della intero-cellula . Un metodo standard per la quantificazione delle dinamiche2 + Ca è basato sul doppio indicatore metodo17,18. Utilizza due fluorofori con spettri di emissione ben separati (ad esempio, una combinazione di un rosso Ca2 +-insensibile tintura verde Ca2 + indicatori, quali Oregon Green BAPTA-1 o Fluo-4) e ha diversi vantaggi rispetto alla Metodo unico indicatore. Prima di tutto, a Ca2 +-insensibile colorante viene utilizzato per individuare piccole strutture di interesse (rami dentritici e spine) dove verrà eseguita Ca2 + formazione immagine. In secondo luogo, il rapporto tra la variazione di fluorescenza verde e rosso (ΔG/R) viene calcolato come una misura di [Ca2 +], che è in gran parte insensibile ai cambiamenti di fluorescenza della linea di base a causa di fluttuazioni [Ca2 +]017 , 18. Inoltre, i cambiamenti di fluorescenza possono essere calibrati in termini assoluti Ca2 + concentrazioni19.
Una preoccupazione generale durante l'esecuzione di due fotoni Ca2 + imaging esperimenti in fettine acute è la salute delle cellule e la stabilità dell'acquisizione immagine a causa della laser ad alta potenza in genere utilizzata. Inoltre, in esperimenti di Ca2 + imaging, c'è preoccupazione per la perturbazione e sostanza sovrastima del servizio subcellulare2 + dinamiche per Ca dovuta al fatto che fungono da indicatori di Ca2 + altamente mobile esogeno Ca2 + buffer. Così, la scelta dell'indicatore di Ca2 + e la sua concentrazione dipende il tipo di un neurone, l'ampiezza prevista dei gatti e la questione sperimentale.
Abbiamo adattato il metodo di due fotoni Ca2 + imaging per indagine di Ca2 + fluttuazioni nei dendriti dei neuroni GABAergici interneuroni9,10,11,20,21 , 22. mentre la maggior parte del Ca2 + imaging gli studi iniziali sono stati fatti nei neuroni principali, interneuroni inibitori mostrare una varietà grande di Ca2 + meccanismi funzionali che sono distinti da quelli a cellule piramidali20 , 23 , 24. questi meccanismi di Interneurone specifici (ad es., Ca2 + permeabili i recettori AMPA) possono svolgere ruoli specifici nel regolare l'attività delle cellule. Mentre dendritiche Ca2 + segnalazione in interneuroni è un obiettivo allettante per ulteriori indagini, due-fotone Ca2 + imaging nei dendriti di queste cellule presenta sfide aggiuntive, da un diametro più sottile dei dendriti e la mancanza di spine per una particolarmente elevato Ca2 + associazione capacità endogena. Come la nostra ricerca interessi riguardano lo studio di interneuroni hippocampal, il seguente protocollo, mentre applicabili a differenti popolazioni neuronali, è stato adattato per affrontare queste sfide.
Questo protocollo è stato eseguito con un microscopio a due fotoni confocale commerciale, che era dotato di due rivelatori esterni, non descanned (NDDs), modulatore elettro-ottico (EOM) e un Dodt scansione contrasto sfumatura (SGC) e installato su un tavolo ottico. Il microscopio è stato accoppiato con un laser di multiphoton costituita mode-locking a 800 nm (> 3 W, 140 fs legumi, tasso di ripetizione di 80 Hz). Il sistema di imaging è stato dotato di un impianto di perforazione di elettrofisiologia standard, tra cui una camera di aspersione con controllo della temperatura, una piattaforma di traduzione con due micromanipolatori, un amplificatore microelettrodo computerizzato, un digitalizzatore, una stimolazione unità e software di acquisizione dati.

<table><tbody><tr><td>Animal Strain: Mouse CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 hydrochloride</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Sodium phosphate monobasic&lt;br/&gt; monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Guanosine (GTP)-Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Streptavidin-conjugated Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Patch Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Theta Borosilicate Glass Capillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Imaging Acquisition Software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Temperature Controller TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; MultiClamp 700B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Digidata 1440A Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Confocal Translator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; pClamp Data Acquisition Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; A365 Constant Current Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Vibraplane Optical Table</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

