This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).

Il protocollo per l&#39;ottenimento di tessuti umani scartati da pazienti chirurgici e la creazione di colture primarie è stato approvato dalla University of Texas Medical Branch e University of New Mexico revisione istituzionale Boards. I requisiti generali per l&#39;approvvigionamento di campioni di tessuto umano è descritto di seguito. Si noti che, poiché MF può essere isolato da tessuti congelati, le biobanche e fornitori commerciali sono anche opzioni praticabili. 1. Ottenere Human Tissue <ol><li> Invia un protocollo per ottenere dei tessuti del colon umano al comitato istituzionale di revisione per l&#39;approvazione. </li><li> Stabilire collaborazioni con chirurghi generali e / o chirurghi colorettali al fine di ottenere tessuti umani per la ricerca. La collaborazione con il reparto di patologia è obbligatoria anche in quanto saranno determinare il tessuto che non è richiesto per la diagnosi e può essere designato per la ricerca. </li><li> Informare il patologo di fornire il tessuto dalla neoplasia e poi grossly mucosa normale di almeno 5 cm dal tumore. Porre immediatamente i campioni nei media lavaggio gelide e disporli sul ghiaccio. Il patologo determina la quantità di tessuto che può essere dato in modo sicuro per la ricerca. Il tessuto minimo richiesto per l&#39;isolamento MF è di 1,5 mm 2. </li><li> Utilizzare il tessuto ottenuto o immediatamente per stabilire le colture primarie o congelamento e posto a -80 ° C per l&#39;isolamento futuro. <ol><li> Se il congelamento per l&#39;isolamento più tardi, tagliate il tessuto in circa 1-2 mm 2 pezzi, mettere in un tubo criogenico con 1 ml di mezzi di congelamento (vedi sotto), e conservare a -80 ° C. Nota: Utilizzando questo protocollo, è stato osservato con successo l&#39;isolamento di MF da tessuto congelato per oltre 4 anni. </li></ol></li></ol> 2. Preparare Reagenti <ol><li> Per la soluzione Collagenase: Preparare 100 U / ml di collagenasi I, II e IV, in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con Ca2 + / Mg 2+ (vedi Tabella Materiali </strong&gt;). ATTENZIONE: collagenasi concentrazione unità attiva e purezza può varia da produttore a produttore, che possono ostacolare l&#39;efficienza della digestione tessuti e / o conservazione dell&#39;epitopo sulla superficie delle cellule della mucosa. Per evitare questi potenziali insidie, utilizzare collagenasi con più alto grado di purezza (≥95%) e preparare la soluzione madre basata sulla concentrazione unità attiva. </li><li> Preparare la soluzione di DNasi magazzino a base di acqua a 10 mg / ml (3.55 UA / mg). </li><li> Preparare lavaggio mezzi: (MEM: 89 ml, antibiotici contro funghi, 100x: 1 ml; FCS inattivato al calore: 10 ml) </li><li> Preparare Fibroblast crescita dei media: MEM: flacone da 500 ml; L-glutammina (200 mM): 5 ml; MEM non essenziali aminoacidi, 100x soluzione: 5 ml; ciprofloxacina HCl (10 mg / ml): 570 ml; Antibiotico-Antimicotici soluzione 100x: 10 ml; piruvato di sodio (100 mM): 5 ml; FCS inattivato al calore: 50 ml </li><li> Preparare supporti Fermo: i media di crescita dei fibroblasti (reagente 2.4) con l&#39;aggiunta del 10% di dimetilsolfossido (DMSO), poi filtrare-sterilize con un filtro di 0,22 micron. </li></ol> Tissue 3. enzimaticamente Digest umana <ol><li> Se il tessuto è stato congelato nei media congelare, posto esageratamente a (~ 37 ° C) acqua calda fino a quando viene scongelato dei tessuti e dei media. </li><li> Per 4-5 di 2 mm 2 pezzi di tessuto, lavare il tessuto due volte con 10 ml di HBSS senza Ca 2 + / Mg 2+. </li><li> Una volta che il tessuto è stabilito per gravità, eliminare accuratamente il surnatante, senza girare campione. </li><li> Aggiungere 10 ml della soluzione di collagenasi al campione e trasferire la miscela di tessuto in una soluzione sterile tubo DNasi / RNasi-free con incorporato rotori per campione dissociazione. Utilizzare collagenasi dissociare la matrice extracellulare che circonda l&#39;aspetto basale delle cellule epiteliali e costituisce la frazione non cellulare della propria mucosa lamina. </li><li> Chiudere bene il tubo e collegarlo a testa in giù sul manicotto del dissociatore (ad esempio, gentleMACS). Se il laboratorio non ha l&#39;accesso a tegli summenzionato attrezzature, aumentare il tempo di ciascuna fase di digestione per ottenere risultati comparabili. </li><li> Eseguire il h_tumor_01 Programma, un profilo preimpostato in dotazione con la macchina (durata complessiva di 36 secondi, con impulsi intermittenti che vanno da 1.000 - 4.000 giri, con 268 colpi per corsa). </li><li> Dopo la cessazione del programma, staccare il tubo dal dissociatore. </li><li> Incubare campione per 45 min a 37 ° C in rotazione continua su agitatore a 140 rpm. Nota: Per le diverse quantità di campioni di tessuto, il tempo di digestione può essere proporzionalmente ridotto o aumentato (ad esempio, grandi quantità di tessuto possono richiedere tempo supplementare). </li><li> Collegare il tubo a testa in giù sul manicotto del dissociatore. </li><li> Scegliere ed eseguire il programma h_tumor_02 (durata complessiva di 37 secondi, con impulsi intermittenti che vanno da 1.000 - 4.000 giri, con 235 colpi per corsa). </li><li> Dopo la cessazione del programma, staccare il tubo dal dissociatore. