Gli autori ringraziano NSF (MCB-1.157.876) per il finanziamento. Ringraziamo anche Alberto Civetta, Giovanni Interno spazioso per mangiare, e due referee anonimi per i loro commenti.

Esperimenti su piccola scala devono essere eseguiti per acquisire familiarità con l&#39;intera procedura. 1. Raccolta di femmine vergini e maschi Naïve La versione più semplice di questo esperimento descritto è costituito da quattro tipi di croci iniziali, che coinvolgono la seguente combinazione di adulti: a) W 1.118 individui, al fine di raccogliere femmine vergini, b) individui Oregon-R, al fine di raccogliere i maschi di riferimento naïve, c ) P {sw} maschi omozigoti e femmine vergini provenienti da una linea di controllo che porta l&#39;organizzazione di SDIC wild-type in modo da raccogliere i maschi sperimentali naïve (tipo I) e d) P {sw} maschi omozigoti e SDIC-sw-delezione -realizzazione femmine vergini al fine di raccogliere i maschi sperimentali naïve che portano il deficit SDIC-sw (tipo II). <ol><li> Impostare più fiale contenenti 8-10 femmine e 5 maschi ciascuno. Lasciare le femmine a deporreuova e trasferire gli adulti a nuove fiale ogni 3-5 giorni. Utilizzare bottiglie piuttosto che fiale, se necessario, e utilizzare sempre alimenti freschi. Il numero di fiale necessarie dipenderà dal numero di tipi maschi sperimentali in studio e il numero di individui ritenuti necessari per rilevare differenze (Tabella 1). Più di 10 femmine per fiala potrebbero causare sovraffollamento durante la crescita delle larve, che possono causare variazioni nella fertilità della progenie. Conservare le fiale a 25 ° C in una camera a temperatura controllata. </li><li> Iniziare a raccogliere femmine vergini e maschi naïve nei giorni 11 e 12 ° dopo aver impostato le croci iniziali. Il periodo di attesa varia in funzione della temperatura; minore risultato temperature nel tempo maggiore sviluppo ritardando l&#39;insieme di individui. Un altro fattore che influenza la temporizzazione per eclosion è il tipo di supporto. Cibo nutriente, come la farina di mais, lievito di medie 29, assicura un corretto sviluppo dell&#39;adultosistema riproduttivo, che facilita l&#39;accoppiamento. Raccogliere unmated mosche ogni 4-6 ore. Quando si raccolgono, anestetizzare le mosche con l&#39;introduzione di CO 2 nel flaconcino, toccare le mosche verso il basso, e li sotto stereomicroscopio (Figura 2) sesso. Posizionare le mosche desiderati in diverse fiale per sesso e fenotipo e l&#39;etichetta delle fiale appropriato. </li></ol> Nota 1. Raccolta di routine si vede dal mattino, scartando gli adulti che emerse durante la notte precedente. Raccogliere femmine vergini e maschi ingenui una o due volte durante la giornata. Tipicamente, D. melanogaster maschi diventano sessualmente maturi 8 ore dopo eclosion a 25 ° C 30. Se le mosche sono mantenuti sotto 12:12 cicli giorno / notte ora, due picchi di eclosion sono attesi: durante la prima 1-2 ore dopo la luce è accesa, e durante la 2 ore prima che la luce si spegne. Eclosion si verifica entro 24 ore dopo l&#39;oscura pupa. Nota 2. Non più di 10 femmine shbbe essere messo nella stessa fiala per evitare sovraffollamento. Ciò limita anche la perdita di femmine nel caso esse devono essere scartati perché almeno uno di loro non è vergine. Nota 3. Al fine di raccogliere un numero adeguato di femmine vergini e maschi naïve in un breve periodo di tempo, possono essere adottate le seguenti misure. Impostare 15-20 fiale di w 1118 per gli esperimenti che coinvolgono due tipi di maschi sperimentali (Tabella 1). Leggermente cospargere la superficie dei mezzi di comunicazione e di aggiungere un paio di palline di lieviti secchi attivi per facilitare la deposizione delle uova. Trasferire i genitori almeno 4 volte in giorni consecutivi. Per aumentare la superficie disponibile per pupation in ciascun flacone, inserire la carta multi-piegata (7 x 5 cm) durante il 4 ° o 5 ° giorno dopo i genitori vengono trasferiti in un altro flacone (Figura 3). Se il numero di adulti emerse dalla croci iniziale non è sufficiente, attendere ancora qualche giorno e raccogliere singolarmenteals da fiale istituiti in date diverse. Piano per eseguire gli esperimenti su più giorni consecutivi, per uniformare il carico di lavoro. 