La formazione immagine del calcio (Ca2 +) è un potente strumento per studiare la dinamica spazio-temporale di Ca2 + segnali intracellulari nei dendriti neuronali. CA2 + fluttuazioni possono verificarsi attraverso una varietà di meccanismi intracellulari e di membrana e svolgono un ruolo cruciale nell'induzione di plasticità sinaptica e nella regolazione dell'eccitabilità dendritiche. Quindi, la possibilità di registrare diversi tipi di Ca2 + segnali in rami dentritici è preziosa per gruppi studiano come dendriti integrano informazioni. L'avvento della microscopia del due-fotone ha reso tali studi significativamente più facile risolvendo i problemi inerenti all'imaging in tessuto vivo, come ad esempio la dispersione della luce e photodamage. Inoltre, attraverso la combinazione di tecniche elettrofisiologiche convenzionale con due fotoni Ca2 + imaging, è possibile indagare locale Ca2 + le fluttuazioni nei dendriti neuronali in parallelo con le registrazioni di attività sinaptica Soma. Qui, descriviamo come utilizzare questo metodo per studiare la dinamica locale Ca2 + transitori (gatti) nei dendriti di interneuroni inibitori GABAergici. Il metodo può essere applicato anche allo studio dendritiche Ca2 + segnalazione in diversi tipi di un neurone in fettine di cervello acuto.

Utilizzando il protocollo presentato qui, abbiamo ottenuto gatti evocati mediante iniezione di corrente somatica e da stimolazione elettrica nei dendriti di oriens/alveus interneuroni nella zona CA1 dell'ippocampo. Dopo la patch di un neurone, identificato basata sulla sua forma e la posizione, abbiamo acquisito scansioni attraverso un dendrite prossimale in più punti al dato Distanze dal soma (Figura 1A). Abbiamo osservato una diminuzione dell'ampiezza dei gatti indotta da backpropagating APs come la distanza dal soma aumentato (indicativo di ridotta ampiezza AP o un declino di distanza-dipendente nella distribuzione del canale del calcio, Figura 1B). Dopo esame immuno-istochimico (utilizzando streptavidina-coniugati Alexa Fluor 546), siamo stati in grado di recuperare l'etichettatura biocitina della cella e identificare il neurone registrato come una cella di bistratified con un assone che occupa strato oriens e strato radiato (Figura 1 C). nel secondo esperimento, una pipetta di stimolazione è stata portata a un sito dendritico distale. La scansione lungo dendrite, quindi siamo stati in grado di valutare l'ampiezza dei postsinaptica Ca2 + segnali in un determinato ramo dendritico (Figura 2A–C) in risposta a stimolazione elettrica degli assoni di passaggio. I gatti postsinaptici differivano tra vicini dendritiche microdomini (segmento 1 a 6; Figura 2D), che potrebbe essere associato con uno spread di Ca2 + segnale dalla zona dell'iniziazione e/o differenti meccanismi postsinaptici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56776/56776fig1.jpg"> Figura 1: Esempio rappresentativo di transitori di AP-evocato Ca2 + . (A) massima proiezione di una due-fotone Z-pila (13 µm) di un interneurone patchato riempito con Alexa-594 (20 µM). Linee bianche indicano la posizione e la lunghezza delle scansioni. (B) tracce mostrando i gatti hanno suscitati nei punti indicati in traccia di A. Top Mostra il treno di AP breve generato attraverso l'iniezione di corrente somatica durante la registrazione di prova. Scala temporale è la stessa su tutte le tracce mostrate. (C) massimo proiezione di confocal Z-stack mostrando l'etichettatura biocitina della cella. O/a: Oriens/Alveus; PYR: Stratum Pyramidale; RAD: Strato radiato. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56776/56776fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56776/56776fig2.jpg"> Figura 2: Postsinaptica Ca2 + transitori evocate da una raffica di stimolazione elettrica (3 stimoli a 100 Hz). (A) massima proiezione di una due-fotone Z-stack (148 µm) mostrando un interneurone patchato riempito con Alexa-594. Punte di freccia bianche punti al percorso di axonal terminali all'interno dello strato piramidale, suggerendo che l'interneurone è una cella di cestino. (B) singolo piano focale che illustrano il ramo dendritico dove è stato posizionato l'elettrodo di stimolazione. Linea tratteggiata indica la posizione di linescan mostrato in (C1 e C2). (C) immagini che illustrano il risultato di un linescan in rosso (1; Alexa-594; 20 µM) e verde (2; Oregon verde Bapta-5N; Canali di 300 µM). Le immagini sono state cestinate in segmenti più piccoli per analizzare la diffusione della risposta oltre 30 µm. (D) tracce risultati transitori Ca2 + (gatti) suscitate nei segmenti visualizzati in C2. Traccia superiore mostra la risposta in tensione alla stimolazione elettrica registrata a livello somatico durante il processo di imaging. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56776/56776fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soluzione</td>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentrazione (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACSF-normale</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>124</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucosio</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACSF-recupero</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>124</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucosio</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">ACSF-saccarosio</td>
			<td>KCl</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucosio</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Saccarosio</td>