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione madre DNasi. Utilizzare DNAse dissociare / rimuovere le cellule morte e la frazione di DNA di detriti cellulari che porta alla cella aggregazione. </li><li> Incubare campione per 30 min a 37 ° C in rotazione continua su agitatore a 60 rpm. </li><li> Collegare il tubo a testa in giù sul manicotto del dissociatore di nuovo. </li><li> Scegliere ed eseguire il programma h_tumor_03 (durata complessiva di 37 secondi, con impulsi intermittenti che vanno da 1.000 - 4.000 giri, con 168 colpi per corsa). Nota: Se il tessuto non è completamente digerito, centrifugare a 250 xg per 10 min a 20 ° C, scartare il surnatante, risospendere in 2 ml di soluzione di dissociazione cellulare e incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso sterile 70 micron colino cella. </li><li> Sospensione cellulare Centrifugare a 250 xg per 10 min a 20 ° C. Aspirare il surnatante completamente. </li><li> Lavare pellet di cellule due volte con 25 ml di HBSS senza Ca 2 + / Mg 2+ e scartare il surnatante. </li><li> Prima dell&#39;ultima erah, contare il numero di cellule utilizzando un sistema di conteggio delle cellule automatizzato disponibile in laboratorio o manualmente utilizzando emocitometro. Per MF generazione coltura primaria proseguire per passo 3.19.1, per l&#39;analisi o l&#39;ordinamento di MF in citometria a flusso proseguire per passo 3.19.2. <ol><li> Per l&#39;isolamento e la crescita della coltura pura MF (Figura 1), scartare il surnatante da ultima centrifugazione, il pellet cellulare risospendere in quantità appropriata di terreni di isolamento fibroblasti necessaria per seminare fino a 4 x 10 6 cellule in 3 ml di media per pozzetto in 6 piatti ben, coltura cellulare trattati. Passare al punto 3.20. </li><li> Per l&#39;analisi o l&#39;ordinamento di MF in citometria a flusso, collocare fino a 2 x 10 6 a 2 ml di terreni di isolamento dei fibroblasti in 24 bene, piatto a basso legame e incubare O / N a 37 ° C con 5% di CO 2. Questo è quello di ripristinare le epitopi di superficie delle cellule che potrebbero essere interessati dalla procedura enzimatica. Poi raccogliere sospensione cellulare e contare le cellule recuperate e procedereper la immunocolorazione e citometria a flusso di analisi 8. </li></ol></li><li> Crescere le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2. Modificare i media ogni 2 - 3 giorni fino alla formazione del ~ 80% confluenti MF monostrato (Figura 1D-E). </li><li> Cellule Passage in fusti T25 con da 6 pozzetti in rapporto 1: 1 e crescere per circa 10 - 14 giorni nei media di crescita dei fibroblasti per raggiungere 80-100% di confluenza. </li><li> Espandere cultura, passaging cellule da T25 a cellule T75 in rapporto 1: 2. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, usare un pallone per l&#39;analisi di isolati purezza MF usando da citofluorimetria come descritto in precedenza 5. Congelare o di passaggio un altro pallone T75 della cultura MF in rapporto 1: 3. Nota: Quando analizzate mediante citometria di flusso, si prevede che la mucosa GI stromale MF di origine mesenchimale quando cresce nella cultura avrà seguente fenotipo: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentina +, α-SMA +, CD90 +. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Mentre questo protocollo è stato sviluppato per l&#39;applicazione solo ricerca, alla luce della crescente importanza critica di cellule stromali come un cancro potenziali biomarker prognostici e obiettivo terapeutico, la capacità di congelare campioni biologici &quot;funzionali&quot; per un uso successivo offre un vantaggio significativo. Questo rappresenta un vantaggio unico per la creazione di biorepository clinica, che può servire come strumenti aggiuntivi che servono per promuovere lo sviluppo della medicina personalizzata 10, 11. Simile a risultati precedentemente riportati per cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo isolati da stromale congelato frazione vascolare, abbiamo fatto non osservate tutte le modifiche significative dei marcatori e le risposte proliferative / immunitarie / infiammatorie e attività metabolica di MF isolati da campioni di mucosa congelati. 