Los autores agradecen a NSF (MCB-1157876) para su financiación. También queremos agradecer a Alberto Civetta, John Roote y dos árbitros anónimos por sus comentarios.

Experimentos a pequeña escala se debe realizar para familiarizarse con todo el procedimiento. 1. Recopilación de hembras vírgenes y hombres de Naïve La versión más simple del experimento descrito consta de cuatro tipos de cruces iniciales, que implican la combinación de los adultos: a) w particulares 1118 con el fin de recoger las hembras vírgenes, b) Oregon-R individuos con el fin de recoger los varones referencia ingenuos, c ) P {sw} machos homocigotos y hembras vírgenes de una línea de control que lleva a la organización de tipo salvaje de SDIC el fin de recoger los machos experimentales tratados previamente (tipo I), y d) P {sw} machos homocigotos y SDIC-sw-supresión -llevar a hembras vírgenes con el fin de recoger los machos experimentales no tratados previamente que llevan la deficiencia de NaDCC-sw (Tipo II). <ol><li> Configurar múltiples viales que contienen 8-10 mujeres y 5 hombres cada una. Permitir que las hembras ponenhuevos y transferir los adultos a los nuevos viales cada 3-5 días. Utilice botellas en lugar de viales si es necesario y utilizar siempre los alimentos frescos. El número de viales necesarios dependerá del número de tipos de machos experimentales en estudio y el número de individuos que se estima necesario para detectar diferencias (Tabla 1). Más de 10 hembras por vial podrían resultar en el hacinamiento durante el crecimiento de las larvas, que pueden causar variaciones en la fertilidad de la progenie. Guarde los viales a 25 ° C en una cámara de temperatura controlada. </li><li> Comience a recoger hembras vírgenes y machos ingenuos en los días 11 y 12 de noviembre después de la creación de los cruces iniciales. El período de espera varía en función de la temperatura; inferior resultado temperaturas en el tiempo de desarrollo más largo retraso de la colección de individuos. Otro factor que afecta el tiempo de eclosión es el tipo de medio. Alimentos nutritivos, como medio de harina de maíz, la levadura 29, asegura el correcto desarrollo del adultosistema reproductivo, lo que facilita el apareamiento. Recoger unmated vuela cada 4-6 horas. Al recoger, anestesiar moscas mediante la introducción de CO 2 en el vial, toque las moscas hacia abajo, y el sexo a bajo microscopio estereoscópico (Figura 2). Coloque las moscas deseadas en diferentes viales por sexo y fenotipo y la etiqueta de los viales adecuadamente. </li></ol> Nota 1. Colección rutina comienza en la mañana descartando los adultos que emergieron durante la noche anterior. Recoger las hembras vírgenes y machos ingenuos una o dos veces durante el día. Típicamente, D. los machos alcanzan la madurez sexual melanogaster 8 horas después de la eclosión a 25 ° C 30. Si las moscas se mantuvieron en ciclos de luz / oscuridad 12:12 h, se espera que dos picos de eclosión: durante la primera 1-2 horas después de que la luz se enciende, y durante la 2 horas antes de la luz se apaga. Eclosión ocurre dentro de 24 horas después de la pupa se oscurece. Nota 2. No más de 10 mujeres shía ser puesto en el mismo vial para evitar el hacinamiento. Esto limita también la pérdida de las hembras en el caso de que tengan que ser descartado, porque al menos uno de ellos no es virgen. Nota 3. Con el fin de recoger la cantidad apropiada de hembras vírgenes y machos ingenuos en un corto período de tiempo, las siguientes medidas pueden adoptarse. Configure 15-20 frascos de 1118 w de experimentos con dos tipos de machos experimentales (Tabla 1). Espolvorear ligeramente la superficie de los medios de comunicación y añadir unas pastillas de levadura seca activa para facilitar la oviposición. Traslado padres por lo menos 4 veces en días consecutivos. Para aumentar la superficie disponible para la fase de pupa en cada vial, inserte el papel multi-plegada (7 x 5 cm) durante el 4 º o 5 º día después de que los padres se transfieren a otro vial (Figura 3). Si el número de adultos emergidos de las cruces inicial no es suficiente, esperar unos días más y cobrar individualmenteALS de viales establecidos en diferentes fechas. Plan para llevar a cabo los experimentos durante varios días consecutivos para igualar la carga de trabajo. 