2. Esperimenti doppio accoppiamento La Figura 4 mostra le fasi principali in esperimenti doppio accoppiamento eseguiti in 14. <ol><li> La mattina del 1 ° giorno, ha istituito il primo accoppiamento. I maschi Oregon-R sono i primi ad accoppiarsi nel saggio reato. <ol><li> Utilizzando l&#39;aspiratore, istituito fiale da 10 4-5-giorni di età dagli occhi bianchi w femmine vergini 1118 e 10 dagli occhi rossi Oregon-R maschi naïve ciascuno. Due o tre fiale sono impostati al giorno per 5 giorni consecutivi. Il numero di flaconcini da impostare potrebbe variare a seconda del numero di individui disponibili. Lasciare le mosche di accoppiarsi per 2 ore. </li><li> Scartare i maschi Oregon-R e posizionare ogni femmina in un nuovo flacone utilizzando un aspiratore (Figura 5). Identificazione sesso può essere ottenuto mediante ispezione visiva di pochidifferenze morfologiche (Figura 2). Etichettare ogni flacone in modo appropriato e lasciare la femmina nel flacone per 2 giorni (di seguito &quot;v1&quot;). </li></ol></li><li> Il giorno 3, configurare il secondo accoppiamento. Selezione dei maschi e trasversali costituite deve essere eseguita in modo casuale al fine di minimizzare ogni potenziale tendenza verso uno qualsiasi dei tipi maschili sperimentali. <ol><li> Due ore prima che la luce si spegne, trasferire di nuovo la femmina in un nuovo flacone con un aspiratore. Etichettare il nuovo flacone in modo appropriato (di seguito &quot;v2&quot;). </li><li> Introdurre tre 5-6-giorni di età maschi sperimentali dello stesso genotipo in v2. </li><li> Ripetere 2.2.1 e 2.2.2 per ogni femmina. </li><li> Il giorno 4, a due ore a destra prima la luce sia accesa (ossia non più di 12 ore dopo la 2.2.1), scartare i maschi utilizzando l&#39;aspiratore. </li></ol></li><li> Il giorno 6, trasferire di nuovo ogni femmina in un altro nuovo flacone. Etichettare le nuove fiale opportunamente (di seguito &quot;v3&quot;). </li><li> Il giorno 10, scartare il w 1118 </sup&gt; femmine. </li><li> Esaminare le progenie in v2 e v3. La prima ispezione è eseguita dopo 13-15 giorni dopo che la femmina è introdotto nella v2 (o v3), ad esempio, il 17 giorno dopo la femmina prima ovipositing iniziato a v2. La seconda ispezione è eseguita esattamente dopo 17 giorni. Questo lasso di tempo pone un limite temporale superiore di sicurezza che garantisce una seconda generazione nella stessa fiala. Due ispezioni impediscono sovraffollamento, facilitando il conteggio progenie. <ol><li> Il 17 Giorno, ispezionare v1 e garantire che non vi siano discendenti dagli occhi rossi presente, se non segnare la fiala di conseguenza. Presenza di progenie occhi bianchi indica che la femmina non era vergine al momento dell&#39;accoppiamento iniziale mentre nessuna progenie indica che l&#39;accoppiamento con il riferimento oppure i maschi sperimentali non si è verificato. </li><li> Il 17 Giorno, eseguire la prima ispezione di v2. Anesthetize emerso progenie in v2 con CO 2 e di ordinarli in base al colore degli occhi e il sesso. Numeri progenie record generò dal primo e secondomaschi ond. figura 6 mostra i fenotipi attesi nella prole di ogni schema di accoppiamento. In questo particolare esperimento 14, solo la progenie femminile può essere univocamente assegnato come generata dal riferimento o i maschi sperimentali e quindi solo le informazioni da figlie può essere usato per calcolare P 2. Se con altri marcatori la paternità prole maschio può essere univocamente assegnato, progenie conteggi di entrambi i sessi possono essere utilizzate nei calcoli a valle. Gettare la progenie, ma mantenere v2 per la seconda ispezione. </li><li> Il giorno 20, procedere come in 2.5.2 con la progenie di recente è emerso in v2 e poi gettare il flaconcino. </li><li> Il giorno 20, ispezionare la progenie emerse nel v3 per la prima volta e seguire passo 2.5.2. </li><li> Il giorno 23, procedere come in 2.5.3 con la