12 Tuttavia, non escludiamo che alcune delle risposte non testato, come extracellulare marcatore deposizione, ecc possono variare . Pertanto, nei casi di lavoro con sconosciuti / UNIREeventi portati, gli investigatori possono costituire un esperimento di confronto in cui la particolare funzione sarà testata side-by-side in MFs isolato dal tessuto congelato e fresco dello stesso individuo. La maggior parte delle tecniche di metodi di isolamento miofibroblasti si basano sia sull&#39;impiego di macinazione meccanica del tessuto in combinazione con il trattamento sia con agenti chelanti [acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), DL-ditiotreitolo (DTT)] o collagenolitica e proteolitici enzimi 13-14 . È stato precedentemente riportato che generazione di MF dallo stomaco, dell&#39;intestino tenue e del colon era efficiente utilizzando il metodo conseguenza inizialmente descritto da Mahida et al, che si basa sulla macinazione meccanica e l&#39;applicazione degli agenti chelanti 5, 6. Qui, un enzimatica ulteriore È stato riferito metodo che consente la generazione di colture primarie di MFS da campioni di tessuto congelato. Mentre sia tecniche di escrescenza e digestione enzimatica, sonougualmente efficaci nell&#39;isolamento di miofibroblasti primari da gastrica, piccolo intestino, e dei tessuti del colon, c&#39;è ancora dibattito all&#39;interno della comunità scientifica sul fatto cellule in coltura conservano il loro fenotipo in vivo. La tecnica riportata in questo manoscritto permette non solo la generazione di cultura MF primario, ma permette anche ex vivo analisi di diverse popolazioni cellulari presentati nella mucosa GI 15-17. In particolare, occorre loro relativa abbondanza con il tessuto e gli indicatori che esprimono, ma anche per l&#39;uso in saggi funzionali (ad esempio, l&#39;attività enzimatica o produzione di citochine). Abbondanza relativa di MF all&#39;interno del tessuto può essere valutato utilizzando FACS di classificare le cellule basate su indicatori unici a MF (vale a dire, EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentina +, α-SMA +, CD90 +) e quantificare la loro presenza rispetto ad un totale di tutte le cellule appena isolate o, se necessario, facendo rapporto comparativo con tipi cellulari distinti. Nonostante l&#39;efficaciadi isolamento di cellule vitali, una limitazione notevole di questo e altri protocolli basati sulla digestione enzimatica è che l&#39;attività proteolitica di enzima impiegato può alterare epitopi superficie cellulare. Per ovviare a questo, permettiamo alle cellule di recuperare O / N in modo che epitopi di essere ri-espresso in modo simile al loro stato predigerito. Siamo stati in grado di generare in modo coerente cultura MF da tessuto congelato con una minima perdita di vitalità cellulare. La capacità di recuperare queste culture da campione congelato permette ai ricercatori di manipolare e meglio preservare campioni chirurgici e / o endoscopici di tessuto ottenuti durante la notte o fuori regolari ore lavorative. Inoltre, la diminuzione delle perdite di procurato, tessuti utilizzabili a causa dei contaminanti batterici e / o fungine durante il processo di congelamento costituisce un ulteriore vantaggio. Dopo aver isolato, l&#39;uso di antibiotici dovrebbe essere limitato solo ai primi 2 - 3 passaggi, dopo la quale la coltura deve continuare a utilizzare standard di tecnica asetticac tecnica e antimicotica / media-free agente anti-micoplasma. L&#39;uso routinario di questi agenti in coltura cellulare ha dimostrato di esercitare effetti citotossici, vale a dire la crescita delle cellule, degenerazione cellulare, e in occasione, di morte 18. Digestione enzimatica produrrà più popolazioni cellulari presenti nella propria GI lamina includendo: cellule immunitarie, le cellule epiteliali, e MF. Dopo il primo passaggio, solo MF rimarrà e può essere identificato dal loro fenotipo unico (figura 1), nonché attraverso pannello specifico-cellula di analisi marcatore (CD90, a-SMA e vimentina positivo, ma negativo epiteliale e ematopoietiche marcatori) 3, 5, 9. Mentre è ampiamente accettato che i miofibroblasti derivano da cellule staminali mesenchimali nell&#39;ospite normale, negli stati di malattia come l&#39;infiammazione cronica e il cancro, una sottopopolazione di MF è stato dimostrato epiteliale espressa o marcatori ematopoietiche 3. Questi risultati sono stati suggeriti per essere possibilmentea seguito della transizione epitelio-mesenchimale (EMT), o l&#39;assunzione di fibrociti derivati ​​dalla stirpe ematopoietiche 3, 19. Inoltre, ulteriore cautela dovrebbe essere usata se le cellule sono immunostained e analizzati mediante citometria di flusso per i marcatori di cui sopra. Mentre non abbiamo trovato la perdita epitopo ad essere un problema dopo permettendo alle cellule di recuperare O / N dal tessuto fresco digerito incubate in piastre non aderenti, la perdita di epitopi può si verifica quando si utilizza tripsina o qualsiasi altro enzima proteolitico durante il distacco cellule dalla piastra. Così, per evitare questo problema, si consiglia di utilizzare una soluzione di dissociazione cella con agenti chelanti quali EDTA quando culture MF aderenti siano destinate alla immunocolorazione seguita da analisi di citometria a flusso. Dopo aver stabilito una coltura primaria di miofibroblasti, le cellule possono essere congelate in mezzi congelamento e conservati in azoto liquido. Queste cellule possono essere utilizzati in una serie di esperimenti in vitro fino a circa 14 - 15passaggi, dopo di che le cellule senesce e devono essere eliminati.