2. Experimentos doble de apareamiento La figura 4 muestra las principales etapas implicadas en experimentos de doble acoplamiento realizadas en 14. <ol><li> En la mañana del día 1, creó el primer apareamiento. Los machos Oregon-R son el primero para acoplarse en el ensayo de delito. <ol><li> Usando el aspirador, creado viales conteniendo 10 4 a 5 días de edad, de ojos blancos w hembras vírgenes 1118 y 10 de ojos rojos Oregon-R machos ingenuos cada uno. Dos a tres viales se configuran al día durante 5 días consecutivos. El número de viales necesarios para la creación puede variar en función del número de personas disponibles. Permita que las moscas para aparearse durante 2 horas. </li><li> Descartar Oregon-R machos y colocar cada hembra en un nuevo vial utilizando un aspirador (Figura 5). La identificación del sexo se puede lograr mediante la inspección visual de unos pocosdiferencias morfológicas (Figura 2). Marque cada vial adecuada y dejar a la hembra en el vial durante 2 días (en adelante &quot;v1&quot;). </li></ol></li><li> El día 3, configure el segundo acoplamiento. Selección de los varones y transversales establecidos se debe realizar al azar con el fin de minimizar cualquier sesgo potencial hacia cualquiera de los tipos masculinos experimentales. <ol><li> Dos horas antes de que la luz está apagada, vuelva a transferir a la mujer a un nuevo vial con un aspirador. Marque el nuevo vial adecuada (en lo sucesivo &quot;v2&quot;). </li><li> Introducir tres 5-6-días de edad, machos experimentales del mismo genotipo en v2. </li><li> Repita 2.2.1 y 2.2.2 para cada mujer. </li><li> El día 4, a dos horas justo antes de la luz se activa (es decir, no más de 12 horas después de la 2.2.1), desechar los hombres mediante el aspirador. </li></ol></li><li> En el Día 6, transferir cada hembra de nuevo en otro frasco nuevo. Etiquetar los nuevos viales debidamente (en adelante &quot;v3&quot;). </li><li> El día 10, deseche el 1118 w </sup&gt; hembras. </li><li> Examine las progenies en v2 y v3. La primera inspección se lleva a cabo después de 13-15 días después de que se introdujo la hembra en v2 (o V3), por ejemplo, en el día 17 después de la primera hembra oviposición se inició en v2. La segunda inspección se realiza exactamente después de 17 días. Este período de tiempo representa un límite temporal máximo de seguridad que garantiza que no habrá segunda generación en el mismo vial. Dos inspecciones evitar el hacinamiento, facilitando conteo progenie. <ol><li> El día 17, inspeccione v1 y asegurar que hay descendencia de ojos rojos presentes, si no marcar el vial en consecuencia. Presencia de la progenie de ojos blancos indica que la hembra no era virgen en el momento de apareamiento inicial mientras que ninguna progenie indica que el apareamiento con la referencia o los machos experimentales no ocurrir. </li><li> El día 17, lleve a cabo la primera inspección de la v2. Anesthetize surgió progenie en v2 con CO 2 y ordenarlos por color de los ojos y el sexo. Números de progenie Registro engendrados por el primer y segundomachos ond. Figura 6 muestra los fenotipos esperados en la progenie de cada esquema de apareamiento. En este experimento en particular 14, sólo progenie femenina se puede asignar de forma inequívoca como engendrado por la referencia o los machos experimentales y por lo tanto sólo la información de las hijas se puede utilizar para calcular P 2. Si con otros marcadores de la paternidad de la descendencia masculina se puede asignar de forma inequívoca, los recuentos de progenie de ambos sexos pueden ser utilizados en los cálculos posteriores. Deseche la progenie, pero mantener v2 de segunda inspección. </li><li> El día 20, proceder como en 2.5.2 con la progenie de reciente creación en v2 y luego desechar el vial. </li><li> En el Día 20, inspeccionar la progenie surgido en v3 por primera vez y siga el paso 2.5.2. </li><li> El día 23, proceder como en 2.5.3 con la progenie de reciente creación en v3. </li></ol></li></ol> Nota 1: Debido al potencial efecto de inflar las puntuaciones de P que el apareamiento múltiple podría tener (2.2.2 y 2.2.3), el apareamientopuede ser limitado a un lapso de tiempo determinado. El marco de tiempo dependerá de la frecuencia de aparearse de nuevo asociado con el genotipo de la hembra y machos usados. La probabilidad de apareamiento múltiple es especialmente reducido durante la noche 11. Nota 2: No añadir pastillas de levadura vivas, ya que esto podría causar problemas debido al potencial de crecimiento excesivo de la levadura cuando el número de moscas adultas es baja. 3. Análisis de Datos <ol><li> Cuenta progenie grabados deben organizarse adecuadamente para facilitar la inspección visual y análisis eficiente con un paquete estadístico adecuado (por ejemplo JMP de SAS Institute) o herramientas gratuitas basadas en la Web (por ejemplo <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a> ). </li><li> Capacidad competitiva