progenie di recente è emerso in v3. </li></ol></li></ol> Nota 1: A causa del potenziale effetto di gonfiare il P punteggi che l&#39;accoppiamento multiplo potrebbe avere (2.2.2 e 2.2.3), l&#39;accoppiamentopuò essere limitata ad un particolare periodo di tempo. L&#39;arco di tempo dipende dalla frequenza remating associata al genotipo della femmina e maschi utilizzati. La probabilità di accoppiamento multiplo è appositamente ridotta durante la notte 11. Nota 2: non aggiungere pellets lievito vivo perché ciò può causare problemi dovuti al potenziale di crescita eccessiva del lievito quando il numero di mosche adulte è basso. 3. Analisi dei dati <ol><li> Progenie conteggi rilevati devono essere organizzati in modo appropriato per una facile ispezione visiva e l&#39;analisi efficiente con un pacchetto statistico adeguato (ad es JMP di SAS Institute) o di strumenti web-based (ad esempio <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a> ). </li><li> Capacità competitiva sperma. Aggiungi conta da v2 e v3. Mosche femmine che non hanno dato luogo a nulla o molto limitata progenie (ad esempio &lt;10), è morto durante la procedura, o erano solo successo inseminazioneta da uno dei due maschi sono considerati come non-informativo e sono esclusi da qualsiasi analisi statistica a valle (2.5.1 e Tabella 2). Calcolare il punteggio di 2 P per ogni femmina informativo. </li><li> Verificare se ci sono differenze statisticamente significative nei valori di P 2 tra i maschi sperimentali rispetto. Questo può essere fatto utilizzando parametrico (HSD di Tukey per esempio) o non-parametrici (ad esempio acciaio-Dwass) Test seconda di diversi fattori tra cui l&#39;asimmetria della distribuzione dei valori di P 2 e la dipendenza tra la varianza e la media. La trasformazione angolare è comunemente applicato a proporzioni come P 2 prima l&#39;uso di test parametrici 31. </li><li> Differenze di accoppiamento (opzionale). Per ogni tipo maschio sperimentale, calcolare il numero di femmine doppiamente accoppiate e quelle che accoppiato solamente con il primo maschio (il maschio di riferimento nel saggio reato e il maschio sperimentale nel dsaggio efense). Utilizzando un test esatto di Fisher a due code (disponibile presso <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a> ), determinare se vi sono differenze statisticamente significative tra i due tipi di maschi sperimentali. </li><li> Rapporto tra i sessi (opzionale). Per ogni maschio sperimentale, utilizzare il test del chi-quadrato per determinare se il rapporto tra i sessi nella prole da ogni devia femminili dal rapporto atteso 1:1. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo descritto il disegno sperimentale per valutare le differenze nel contributo relativo geneticamente distinti D. melanogaster maschi alla progenie in esperimenti a doppio accoppiamento controllati 7,8. Questo è stato fatto nel contesto di un fattore genetico ipotizzato di influenzare la capacità competitiva sperma, ed è stato illustrato nel saggio reato anche se una procedura simile vale per il saggio difesa (Figura 1). Questo disegno sperimentale può essere modificato a test altri aspetti del successo paternità come l&#39;influenza del genotipo femmina 32. Un esempio delle modificazioni che possono essere incorporati è il monitoraggio diretto della copulazione tra la femmina e il secondo maschio. Inoltre, è anche importante notare che le prestazioni relative dei tipi maschili sperimentali dipende dal genotipo del tester maschile e femminile usato e quindi non può essere estrapolata ad altri scenaricoinvolgendo diversi maschi e femmine tester 10,32,33. Dal momento che la raccolta degli individui richiesti (femmine vergini e maschi naïve) e di punteggio della discendenza un lavoro intensivo, il numero di distinte tipologie maschili sperimentali da valutare deve essere regolato in base al numero di personale ben addestrato a disposizione. Gli esperimenti descritti qui possono essere facilmente gestiti da una sola persona oltre sei settimane. In realtà, fino a cinque tipi maschili sperimentali