The authors thank Sanjiv Luther and colleagues for helpful discussions in establishing the current lymph node digestion protocol. This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R.

In questa pubblicazione video e protocollo, sono state effettuate tutte le procedure sugli animali conformemente al protocollo animali approvato dalla Autorità cantonale di Basilea Città, Svizzera. 1 Linfonodi Preparazione e digestione <ol><li> Acqua preriscaldo in un becher da 37 ° C su un agitatore magnetico con piastra di riscaldamento. </li><li> Preparare Base Medio come segue: terreno DMEM (senza piruvato) supplementato con FCS 2%, 1,2 mM CaCl 2 e Pen / Strep (100 unità di penicillina, 100 mg di streptomicina). </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione prima dell&#39;uso. </li><li> Euthanize topi linfonodale donatori per CO 2 asfissia e asettico sezionare i linfonodi. Non sezionare il grasso circostante. NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per il nodo periferico-pelle drenante linfatico (inguinale, brachiale, ascellare). </li><li> Mettere i linfonodi in una capsula di Petri sterile contenente 2 ml di ghiaccio freddo ambiente basico. </li><li> Interrompere il linfonodo capsule utilizzando due aghi 25 G fissi sulla siringa da 1 ml. </li><li> Trasferire il tessuto linfonodale interrotto in 5 ml in polipropilene tubo a fondo rotondo contenente 750 ml terreno base integrato con 1 mg / ml di collagenasi IV e 40 mcg / ml I. DNAse </li><li> Aggiungere un agitatore magnetico sterile in ciascuna provetta. </li><li> Inserire il tubo nel bicchiere con 37 ° C preriscaldato acqua e mescolare i tubi a bassa velocità (1 round / sec) per 30 min. </li><li> Rimuovere il tubo dalla agitatore magnetico con piastra di riscaldamento e lasciare frammenti linfonodali stabilirsi. </li><li> Rimuovere con cautela il surnatante arricchito in &quot;cella non stromali&quot;. NOTA: Se l&#39;analisi di T, B, cellule dendritiche e CD45 - gp38 - CD31 - è previsto, salva la frazione &quot;cellule non-stromali&quot;. </li><li> Lavare restante tessuto linfonodale una volta con 750 microlitri di media di base. NOTA: Questo passaggio è necessario solo se si lavora con i topi immuno-competenti. </li><li> Lasciate frammenti linfonodali stabilirsi. </li><li> Rimuovere ilfrazione di cellule-floating non-stromale. </li><li> Aggiungi ai frammenti linfonodali 750 microlitri terreno base integrata con 3,5 mg / ml Collagenase D e 40 mcg / ml DNasi I. </li><li> Collocare il tubo indietro nel bicchiere contenente la 37 ° C preriscaldato acqua. </li><li> Digest nodo tessuto linfatico per 5 minuti mentre lentamente mescolando. </li><li> Disaggregare linfatici frammenti di tessuto nodo di pipettaggio e mescolando 700 ml per 10 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata. NOTA: Questo sconvolge nodo tessuto linfatico per migliorare la digestione. </li><li> Posizionare il tubo di nuovo nel bicchiere con 37 ° C acqua preriscaldata. </li><li> Digest frammenti di tessuto linfonodale per altri 10 min, mescolando lentamente. </li><li> Disaggregare linfatici frammenti di tessuto nodo pipettando e miscelazione per 99 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata. </li><li> Aggiungere 7,5 ml di 0,5 M EDTA per assicurare il mantenimento della sospensione singola cellula. </li><li> Frammenti di tessuto linfonodale disaggregare per tubotting e miscelazione per 99 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata. </li><li> Aggiungere 750 microlitri di media di base e passare le cellule attraverso una maglia di nylon di 70 micron. </li><li> Sospensione cellulare Centrifugare 5 min a 1.500 xg, a 4 ° C. </li><li> Cellule stromali possono ora essere utilizzati per ulteriori analisi. </li></ol> 2. colorazione di cellule stromali Linfonodo <ol><li> Utilizzare una combinazione di anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anticorpi anti-CD31 per riconoscere con successo le cellule TRC, LEC, BEC e DN. </li><li> Incubare il tessuto linfonodale digerito con Live / inseguitore Morto, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) in 100 microlitri HBSS contenente 2 % FCS per almeno 20 min, 4 ° C, al buio. </li><li> Lavare le cellule aggiungendo 500 l di HBSS contenente 2% FCS </li><li> Sospensione cellulare Centrifugare 3 min a 1500 xg, a 4 ° C. </li><li> Risospendere in 100 ml di HBSS contenente 2% FCS. </li><li> Eseguire le cellule colorate in un citofluorimetro equipped con le seguenti ottiche: fonte di eccitazione fino a tre laser: blu (488 nm, raffreddato ad aria, 20 mW a stato solido), rosso (633 nm, 17 mW HeNe), e viola (405 nm, 30 mW a stato solido) . </li><li> Porta CD45 - cellule di escludere le cellule ematopoietiche. </li><li> Canottiere Cancello (FSC-W) e le cellule vive (live / inseguitore DEAD) per escludere doppietti e cellule morte. </li><li> Trama gp38 vs CD31 per visualizzare TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) cellule (vedi Figura 1) e DN (gp38 - - CD31). </li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interests.