de esperma. Añadir cuenta de v2 y v3. Las moscas hembras que han dado lugar a ninguna o muy limitada progenie (por ejemplo, &lt;10), fallecido durante el procedimiento, o sólo de éxito inseminaciónted por uno de los dos hombres se consideran como no-informativo y están excluidos de cualquier análisis estadístico posterior (2.5.1 y Tabla 2). Calcular la puntuación P 2 para cada mujer informativo. </li><li> Probar si existen diferencias estadísticamente significativas en los valores de P 2 entre los machos experimentales comparados. Esto puede hacerse usando pruebas no paramétricas (por ejemplo de acero-Dwass) dependiendo de varios factores, incluyendo la asimetría de la distribución de los valores de P 2 y la dependencia entre la varianza y la media paramétrica (HSD de Tukey por ejemplo) o. La transformación angular se aplica comúnmente a proporciones tales como P 2 antes de que el uso de pruebas no paramétricas 31. </li><li> Diferencias de acoplamiento (opcional). Para cada tipo macho experimental, calcular el número de las hembras apareadas por partida doble y los que sólo se apareó con el primer macho (el macho de referencia en el ensayo de ataque y el macho experimental en el densayo efense). Uso de una prueba exacta de Fisher de dos colas (disponible en <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a> ), determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre los dos tipos de machos experimentales. </li><li> Tasa de masculinidad (opcional). Para cada hombre experimental, utilice la prueba de chi-cuadrado para determinar si la proporción de sexos en la descendencia de cada hembra se desvía de la proporción esperada de 1:1. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

Hemos descrito el diseño experimental para evaluar las diferencias en la contribución relativa de genéticamente distinta D. melanogaster hombres a la progenie en los experimentos de doble acoplamiento controlados 7,8. Esto se ha hecho en el contexto de un factor genético planteado la hipótesis de influir en la capacidad competitiva de esperma y se ha ilustrado en el ensayo de delito aunque se aplica un procedimiento similar al ensayo de defensa (Figura 1). Este diseño experimental puede ser modificado para probar otros aspectos del éxito de paternidad, tales como la influencia del genotipo hembra 32. Un ejemplo de las modificaciones que se pueden incorporar es la monitorización directa de la copulación entre la hembra y el segundo macho. Además, también es importante tener en cuenta que el rendimiento relativo de los tipos masculinos experimentales depende del genotipo del probador macho y hembra utilizado y por lo tanto no se puede extrapolar a otros escenariosinvolucrando diferentes machos y hembras probador 10,32,33. Dado que el conjunto de los individuos requeridos (hembras vírgenes y machos ingenuos) y la puntuación de la progenie son mano de obra intensiva, el número de diferentes tipos masculinos experimentales a evaluar debe ser ajustado de acuerdo a la cantidad de personal capacitado disponible. Los experimentos descritos aquí se pueden manejar fácilmente por una persona de más de seis semanas. De hecho, hasta cinco tipos masculinos experimentales podrían ser evaluados en paralelo. La única medida adicional que se adoptará es prolongar el número de días la creación de emparejamientos iniciales de masas y la recogida de los individuos requeridos para ellos. En nuestra experiencia, el número de partida de las hembras utilizadas (60-70) es suficiente para dar cabida a la reducción en el tamaño de la muestra sin comprometer nuestro poder estadístico para detectar diferencias entre los tipos masculinos experimentales (Tabla 2). La disminución en el número de ihembras nformative pueden ser resultado de diferentes factores, por ejemplo la falta de pruebas de doble acoplamiento o la muerte prematura. Sin embargo, el número de hembras necesario para cada tipo macho experimental con el fin de alcanzar el poder estadístico adecuado variará dependiendo de la magnitud del efecto del factor genético en estudio. Una experiencia piloto es altamente recomendable para estimar el nivel adecuado de la replicación. Las diferencias estadísticas en P1 (o P2) Puntos indican variaciones en la eficiencia de la fertilización masculina a pesar de que no informan sobre los mecanismos subyacentes que contribuyen a tales diferencias. Esto es debido a las múltiples variables que podrían afectar a la capacidad competitiva de esperma (examen exhaustivo en 20 y 34). Atributos de esperma como el tamaño, el número y la motilidad pueden tener un impacto en la competencia de los