potrebbero essere valutati in parallelo. L&#39;unica misura aggiuntiva da adottare è prolungare il numero di giorni di creazione accoppiamenti massa iniziale e raccogliendo le individui richiesti per loro. Nella nostra esperienza, il numero iniziale di femmine utilizzati (60-70) è sufficiente per ospitare riduzione della dimensione del campione, senza compromettere il nostro potere statistico per rilevare differenze tra i tipi maschili sperimentali (Tabella 2). La diminuzione del numero di ifemmine nformative possono derivare da diversi fattori, ad esempio la mancanza di prove di doppio accoppiamento o morte prematura. Tuttavia, il numero di femmine necessario per ciascun tipo maschio sperimentale al fine di ottenere un&#39;adeguata potenza statistica varierà a seconda della grandezza dell&#39;effetto del fattore genetico sotto studio. Un esperimento pilota è altamente consigliabile per stimare il livello adeguato di replica. Differenze statistiche in P 1 o P (2) punteggi indicano variazione maschile efficienza fecondazione anche se non informano circa i meccanismi di fondo che contribuiscono a tali differenze. Ciò è dovuto a molteplici variabili che potrebbero influire sulla capacità competitiva degli spermatozoi (ampiamente recensito nel 20 e 34). Attributi di sperma come la dimensione, il numero e la motilità possono avere un impatto sulla concorrenza dello sperma direttamente 35. Inoltre, altri meccanismi non legati alla spermatozoi diretta concorrenza can contribuire anche a differenze di P 1 e P 2 valori. Ad esempio, prima sperma maschile può essere preferenzialmente rimosso, riposizionato o risciacquata prima o durante l&#39;accoppiamento con il secondo maschio 19,20. Ciò può avvenire per stimolazione meccanica, per esempio, durante l&#39;accoppiamento e tramite molecole presenti nel liquido seminale del secondo maschio, che influirà negativamente primo sperma maschile 19,36. Pertanto, le analisi complementari che valutano l&#39;impatto di tali ulteriori meccanismi indiretti devono essere eseguite, idealmente prima dell&#39;esperimento doppio accoppiamento qui descritto. Esempio di questi saggi sono quelli di test per le differenze di vitalità zigote (ad esempio la sopravvivenza larvale) e schiusa di uova (un proxy per la fecondazione dell&#39;uovo di successo), 28,37, che in ultima analisi, portare a differenze di numero di progenie. Tecniche di imaging sperma può anche essere altamente informativo 19,24,28. Essenzialmente, uno of i maschi vengono modificati geneticamente in modo che lo sperma è etichettato con una proteina di fusione fluorescente (ad esempio quello del maschio di riferimento con una proteina fluorescente verde) contribuendo monitoraggio dinamiche spermatozoi nel tratto riproduttivo femminile. Questo approccio combinato con ulteriore colorazione utilizzando 4 &#39;,6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI) è stato utilizzato per identificare direttamente la conta degli spermatozoi dal primo e secondo maschi in ricettacoli seminali sezionati di D. melanogaster femmine 24,28. In uno studio di 24, le differenze nella conta spermatica sono in buon accordo con le differenze di P 2 valori che sostengono la nozione che queste differenze di paternità maschile erano riflettente di vere differenze nella capacità degli spermatozoi competitiva e non di meccanismi indiretti. Parametri successivi sono stati raggiunti mediante la generazione di ceppi transgenici che esprimono tag fluorescenti verdi e rossi fusi a proteine ​​dello sperma-specifici 19. Questi improvemgenitori hanno permesso ai ricercatori di monitorare lo sperma dei due in diretta concorrenza spermatozoo maschile con un grado di risoluzione senza precedenti. In conclusione, l&#39;esecuzione di esperimenti a doppio accoppiamento e saggi aggiuntivi come quelle suggerite aiutano a circoscrivere la natura di qualsiasi differenza di P 1 e P 2 punteggi trovati tra tipi maschili sperimentali, che apre la possibilità di sezionare la base genetica della naturale variazione di capacità competitiva degli spermatozoi.