			<td>219</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="9">K+-Patch soluzione basata su</td>
			<td>K+- gluconato</td>
			<td>130</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sale di (tris) phosphocreatin</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP-Tris</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>GTP-Tris</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biocitina</td>
			<td>72</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa-594</td>
			<td>0,02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oregon Green-BAPTA-1</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: ricette soluzione. Composti e le concentrazioni per soluzioni utilizzate durante il protocollo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema</td>
			<td>Soluzione</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grado di patch neurone sano</td>
			<td>Controllo per i segni che le fette sono malsane: rimpicciolito o gonfiore delle cellule, i nuclei visibili, ecc. In questo caso, eliminare le fette. Inoltre di verificare la resistenza di patch-pipetta e osmolarità della soluzione patch; sostituirli se i valori non sono nell'intervallo appropriato.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Segnale di fluorescenza da dendriti è basso</td>
			<td>Aspettare a lungo per la cella riempire. Se un ostacolo è mantenendo la patch-soluzione da diffondere nella cellula, tenta di applicare una piccola quantità di pressione negativa in patch-pipetta.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stimolazione elettrica non è che evoca una risposta di Ca2 +</td>
			<td>Verificare la presenza di un manufatto nella registrazione elettrofisiologica. Se assente, Cerca un corto-circuito/stimolando malfunzionamento unità. Se presenti, aumentare l'intensità di stimolazione o spostare la pipetta di stimolazione più vicino dendrite. Deve essere notato che la distanza tra l'elettrodo di stimolazione e il dendrite non deve superare 8 um per impedire la depolarizzazione diretta dei dendrites quando studiare risposte sinaptiche.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Evocati Ca2 + segnale è troppo alto/satura il Ca2 + indicatore</td>
			<td>Ridurre la potenza del laser. Se il problema persiste in più celle, utilizzare un indicatore diverso del Ca2 +, con una minore affinità del Ca2 +.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Segnale Ca2 + basale sta gradualmente aumentando durante l'esperimento</td>
			<td>Attendere un periodo più lungo tra scansioni individuali. Se la previsione è ancora in aumento, interrompere acquisizione; indica che la salute della cellula probabilmente sta declinando.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ampiezza del Ca2 + segnale diminuisce durante le scansioni</td>
			<td>Ridurre la potenza del laser o zoom out (se applicabile).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dendrite è la frammentazione ("blebbing") dopo la scansione</td>
			<td>Ridurre la potenza del laser o eseguire lo zoom indietro. Se blebbing è limitato a dendrite mirato, scegliere un altro dendrite e ridurre la potenza del laser / zoom indietro. Se più dendriti blebbing, smettere di acquisizione.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Segnali di fluorescenza sono "drifting" fuori dalla linea di scansione dopo spazza</td>
			<td>Movimento nella fetta riducendo la velocità di perfusione ACSF. Prima patch, fare sono sicuro che la fetta è fortemente fissata mediante una rete.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: risoluzione dei problemi tabella. Soluzioni ai problemi più comuni che possono sorgere durante un Ca2 + esperimento di imaging.

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Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Views.  Université Laval. Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Video: Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Ricerca

Neuroscienze

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biologia

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Calcio Imaging funzionale nello sviluppo di reti corticali

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Comportamento

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Calcium Imaging in Neurons

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and neurotransmitter release from synaptic vesicles. Within the cell, calcium concentration is highly dynamic due to the presence of pumps that selectively transport these ions in response to a variety of signals. Calcium imaging takes advantage of intracellular calcium flux to directly visualize calcium signaling in living neurons.This video begins with an overview of the key reagents used for this technique, known as calcium indicator dyes. The discussion includes an introduction to the commonly used dye Fura-2 and some basic principles behind how both ratiometric and non-ratiometric calcium indicators work. Next, a typical calcium imaging experiment is presented, from preparing the cells and dye to capturing and analyzing the fluorescent images. Finally, several experimental applications of calcium imaging are provided, such as the study of neuronal network activity and sensory processing.

Calcium Imaging in Neurons Using Fura-2

Imaging del calcio nei neuroni

Calcium ions play an integral role in neuron function: They act as intracellular signals that can elicit responses such as altered gene expression and ...