Miofibroblasti / fibroblasti (MFS) rappresentano una popolazione abbondante di cellule gastrointestinali (GI) mucosa. Queste cellule stromali si trovano appena sotto l&#39;epitelio e formano una rete interconnessa all&#39;interno della mucosa lamina propria nell&#39;intestino. MF non sono responsabili solo per la deposizione della matrice extracellulare, ma attraverso la regolamentazione paracrina possono influenzare il trasporto di elettroliti, la restituzione, e la funzione di barriera dell&#39;epitelio adiacente 1, 2. Inoltre, MF hanno dimostrato di svolgere un ruolo chiave nel processo infiammatorio e tessuti rimodellamento 3, 4. miofibroblasti sono una parte critica del microambiente tumorale, dove sono conosciuti anche come i fibroblasti associati al cancro, e contribuire alla crescita delle cellule tumorali e servire come una nicchia per le cellule staminali del cancro 3. Dati emergenti suggeriscono che MF può anche servire le cellule presentanti l&#39;antigene come locali. Inoltre, la funzione MF come importanti regolatori della risposta immunitaria innata e adattativa, prcing una varietà di citochine e fattori di crescita 5. Negli individui sani, le cellule MFS si ritiene da differenziare da cellule staminali mesenchimali ed esprimere sulla loro superficie delle cellule, il marcatore mesenchimale, CD90 3, 5. Queste cellule sono anche positivi per vimentina, ma negativo per epiteliali e marker delle cellule ematopoietiche, EpCAM e CD45 rispettivamente. Miofibroblasti sono suggeriti per essere una forma attiva di fibroblasti e possono essere distinti dai fibroblasti non attivati ​​mediante l&#39;espressione di α-SMA 5. Negli ultimi dieci anni, più approcci per l&#39;isolamento di miofibroblasti dalla mucosa del colon umani sono stati pubblicati per lo più basato sul metodo originariamente descritto da Mahida et al. 5-8. Mentre i singoli studi riportano procedure di isolamento di varie mucosa intestinale, nessun protocollo universale per l&#39;isolamento di MF da più zone del tratto gastrointestinale (ad esempio, gastrico, piccolo e large mucosa intestinale) è stato pubblicato. Il protocollo qui presentata è stato testato ed usato con successo per tutti e tre tipo di tessuto sopra menzionato. . Inoltre, non sono stati segnalati procedure per isolare MFs da mucosa GI congelati. Qui, vi presentiamo un metodo ottimizzato, che si basa sulla digestione enzimatica, e permette contemporaneamente per l&#39;isolamento di mucosa dell&#39;intestino umano MF per la cultura e citometria a flusso analisi appena digerito, singola cella, i preparativi della mucosa. Questa tecnica produce in modo affidabile colture primarie con un fenotipo MF. Inoltre, gli stessi metodi possono essere utilizzati per isolare MFs da campioni congelati di tessuti intestinali gastriche e piccoli pure. Isolamento di miofibroblasti da tessuto fresco GI è stata precedentemente descritta; tuttavia, l&#39;utilizzo di campioni congelati presenta molti vantaggi. Vale a dire, i ricercatori saranno in grado di raccogliere e conservare i tessuti da un qualsiasi numero di collaboratori in tutto il mondo che hanno il capabilità per spedire campioni di tessuto congelato. Inoltre, i ricercatori potrebbero trovare la collezione di tessuti scartati dalla sala operatoria e / o suite endoscopia e immediata elaborazione del tessuto per l&#39;isolamento di conflitto con il loro programma di sperimentazione in corso. Inoltre, a causa della natura imprevedibile di un intervento chirurgico, di approvvigionamento dei tessuti può verificarsi molto tardi nel corso della giornata, che limiterà il tempo rimasto per il tessuto lavorazione. Congelamento dei tessuti per successive elaborazioni si migliorare queste sfide. Infine, questi metodi sono stati utilizzati con successo nell&#39;isolamento di colon, gastrici e piccole miofibroblasti intestinali in stati di malattia come il carcinoma colorettale e malattie infiammatorie intestinali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="719">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">MEM, 1X</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT-10-010-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ciprofloxacin HCl</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">61-277-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">L-Glutamine, 100x</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DL-Dithiothreitol solution (DTT)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:111px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DNAse</td>
			<td style="width:111px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum, Type I</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum, Type II</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Accumax cell dissociation solution</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">gentleMACS C Tubes</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">gentleMACS Dissociator</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Cell Strainer (70&#181;m)</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PE Mouse Anti-Human Vimentin</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">562337</td>
			<td>Clone RV202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">FITC Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F3777</td>
			<td>Clone 1A4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">APC Mouse Anti-Human CD90</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">559869</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd 90+ fibroblast/myofibroblasts from human frozen gastrointestinal specimens