Dal Geoff Parker ha osservato la prevalenza di competizione spermatica negli insetti e le sue implicazioni evolutive 2, un&#39;ondata di studi in Drosophila e di altre specie hanno cercato di far luce su questo fenomeno a vari livelli. Alcuni esempi di aree di interesse sono stati l&#39;indagine della sua variazione nelle popolazioni naturali 9,10, la sua architettura genetica e la pertinenza dei sottostanti fattori genetici 11-14, e il suo ruolo nel guidare la coevoluzione tra i sessi 15,16. In D. melanogaster femmine, la limitata capacità degli organi di sperma di stoccaggio specializzati, un paio di spermateca e il ricettacolo seminale 6,17, contribuisce alla concorrenza dello sperma di diversi maschi. Circa 1.500 spermatozoi vengono trasferiti durante l&#39;accoppiamento al femminile, ma solo ~ 500 possono essere ospitati negli organi menzionati 18,19. In laboratorio, controllato in doppio-accoppiamento espementi comportanti un maschio di riferimento e uno o più maschi di interesse sono stati ampiamente utilizzati per valutare lo sperma capacità competitiva 7,8. Capacità competitiva degli spermatozoi è stimata come la proporzione di progenie desiderata dal maschio sperimentale in esperimenti a doppio accoppiamento sopra la progenie totale, vale a dire che sia dalla sperimentazione e maschi di riferimento. Capacità competitiva sperma comprende due componenti, ciascuna delle quali valutata in un test separato. Nel saggio reato, la capacità dello sperma maschile sperimentale per spostare lo sperma dal primo maschio, ossia il maschio di riferimento, viene valutato. Viceversa, nel saggio difesa, la capacità dello sperma maschile sperimentale per resistere spostamento o per ridurre la riuscita fecondazione del maschio sperma di riferimento viene valutata. A seconda del tipo di dosaggio, difesa o offesa, abilità competitiva sperma è stimata mediante i punteggi P 1 o P 2, rispettivamente. P1 e P 2 può assumere solo valori tra 0 e 1. I valori intermedi sono di solito interpretate come prova indiretta di sperma di miscelazione, che suggerisce uno scenario fisiologico che coinvolge competizione spermatica diretta. Seguendo la stessa logica, i valori estremi possono essere interpretati come prova di un forte differenziale sperma capacità competitiva. I primi studi hanno dimostrato che la P 2 in D. melanogaster è di oltre 0,8 aumentando come il tempo trascorso tra i due accoppiamenti allunga 7. Questo stesso disegno sperimentale è stato utilizzato in altre specie di Drosophila, P 2 essendo la statistica comunemente usato negli studi per valutare sperma capacità competitiva 20. Per la maggior parte delle specie, i P 2 valori dei ceppi testati è superiore a 0,6 21. Tuttavia, diversi altri meccanismi non correlati alla concorrenza diretta tra sperma di diversi maschi possono produrre punteggi identici (vedi la discussione). Dprogenie istinguishing figlia di primo o secondo i maschi è possibile attraverso l&#39;uso di marcatori facilmente identificabili. Nei primi studi, uno dei maschi è stato irradiato a dosi subletali di, per esempio, i raggi X in modo tale che praticamente tutti gli ovuli fecondati da spermatozoi irradiati non è riuscito a covare 7. Successivamente, le mutazioni che alterano la pigmentazione degli occhi o la forma dell&#39;ala sono stati i marcatori più comunemente utilizzati. Esempi del primo sono le mutazioni bw (marrone) 9, cn (cinabro) e 22 w (bianco) 23, mentre la mutazione Cy (ricci) 24 corrisponde al secondo tipo di fenotipi; alcune di queste mutazioni sono stati combinati nella stesso individuo, ad esempio cn bw. In misura minore, allozymes 25 e microsatelliti 26,27 con modelli di eredità note sono stati utilizzati anche. Il disegno sperimentale per verificare le differenze dicapacità competitiva sperma qui descritta segue essenzialmente quello di Clark et al. 9. I risultati ottenuti da questi esperimenti danno informazioni esclusivamente sulla paternità differenziale dei tipi maschili sperimentali sotto esame. I saggi che fanno anche conto delle differenze post-fecondazione in palestra 14,28 e tecniche di visualizzazione di sperma 24 consentono differenze di P 1 o P (2) realizza da essere interpretate come differenze nella competenza degli spermatozoi. La figura 1 illustra il razionale sia del reato ed i saggi