Lo studio delle cellule stromali linfonodali recentemente è diventato un focus di ricerca a causa dello sviluppo di due protocolli di digestione pubblicati 6,13. Entrambi i protocolli sono adeguate per ottenere cellule stromali nodo singolo linfatici ma differiscono per l&#39;uso di enzimi digestivi e il tempo di digestione. Poiché le cellule stromali e loro marcatori di superficie sono sensibili alla digestione enzimatica e sollecitazioni meccaniche, è necessario un protocollo ottimizzato. L&#39;isolamento delle cellule stromali linfonodo vitali dalle linfonodo appena sezionato è il primo passo per eseguire analisi fenotipica e funzionale. Pertanto, è importante digerire accuratamente con la concentrazione definita di enzimi, ad una temperatura stabile e per il tempo indicato. Sono stati descritti due protocolli di digestione 6,13, ma con mineralizzazione piuttosto lunghi. Per ridurre il tempo di digestione, disaggregazione meccanica era inclusa e standardizzato con una pipetta multicanale. Su<html> e dei vantaggi del protocollo attuale è che permette l&#39;isolamento di cellule stromali in soli 45 minuti, quindi riducendo al minimo il tempo di incubazione con gli enzimi digestivi. Inoltre, agitazione costante durante la digestione permette l&#39;accesso ottimale degli enzimi digestivi alla struttura linfonodo. Inoltre, il volume di digestione è stata ridotta a 750 microlitri al minimo la quantità di enzima impiegato. Forza meccanica eccessiva distrugge giunzioni strette ma potrebbe causare la morte cellulare allo stesso tempo. Per questo motivo abbiamo testato diverse combinazioni di cicli di ri-sospensione e diversi dispositivi di dissociazione. Abbiamo trovato che l&#39;uso di una pipetta multicanale automatizzata consente la dissociazione entro 2 applicazioni di 99 cicli; applicare una pressione costante alle cellule e questo si tradurrà in sospensione di cellule singole con redditività ottimale. Quattro a sei campioni possono essere mescolati e pipettati allo stesso tempo riducendo il tempo di linfonodo isolamento delle cellule stromali. ontent &quot;&gt; Il protocollo digestione deve mantenere l&#39;espressione di superficie di quasi tutte le molecole;. solo così la colorazione concomitante con diversi marcatori può rivelare se una popolazione è omogenea o eterogenea Ad esempio, l&#39;uso di BP-3 e CD35 nella TRC gp38 + CD31 -. consente la visualizzazione e l&#39;isolamento di midollare TRC (Sanjiv Lutero, comunicazione personale) Inoltre, la frazione poco caratterizzato DN è stato ulteriormente caratterizzato come contenente + cellule e periciti Aire come cellule positive per l&#39;integrina α7 (recensione a 7, 13). Pertanto, il presente protocollo è stato confrontato con quelli pubblicati. Come mostrato nei risultati, le frequenze e il numero di cellule stromali linfonodali simili sono stati ottenuti con il protocollo in corso rispetto a quelli pubblicati. interessante notare che, la frequenza e il numero di isolati TRC sono stati più alta utilizzando il protocollo Fletcher suggerendo una migliore dissociazione delle strutture TRC rispetto al protocollo attuale eProtocollo Link. Inoltre, l&#39;espressione di diverse molecole di superficie è stata arricchita con il protocollo corrente rispetto al protocollo Fletcher. Queste differenze nel metodo di digestione potrebbe essere il motivo per leggermente diversi pattern di espressione negli studi sulle cellule stromali linfonodali 6,19,21. Potrebbe essere utile per testare diversi protocolli di digestione a causa dei vantaggi di ogni protocollo. Il protocollo attuale potrebbe essere migliore per l&#39;analisi di espressione di superficie, mentre il protocollo Fletcher potrebbe essere utile per l&#39;isolamento di un numero elevato di cellule vitali per l&#39;analisi di trascrizione (come pubblicato in Malhotra et al. 7). Pertanto, confrontando tutti e tre i protocolli di digestione potrebbe essere importante per ottenere risultati ottimali dopo l&#39;isolamento delle cellule stromali linfonodali e dovrebbe essere visto come complementare.