espermatozoides directamente 35. Además, otros mecanismos no relacionados con la competencia de esperma directa can también contribuir a las diferencias en los valores de P 1 o P 2. Por ejemplo, primero esperma masculino se puede eliminar preferentemente, vuelve a colocar, o lavado a cabo antes o durante el acoplamiento con el segundo macho 19,20. Esto puede ocurrir por la estimulación mecánica, por ejemplo, durante la copulación y a través de moléculas presentes en el fluido seminal del segundo macho, lo que afectará negativamente primera esperma masculino 19,36. Por lo tanto, se deben realizar ensayos complementarios que evalúan el impacto de los mecanismos indirectos adicionales, a ser posible antes del experimento de doble acoplamiento aquí descrito. Ejemplo de estas pruebas son las que resultan de las diferencias en la viabilidad cigoto (por ejemplo, la supervivencia larval) y eclosión de los huevos (un proxy para el éxito de la fertilización del huevo) a 28,37, lo que finalmente da lugar a diferencias en el número de descendientes. Las técnicas de imagen de esperma también puede ser muy informativa 19,24,28. Esencialmente, uno of los machos se modifican genéticamente de tal manera que el esperma se marca con una proteína de fusión fluorescente (por ejemplo, de que el macho de referencia con una proteína fluorescente verde) ayudar a monitorizar la dinámica de esperma en el tracto reproductivo femenino. Este enfoque se utilizó combinado con tinción adicionalmente usando 4 &#39;,6-diamino-2-phenyllindole (DAPI) para identificar directamente el número de espermatozoides de los primero y segundo receptáculos seminales en los machos diseccionados de D. hembras melanogaster 24,28. En un estudio 24, las diferencias en el número de espermatozoides estaban en buen acuerdo con las diferencias en los valores de P 2 apoyan la noción de que estas diferencias en la paternidad masculina son un reflejo de verdaderas diferencias en la capacidad competitiva de esperma y no de mecanismos indirectos. Refinamientos posteriores se han conseguido mediante la generación de cepas transgénicas que expresaban etiquetas fluorescentes verdes y rojas fusionados a proteínas específicos del esperma 19. Estos improvempadres han permitido a los investigadores controlar el esperma de los dos compitiendo directamente esperma masculino con un grado sin precedentes de la resolución. En conclusión, la ejecución de experimentos de doble acoplamiento y ensayos adicionales como las que propuso ayudar a reducir la naturaleza de las diferencias en P 1 y P 2 resultados encontrados entre los tipos masculinos experimentales, lo que abre la posibilidad de analizar la base genética de la la variación natural en la capacidad competitiva de esperma.

Desde Geoff Parker señaló que la prevalencia de la competencia espermática en los insectos y sus implicaciones evolutivas 2, una oleada de estudios en Drosophila y otras especies han tratado de arrojar algo de luz sobre este fenómeno en muchos niveles diferentes. Algunos ejemplos de las áreas de interés han sido el estudio de la variación de las poblaciones naturales de 9,10, su arquitectura genética subyacente y la relevancia de los factores genéticos 11-14, y su papel en la coevolución entre los sexos 15,16 conducción. En D. hembras melanogaster, la capacidad limitada de los órganos de esperma de almacenamiento especializados, un par de espermateca y el receptáculo seminal 6,17, contribuye a la competencia de los espermatozoides de diferentes machos. Aproximadamente 1.500 espermatozoides se transfieren durante el apareamiento de la hembra, pero sólo ~ 500 pueden alojarse en los órganos mencionados 18,19. En el laboratorio, controlado, doble acoplamiento experimentalciones que implican un hombre de referencia y uno o más machos de interés se han utilizado ampliamente para evaluar la capacidad competitiva de espermatozoides 7,8. Capacidad competitiva de esperma se calcula como la proporción de la progenie engendrado por el macho experimental en los experimentos de doble acoplamiento sobre la progenie total, es decir que a partir de tanto el grupo experimental y los machos de referencia. Capacidad competitiva de esperma comprende dos componentes, cada uno de ellos evaluado en un ensayo separado. En el ensayo de infracción, la capacidad del esperma masculino experimental para desplazar el esperma desde el primer macho, es decir, el macho de referencia, se evalúa. Por el contrario, en el ensayo de defensa, la capacidad del esperma masculino experimental para resistir el desplazamiento o para reducir el éxito de la fertilización de la esperma masculino