di difesa. Per illustrare la logistica del processo, un esperimento reato effettuata in D. melanogaster 14 sarà spiegato in dettaglio. Questo particolare test reato è stato utilizzato per testare un effetto misurabile della famiglia catena intermedia multigene Sperm-specifica dineina (SDIC) sulla capacità competitiva degli spermatozoi. Tutto il membros di questa famiglia multigene risiedono in tandem sul cromosoma X. Maschi Knockout sono stati generati eliminando il cluster SDIC. Poiché il segmento cancellato comprendeva anche il breve ala gene essenziale (sw) e lo scopo dello studio era quello di valutare la rilevanza di SDIC, i maschi che portano la cancellazione SDIC-sw sono stati salvati da una copia transgenico di sw (simboleggiato come P {sw} , che inoltre effettuato un gene reporter mini-bianco) sul cromosoma 2. Colore degli occhi è stato utilizzato come marcatore visibile per l&#39;identificazione di paternità. Tutte le mosche erano in uno sfondo bianco mutante con l&#39;eccezione di quelli dal ceppo Oregon-R, che sono stati utilizzati come riferimento maschi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amber latex tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62996-473</td>
			<td>1/4 inch ID, 1/6 inch Wall</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml graduated XL filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mesh Fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thin and smooth</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td>Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FlyStuff Foot Valve, complete system</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121C</td>
			<td>Not necessary if FlyNap is used</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Come with carboard trays that can be reused for holding vials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-212</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td>Found in general grocery store</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Different colors may be used for marking different genotypes</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

assessing differences in sperm competitive ability in drosophila

La concorrenza tra i maschi conspecifici di concimazione gli ovuli è uno dei meccanismi di selezione sessuale, ovvero la selezione che opera sulla massimizzazione del numero di eventi di accoppiamento di successo piuttosto che sulla sopravvivenza massimizzazione e la vitalità 1. Competizione spermatica rappresenta la competizione tra i maschi dopo copulare con la stessa femmina 2, in cui la loro spermatozoi sono coincidenti nel tempo e nello spazio. Questo fenomeno è stato segnalato in molteplici specie di piante e animali 3. Ad esempio, catturati in natura D. femmine melanogaster solito contengono spermatozoi 2-3 maschi 4. Gli spermatozoi sono memorizzati in organi specializzati con capacità di archiviazione limitata, che potrebbe portare alla concorrenza diretta degli spermatozoi da diverse maschi 2,5. Confrontando la capacità competitiva sperma di diversi maschi di interesse (tipi maschili sperimentali) è stata eseguita attraverso controllato in doppio-accoppiamento sperimentazionets in laboratorio 6,7. In breve, una singola femmina è esposto a due diversi maschi consecutivamente, un maschio sperimentale e un maschio riferimento di accoppiamento incrociato. Lo stesso schema di accoppiamento è poi seguito utilizzando altri tipi di sesso maschile sperimentali facilitando così il confronto indiretto della capacità competitiva del loro sperma attraverso un riferimento comune. La frazione di individui generò dai maschi sperimentali e di riferimento viene identificato utilizzando marcatori, che permette di stimare la capacità competitiva degli spermatozoi utilizzando espressioni matematiche semplici 7,8. Inoltre, la capacità competitiva degli spermatozoi può essere stimata in due diversi scenari a seconda che il maschio sperimentale è seconda o prima di accoppiarsi (offesa e difesa dosaggio, rispettivamente) 9, che si presume essere riflettente di diversi attributi di competenza. Qui, descriviamo un approccio che consente di interrogare il ruolo dei diversi fattori genetici che sono alla base putatively tegli fenomeno della capacità competitiva sperma in D. melanogaster.