I linfonodi sono compartimenti specializzati in cui vengono avviate e coordinate risposte immunitarie adattative contro stranieri e di auto-antigeni. La procedura qui presentata descrive una breve digestione enzimatica combinata con pipettaggio meccanico automatizzato per ottenere linfonodo sospensione singola cella e ottenere l&#39;accesso a linfonodali cellule stromali vitali che mantengono l&#39;espressione di superficie di diverse molecole. Formare cellule stromali linfonodale l&#39;impalcatura del linfonodo e compiere tre funzioni principali: primo filtrano fluidi corporei di assaggiare antigeni, gli agenti patogeni e il loro modello molecolare associata patogeni (PAMP), così come le citochine e pericolo del modello molecolare associato (smorza) presente nel corpo. In secondo luogo, si attraggono e istruiscono le cellule presentanti l&#39;antigene (APC) e linfociti di interagire e di avviare le risposte immunitarie adattative; e terzo, offrono un ambiente strutturale per l&#39;omeostasi e la differenziazione dei linfociti 1-3. Durante le cellule stromali infiammazione dei linfonodi producono fattori di crescita, citochine e chemochine, adattarsi al rigonfiamento in tal modo organizzare l&#39;interazione tra cellule dendritiche (DC), T, e B- cellule. L&#39;orchestrazione delle risposte immunitarie è possibile solo a causa della complessa architettura strutturale formato da diverse popolazioni di cellule stromali. Cellule stromali linfonodi sono cellule CD45 negativi e si distinguono per l&#39;espressione di CD31 o gp38 in cellule endoteliali e fibroblastiche 1 -6. Gp38 + CD31 - definisce le cellule della zona T reticolari (TRC, noto anche come FRC: cellule reticolari fibroblastiche), gp38 + CD31 + definisce cellule linfatiche endoteliali (LEC), gp38 - CD31 + definisce cellule endoteliali del sangue (BEC). Inoltre, la caratterizzazione delle sottopopolazioni ha rivelato l&#39;esistenza di altre cellule stromali linfonodali. Infatti, una piccola popolazione di cellule periciti-simile è stato caratterizzato nellagp38 - CD31 - la popolazione 7. Pertanto, l&#39;adattamento della procedura di isolamento è vantaggiosa per l&#39;identificazione e la caratterizzazione delle proprietà funzionali di varie cellule stromali linfonodali. Prima dello sviluppo del linfonodo cellule stromali digestione protocolli di studio delle cellule stromali linfonodali era limitato a osservazioni in situ utilizzando la sezione di tessuto e microscopia. Tuttavia, studi strutturali e funzionali hanno mostrato caratteristiche importanti delle cellule stromali linfonodali. Cellule stromali linfonodi sono associati con podoplanin, collagene e della matrice extracellulare (ECM) proteine ​​per formare un complesso di 3 struttura dimensionale chiamato sistema conduit, che trasporta le proteine ​​linfatiche e massa molecolare associato-basso dal seno subcapsulare di linfonodo all&#39;alta endoteliale venule nella T cellule zona 8. Dendritiche sono in stretto contatto con le cellule dello stroma e può osservare sporge nel con tubolarestruttura duit di campione di fluido e rilevare gli antigeni 8. L&#39;interazione delle cellule stromali linfonodali (TRC e LECs) con DC è mediata dal rilascio e la presentazione delle chemochine CCL21 e CCL19 9,10. CCL19 e CCL21 sono riconosciuti dal recettore CCR7 facilitare dendritiche e le cellule T di migrare al linfonodo zona di cellule T 4,11. Nonostante l&#39;uso di chemochine simili, le cellule DCs e T hanno diverse rotte migratorie verso i linfonodi 12. Successivamente, utilizzando la digestione enzimatica del linfonodo e l&#39;isolamento delle cellule stromali linfonodali puri, studi funzionali sono stati condotti sul ruolo delle diverse cellule dei linfonodi stromali e la loro capacità di interagire con le cellule dendritiche e le cellule T / B 6,13. In primo luogo, il crosstalk tra la produzione di