Fibroblasti / miofibroblasti (MFS) stanno guadagnando sempre maggiore attenzione per il loro ruolo nella patogenesi e il loro contributo sia per la guarigione della ferita e la promozione del microambiente tumorale. Mentre ci sono attualmente molte tecniche per l&#39;isolamento di MF da gastrointestinali (GI) tessuti, questo protocollo introduce un elemento nuovo di isolamento di queste cellule stromali di tessuti congelati. Congelamento campioni di tessuto GI non solo permette al ricercatore di acquisire campioni di collaboratori in tutto il mondo, le biobanche e fornitori commerciali, permette anche il trattamento ritardato dei campioni freschi. Il protocollo descritto sarà costantemente produrrà caratteristici cellule fusiformi con il fenotipo MF che esprimono i marcatori CD90, α-SMA e vimentina. Poiché queste cellule sono derivate da campioni di pazienti, l&#39;uso di cellule primarie conferisce anche il vantaggio di MF mimando da stati, cioè il cancro e malattie infiammatorie intestinali malattie. Questa tecnica ha apen convalidato gastrico, piccolo intestino, colon e MF generazione coltura principale. Colture primarie MF possono essere utilizzati in una vasta gamma di esperimenti su un numero di passaggio e la loro purezza valutate sia immunocitochimica e analisi citofluorimetrica.