La tabella 2 riassume alcune caratteristiche salienti di due esperimenti di reato (saggi 1 e 2), in cui D. melanogaster maschi sperimentali con e senza (tipo I e II, rispettivamente) un cluster SDIC funzionale sono confrontati 14. Dopo aver preso in considerazione diversi episodi che si sono verificati alcuni replicati, 58-83% delle femmine sono risultati essere informativo e quindi la paternità conti di loro progenie potrebbero essere utilizzati per il calcolo di P 2. Risultati dei test non parametrici erano coerenti con una minore capacità competitiva spermatozoi nei maschi senza cluster SDIC (Tipo II) rispetto a maschi con il cluster intatto (Tipo I) 14. Questo modello era riproducibile di tutti i saggi di reato eseguiti. Una tendenza simile ma non statisticamente significativa è stata trovata nei saggi di difesa effettuati in parallelo (non illustrato). È importante sottolineare che l&#39;assenza di differenze di accoppiamento (passo 3,4) ha escluso la possibilità cheil genotipo maschile potrebbe influenzare il comportamento femminile remating 14. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Offense Assay </td><td colspan="3"> Analisi Difesa </td></tr><tr><td> Sperimentale ♂ Tipo </td><td> w 1118 ♀ </td><td> OR-R ♂ </td><td> Sperimentale ♂ </td><td> w 1118 ♀ </td><td> Sperimentale ♂ </td><td> OR-R ♂ </td></tr><tr><td> I </td><td> 60-70 </td><td> 60-70 </td><td> 180-210 </td><td> 60-70 </td><td> 60-70 </td><td> 180-210 </td></tr><tr><td> II </td><td> 60-70 </td><td> 60-70 </td><td> 180-210 </td><td> 60-70 </td><td> 60-70 </td><td> 180-210 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Numero di individui necessari in esperimenti a doppio accoppiamento per il confronto di due tipi maschili sperimentali. OR-R, Oregon-R. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="5"> ♀ </td><td></td></tr><tr><td> Sperimentale ♂ Tipo </td><td> Conte iniziale </td><td> Nessun successo della fecondazione in riferimento ♂ </td><td> No fecondazione successo con sperimentale ♂ </td><td> Problematico 1 </td><td> Informativa (%) </td><td> P 2 2 </td></tr><tr><td> Test 1 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B +(Tipo I) </td><td> 60 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 2 </td><td> 47 (78%) </td><td> 1,000 (1,000-0,987) </td></tr><tr><td> A-(Tipo II) </td><td> 55 </td><td> 1 </td><td> 7 </td><td> 5 </td><td> 42 (76%) </td><td> 0,986 (1,000-0,936) </td></tr><tr><td> Assay 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> I + (Tipo I) </td><td> 74 </td><td> 9 </td><td> 7 </td><td> 15 </td><td> 43 (58%) </td><td> 1,000 (1,000-0,979) </td></tr><tr><td> E-(Tipo II) </td><td> 75 </td><td> 3 </td><td> 8 </td><td> 2 </td><td> 62 (83%) </td><td> 0,983 (1,000-0,927) </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Sintesi degli effetti di eventi differenti sul numero di femmine utilizzate in saggi di reato effettuata per testare le differenze tra tipi maschili sperimentali. 1 Morto, escaped durante il dosaggio, o che comporti un numero di figli sotto di un valore di soglia. 2 mediana (range interquartile). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50547/50547fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig1.jpg" /> Figura 1. Disegno sperimentale per l&#39;offesa e saggi di difesa. Il codice colore utilizzato per ciascun genotipo denota il colore degli occhi della mosca adulta. Maschi Oregon-R sono utilizzati come riferimento per il confronto indirettamente la capacità competitiva sperma di due maschi sperimentali: uno trasportando la forma wild-type del fattore genetico in studio (Tipo I) e una in cui la funzionalità del fattore genetico è stato perturbato (tipo II). Il cluster SDIC, il fattore genetico in questo caso, è situato sul cromosoma X mentre il sw transgene è situato sul cromosoma 2. Gli esperimenti raffigurati sono parte di quelle all&#39;interno <sup&gt; 14. Df (SDIC, sw), tra cui la carenza di famiglia multigene SDIC e il sw gene adiacente. Y, cromosoma Y, P {sw}, transgene; w 1118, un allele mutante del gene bianco. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50547/50547fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig2.jpg" /> Figura 2. Identificazione Sesso in D. melanogaster. (A) dorsale, (B), laterale, e (C), vista ventrale di 1 ora vecchie femmine (a sinistra) e maschi (destra) anestetizzati con CO 2 con lo stereomicroscopio. Il genitali maschili è sostanzialmente più pigmentata rispetto alla piastra vaginale dando vita ad un luogo buio apparente, questo è il personaggio più affidabile da utilizzare per la determinazione del sesso. Inoltre, il tarso delle zampe anteriori maschi possiedono una frangia scura setole (sesso pettine), assente nelfemminile. (D) Affidabile e rapida identificazione di genere di mosche anziani ad occhio nudo è altamente raccomandato per il trasferimento di individui in fiale utilizzando aspiratori. In adulti più anziani, addome maschile è dorsalmente molto più scuro di quello della femmina. Le femmine di solito sono più grandi e hanno un addome più pallido rispetto ai maschi. L&#39;ovopositore rende il ventre femminile ha sottolineato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig3.jpg" /> Figura 3. Carta multi-piegata utilizzato per aumentare la superficie disponibile per vagare larve. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50547/50547fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig4.jpg" /> Figura 4. Schema dell&#39;esperimento di differenze dosaggio in capacità competitiva degli spermatozoi in D. . accoppiamento Mass melanogaster per 2 ore con vir<html> gin w 1118 femmine e maschi Oregon-R vengono avviate ogni giorno per 5 giorni. In ogni accoppiamento di massa, una volta terminato, 12-14 femmine devono essere aspirati separatamente in singoli flaconcini (v1). Due giorni dopo, ogni femmina viene trasferito in una nuova provetta (v2) insieme a tre maschi sperimentali dello stesso genotipo. Questi individui possono accoppiarsi durante la notte. I maschi vengono scartati dopo ~ 12 ore, mentre le femmine sono autorizzati a oviposit per 2 giorni. Successivamente, le femmine sono trasferiti in nuovi flaconi (v3), ha permesso di oviposit nuovamente, e infine gettati dopo 3 giorni. Tredici a quindici e 17 giorni dopo che le donne hanno iniziato a oviposit sia v2 e v3, padre di progenie dalla sperimentale e maschi di riferimento vengono identificati utilizzando marcatori appropriati e registrati. Dopo le progenie in V2 e V3 sono ispezionati due volte, i flaconi vengono scartati. Freccia verso il basso, gli individui scartati; simbolo dell&#39;occhio, ispezione fiala. Adattato da 9.d/50547/50547fig4large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig5.jpg" /> Figura 5. Aspiratore flessibile. Assemblato da ambra tubi in lattice, un 1 ml graduato suggerimento per ricevere mosche e un altro di funzionamento come mouthpart monouso. Per evitare che le mosche essere risucchiato nel tubo, sottile tessuto di maglia è usato per proteggere il fly-ricevente punta al bivio per il tubo. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50547/50547fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig6.jpg" /> Figura 6. Fenotipi attesi nella prole del saggio reato. Sinistra e di destra, attraversa per valutare la capacità competitiva sperma di controllo e di knock-out maschi rispettivamente. Genotipo e il colore degli occhi per parentali e progenie di entrambi fathers sono mostrati. Causa delle particolari marcatori genetici usati in questa analisi, solo la progenie femminile può essere usato per calcolare P 1 (o P 2) colonne (vedi testo per i dettagli); parte della progenie maschile desiderata dal maschio sperimentale è occhi bianchi e . quindi fenotipicamente indistinguibile dalla progenie maschile del maschio riferimento Df, deficit; P {sw}, transgene;. w 1118 allele mutante del gene bianco <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50547/50547fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Differenziale capacità competitiva sperma tra<em&gt; Drosophila</em&gt; Maschi con genotipi distinti possono essere accertata attraverso esperimenti a doppio accoppiamento. Ciascuno di questi esperimenti coinvolge uno dei maschi di interesse e un maschio riferimento. Marcatori facilmente identificabili nella prole consentono inferenza della frazione di individui generò da ogni male.

Differenze valutando in capacità competitiva sperma in<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

assessing-differences-in-sperm-competitive-ability-in-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

14.6K Views.  University of California, Irvine. Differenziale capacità competitiva sperma tra Drosophila Maschi con genotipi distinti possono essere accertata attraverso esperimenti a doppio accoppiamento. Ciascuno di questi esperimenti coinvolge uno dei maschi di interesse e un maschio riferimento. Marcatori facilmente identificabili nella prole consentono inferenza della frazione di individui generò da ogni male.

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Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescenza In situ</emIbridazione> (FISH) Protocollo di sperma umano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

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Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

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Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro Attivazione di Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualizzazione e monitoraggio di mRNA endogeni nelle camere uovo di Drosophila melanogaster dal vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Medio-throughput Screening Test per la valutazione degli effetti sulla Ca2 +-segnalazione e reazione acrosomiale in sperma umano

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...