cellule T effettrici IFN-γ e cellule stromali linfonodali induce la produzione del metabolita ossido nitrico dimostrato di smorzare le risposte delle cellule T e la proliferazione negli organi linfoidi secondari 14-16. In secondo luogo, linfa ncellule stromali ODE sono stati riportati per supportare la differenziazione delle sottopopolazioni DC regolamentazione attraverso la produzione di IL-10 17, e di modulare naif omeostasi delle cellule T attraverso la produzione di IL-7 6,18. In terzo luogo, espressione di TLR in cellule stromali linfonodali suggerisce che le cellule stromali sono suscettibili di segnale derivato da una infezione o di auto-molecole rilasciato durante lesioni dei tessuti. Infatti, il trattamento di cellule stromali linfonodali con il ligando di TLR3 poly (I: C) induce una modesta sovraregolazione di grande espressione di istocompatibilità di classe I e sovraregolazione di co-inibitorio molecola PD-L1, ma non di molecole costimolatorie, con conseguente drammatici cambiamenti nel tessuto periferico antigeni espressione 19. Diversi gruppi hanno mostrato cellule stromali linfonodali esprimono antigeni tissutali periferiche e inducono tolleranza delle cellule T autoreattive 19,21-27. Pertanto, la comprensione delle interazioni tra cellule stromali linfonodali e l&#39;altro re migratorio ecellule linfonodali sidente aiuteranno a trovare nuove molecole bersaglio per consentire l&#39;attivazione o la soppressione delle risposte immunitarie durante l&#39;infiammazione. Pertanto, è necessaria l&#39;attuazione della separazione enzimatica pubblicata del linfonodo. Protocolli precedentemente pubblicati utilizzano diverse combinazioni di base di collagenasi-digestione enzimatica con una bassa sollecitazione meccanica 6,19,20. Tuttavia, lunghe incubazioni con enzimi di digestione o la diversa combinazione di digestione enzimatica potrebbero degradare diverse molecole di superficie necessaria per analizzare lo stato di attivazione e di individuare nuove cellule stromali linfonodali. A seconda del tipo di analisi delle cellule stromali, il protocollo Link o Fletcher protocollo potrebbe essere più adatto. Nella procedura descritta, una digestione enzimatica leggermente più corto è combinato con disaggregazione meccanica automatizzata per ridurre al minimo la superficie marcatore degradazione delle cellule stromali nodo linfa vitale. Questa procedura consente di isolamento altamente riproducibile edistinzione dei linfonodi popolazioni di cellule stromali con bassa variabilità e di oltre il 95% vitalità. Le cellule stromali linfonodi isolati a fresco possono essere utilizzati direttamente per l&#39;espressione marcatore di superficie, analisi delle proteine, e gli studi trascrizionali, nonché creazione di linee di cellule stromali di effettuare saggi funzionali in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies-Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td></td><td></td><td>Final concentration 2%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>499609</td><td>Final concentration 1.2 mM</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td>&gt;160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td>use at 3.5 mg/ml</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11284932001</td><td>use at 40 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Stiring magnets</td><td>FAUST</td><td></td><td>5 mm long-2 mm &amp;oslash;</td></tr><tr><td>Polystyrene round bottom tubes 5 ml</td><td>Falcon-BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer with heating function</td><td>IKA-RCT-standard</td><td>9720250</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 100 mm, sterile</td><td>TPP</td><td>6223201</td><td></td></tr><tr><td>25 G needles</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti mouse CD45 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>anti mouse