Usando questo protocollo digestione enzimatica, abbiamo sempre stati in grado di isolare e far crescere CD90 + cellule stromali della mucosa intestinale MF popolazione da GI campioni chirurgici e biopsie (Figura 1). Visibile MF colonia proliferazione potrebbe essere osservato il giorno 2-5 dopo la semina di cellule mononucleate sospensioni in 6 pozzetti (Figura 1A-B). Le colture primarie MF raggiungono ~ 50 - 70% confluenza di giorno 7 - 11 (Figura 1C-D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53691/53691fig1.jpg" /> Figura 1. I miofibroblasti primari (MFS) isolato da congelata gastrointestinale tessuto. Un ingrandimento 20X di MF umana isolata da campioni congelati di mucosa del colon umano. (A) Giorno 2. gruppi aderenti di cellule stromali sono presenti. (B) Giorni 4. Il spindle- caratteristica o stellate-morfologia cellulare ha sviluppato ed è evidente. La densità di fibroblasti continuano ad aumentare su (C) 7 ° giorno e (D) Giorno 10. (E) By Day 14, vi è un monostrato completamente confluente di MF. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53691/53691fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> C&#39;è una leggera diminuzione nella vitalità della mucosa preparazione singola cella sul congelamento dei campioni chirurgici (~ 10%, tabella 1). Tuttavia, con il congelamento, vi è anche una diminuzione nella contaminazione fungina / batterica del tessuto osservata e di conseguenza, un aumento dell&#39;efficienza della generazione coltura MF. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698"><tbody><tr><td> Fonte di GI mucose miofibroblasti </td><td> Viabilità * di mucosa singola sospensione cellulare Preparazione (n = 11) &lt;/ td&gt; <td> MF Isolamento Efficienza (n = 11) </td></tr><tr><td> Fresco </td><td> 88.32 ± 2.369 </td><td> 8 su 11 (82%) </td></tr><tr><td> Congelato </td><td> 78.64 ± 4.174 </td><td> 11 su 11 (100%) </td></tr><tr height="20"><td colspan="3" height="20" style="height:20px;"> * Viabilità come determinato dal contatore automatico cella seguente 0,4% trypan soluzione colorazione blu. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. vitalità e l&#39;efficienza di miofibroblasti Recovery. Fresco contro congelati tessuti. La purezza della cultura MF generato è stato analizzato dopo le cellule sono state propagate per almeno due passaggi, per garantire che nessuna contaminazione da altre cellule mucose. Usando la microscopia confocale, è stato dimostrato che MF sono risultati positivi per il marcatore del CD90 delle cellule mesenchimali e lignaggio vimentina, e also α-SMA, un marcatore delle cellule mesenchimali differenziate (Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53691/53691fig2.jpg" /> Figura 2. Isolato cellule hanno Forma fibroblasti ed Express MF marcatori. Immunostaining di isolato MF monostrato, diversi passaggi almeno due volte in coltura sono stati fissati con 1% paraformaldeide, immunostained e analizzate al microscopio confocale come descritto in precedenza 9. Cellule isolate espresso un marker di miofibroblasti, un-SMA (in verde, come rilevato da murino monoclonale clone 1A4), e marcatori mesenchimali: vimentina (in rosso, come rilevato da anticorpo monoclonale, clone RV202) e CD90 (in blu, come rilevato da murino mAb, clone 5E10). Nell&#39;immagine risultante dalla fusione, arancione / giallo rappresentano le cellule co-localizzazione di un-SMA e vimentina; viola rappresenta co-localizzazione di vimentina e CD90. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53691/53691fig2large.jpg" target="_blank">Motivi</a><html> e clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Questo dato è stato confermato da analisi citofluorimetrica (Figura 3). Come riportato in precedenza, MF normali isolati da GI mucosa anche sono risultati negativi per i produttori ematopoietiche CD45 e CD31, così come marcatore epiteliale, EpCAM 3, 5, 9. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53691/53691fig3.jpg" /> Figura 3. Caratterizzazione fenotipica di primaria miofibroblasti (MF) Culture. Stati condotti studi sul MF primari isolati da mucosa del colon e diversi passaggi, almeno due volte nella cultura. Immunostaining, seguita dalla citometria a flusso di analisi, ha confermato che le cellule isolate hanno MF fenotipo sono uniformemente positivi per vimentina, α-SMA, e CD90. Appropriati controlli isotipici sono stati inclusi nello studio.arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Isolamento di CD 90+ fibroblasti / miofibroblasti da umani congelati gastrointestinali campioni


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

isolation-cd-90-fibroblastmyofibroblasts-from-human-frozen

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Views.  University of Texas Medical Branch. Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production. 

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Istituzione di Genome-cura pluripotenti umane Linee di cellule staminali: Da Targeting per isolamento

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolamento e l&#39;espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

Isolamento di perivascolare Multipotent precursori delle cellule popolazioni dal cardiache umane Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

L'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...