CD11c Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>anti mouse Podoplanin Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 8.1.1</td></tr><tr><td>anti mouse CD31 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone MEC13.3</td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Eppendorf Xplorer plus, Multichannel</td><td>Eppendorf</td><td>4861 000.821/830</td><td>1.250 &amp;micro;l max. volume</td></tr><tr><td>anti mouse CD140a</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone APA5</td></tr><tr><td>anti mouse CD80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 16-10A1</td></tr><tr><td>anti mouse CD40</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 1C10</td></tr><tr><td>anti mouse I-Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>anti mouse CD274 (PD-L1)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 10F.9G2</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of murine lymph node stromal cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Il presente protocollo è un protocollo di digestione modificata pubblicato da Link et al., 2007 6 con un tempo di digestione breve (45 minuti massimo) a causa di disaggregazione meccanica con una pipetta multicanale automatizzata. Inoltre, la procedura è più standardizzato, minimizza la degradazione dei marcatori di superficie su diverse cellule stromali linfonodali e permette la gestione di più di un campione allo stesso tempo. Collagenase IV e Collagenase D in Links protocollo 6 e protocollo corrente o Collagenase P e dispasi in protocollo Fletchers 13 mantengono linfonodo cellule stromali vitalità e risparmiano la digestione di alcuni marcatori di superficie, tra cui CD45, CD31 e gp38. Per testare i nodi di protocollo, ascellari, brachiale e linfonodi inguinali attuali sono stati rimossi e digeriti per isolare le cellule stromali. Analisi di CD45, gp38 e CD31 espressione dimostrato la presenza di cellule TRC, LEC, BEC e DN isolati da C57BL / 6 mghiaccio (Figura 1, strategia di gating). Lo stress meccanico potrebbe ridurre la vitalità delle cellule stromali nodo linfatiche durante la digestione. Confrontando la fattibilità di sottopopolazioni isolate di cellule stromali utilizzando i tre diversi protocolli, si è constatato che la redditività è stata superiore al 95% nel protocollo Fletcher, ma inferiore sia per il protocollo corrente e il protocollo di collegamento (Figura 2A), anche se corrente spettacolo protocollo migliore sopravvivenza nella sottopopolazione BEC poi Link Protocol. Il numero di cellule totali recuperati dopo la digestione dei linfonodi sottopopolazioni di cellule stromali è stata leggermente superiore nel protocollo attuale rispetto al protocollo di collegamento e protocollo Fletcher (Figura 2A). Questi risultati dimostrano che il protocollo attuale mantiene la vitalità delle cellule stromali linfonodali simili a protocolli pubblicati. Le principali differenze tra i tre protocolli sono elencati nella Tabella 1. Marcatori di superficie di un<html> re necessarie per caratterizzare le cellule stromali linfatiche nodo mediante citometria di flusso e di isolarli dai ordinamento delle cellule. TRC e LEC isolato via corrente, sono stati confrontati i protocolli di collegamento e Fletcher per IA b, CD140a, CD80, PD-L1 ed espressione CD40. Dopo aver isolato cellule stromali da tutti e tre i protocolli, abbiamo trovato l&#39;espressione di IA B, CD80, CD140a, PD-L1, e CD40 era più alta su digestione con CP e LP in entrambi TRC e LEC (Figura 2b). Questi risultati suggeriscono che il degrado di alcune molecole di superficie con collagenasi IV e D sono meno forti che con Collagenase P e dispasi. Nel loro insieme, l&#39;attuale protocollo include una breve digestione combinata con disaggregazione meccanico automatizzato per ridurre al minimo la superficie marcatore degradazione delle cellule stromali nodo linfa vitale. &quot;/&gt; Figura 1 nodi TRC, cellule LEC, BEC, e DN colorazione, gating, e quantificazione. Linfa C57BL / 6 topi sono stati digeriti seguendo il protocollo attuale e colorati con CD45, CD31 e gp38, Live / Morto per definire TRC, LEC, BEC, e DN cellule mediante citometria a flusso. I dati mostrano risultati rappresentativi della colorazione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51803/51803fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51803/51803fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Viabilità e superficiale espressione marker di cellule stromali linfonodali. Linfonodi di topi C57BL / 6 sono stati digeriti in seguito alla corrente (CP), il protocollo di Fletcher (FP) e colorati con CD45, gp38 e CD31 di Link (LP) e per definire TRC, LEC, BEC e DN cellule mediante citometria a flusso. A) Viabillità e il numero totale delle cellule di tutte le sottopopolazioni di cellule stromali linfonodo dopo Live / colorazione Morto (n ≥ 5, i dati combinati di due esperimenti indipendenti, barre rappresentano SEM). B) Analisi di espressione di superficie di IA b (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) e CD40 (PE-Cy7) su TRC e LEC (n = 6 per FP e n = 11 per LP e CP , dati aggregati di 2 esperimenti indipendenti, barre rappresentano SEM). Geometriche delle IFM valori di auto-fluorescenza per LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82,5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51803/51803fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Corrente Protocollo-Enzimi </td><td> Current-protocollo </td><td> Link Protocol-enzimi </td><td> Link-protocollo </td><td> FLetcher Protocol-enzimi </td><td> Fletcher-protocollo </td></tr><tr><td> Collagenase IV, DNasi I </td><td> 30 min, 37 ° C, agitazione </td><td> Collagenase IV, DNAsi I </td><td> 30 min, 37 ° C </td><td> Collagenase P, dispasi, DNAse I </td><td> 20 min, 37 ° C, invertire ogni 5 min </td></tr><tr><td> Collagenase D, DNasi I </td><td> 5 min, 37 ° C, agitazione, risospendere </td><td> Collagenase D, DNAsi I </td><td> 20 min, 37 ° C </td><td> Collagenase P, dispasi, DNAse I </td><td> 10 min, 37 ° C, risospendere 30 sec </td></tr><tr><td></td><td> 10 min, 37 ° C, agitazione </td><td> Collagenase D, DNAsi I </td><td> 37 ° C, risospendere ogni 10 minuti fino a completa digestione </td><td> Collagenase P, dispasi, DNAse I </td><td> 37 ° C, risospendere ogni 5 minuti fino a completa digestione </td></tr><tr><td></td><td> risospensione meccanica automatizzata </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. brevi riassunti di CP, LP, enzimi FP usati e protocolli.

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Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

isolation-of-murine-lymph-node-stromal-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

31.3K Views.  University of Basel and University Hospital Basel. Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells. 

Video: Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Immunologia e infezioni

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generazione di Linfonodo grassi Pad Chimere per lo studio del linfonodo stromale origine cellulare

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di linfociti murini

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Ottimizzazione dell'isolamento delle cellule stromali dal timo e dal midollo osseo

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca ematopoietica utilizzando l'isolamento delle cellule stromali per il sequenziamento di singole cellule

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

Riepilogo

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Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

L'isolamento e l'attivazione di linfociti murini

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

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