referencia se evalúa. Dependiendo del tipo de ensayo, la defensa o ataque, la capacidad competitiva de espermatozoides se calcula a través de las puntuaciones de P1 o P2, respectivamente. P1 y P 2 sólo puede tomar valores entre 0 y 1. Los valores intermedios suelen interpretarse como evidencia indirecta de semen mezclado, lo que sugiere una situación fisiológica que implica la competencia de esperma directa. Siguiendo el mismo razonamiento, valores extremos pueden ser interpretados como evidencia de la fuerte diferencial de esperma capacidad competitiva. Los primeros estudios mostraron que P 2 en D. melanogaster es más de 0.8 aumentando a medida que el tiempo transcurrido entre los dos apareamientos alarga 7. Este mismo diseño experimental se ha utilizado en otras especies de Drosophila, P 2 siendo la estadística comúnmente utilizado en los estudios para evaluar la capacidad competitiva de esperma 20. Para la mayoría de las especies, los valores de P 2 de las cepas ensayadas es mayor que 0,6 21. Sin embargo, otros mecanismos no relacionados con la competencia directa entre los espermatozoides de diferentes machos pueden producir resultados idénticos (ver Discusión). Dprogenie istinguishing engendrado por los primeros o segundos machos es posible mediante el uso de marcadores fácilmente identificables. En los primeros estudios, uno de los machos se irradió a dosis subletales de, por ejemplo, rayos-X de tal manera que prácticamente todos los óvulos fertilizados por el esperma irradiado no eclosionó 7. Posteriormente, las mutaciones que alteran la pigmentación de los ojos o la forma del ala han sido los marcadores más utilizados. Ejemplos de los primeros son las mutaciones de peso corporal (marrón) 9, cn (cinabrio) y 22 W (blanco) 23, mientras que la mutación Cy (rizado) 24 se corresponde con el segundo tipo de fenotipos; algunas de estas mutaciones se han combinado en el mismo individuo, por ejemplo, cn peso corporal. En menor medida, alozimas 25 y microsatélites 26,27 con patrones de herencia conocidos también se han utilizado. El diseño experimental para probar las diferencias encapacidad competitiva de esperma se describe aquí sigue esencialmente el de Clark et al. 9. Los resultados derivados de estos experimentos dan información únicamente acerca de la paternidad diferencial de los tipos masculinos experimentales bajo escrutinio. Los ensayos, que también tienen en cuenta las diferencias después de la fertilización en la aptitud 14,28 y técnicas de visualización de esperma 24 permiten a las diferencias en P 1 o P (2) resultados sean interpretados como diferencias en la competencia espermática. La figura 1 resume los fundamentos tanto de la infracción y los ensayos de defensa. Para ilustrar la logística del proceso, un experimento delito lleva a cabo en D. melanogaster 14 se explicará en detalle. Este ensayo delito en particular se utilizó para la prueba de un efecto mensurable de la familia de cadena intermedia dynein esperma específico multigénica (SDIC) de la capacidad competitiva de esperma. Todo el miembros de esta familia multigénica residen en tándem en el cromosoma X. Machos Knockout se generaron mediante la supresión de la agrupación NaDCC. Debido a que el segmento eliminado también incluye el gen esencial ala corta (SW) y el propósito del estudio fue evaluar la relevancia de NaDCC, los machos que llevan la deleción NaDCC-sw fueron rescatados por una copia transgénica de sw (simbolizado como P {sw} , que también llevó a un gen reportero mini-blanco) en el cromosoma 2. Mis ojos se utilizó como un marcador visible para la identificación de paternidad. Todas las moscas estaban en un mutante de fondo blanco con la excepción de los de la cepa Oregon-R, que se utilizaron como referencia los machos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amber latex tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62996-473</td>
			<td>1/4 inch ID, 1/6 inch Wall</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml graduated XL filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mesh Fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thin and smooth</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td>Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FlyStuff Foot Valve, complete system</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121C</td>
			<td>Not necessary if FlyNap is used</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Come with carboard trays that can be reused for holding vials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-212</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td>Found in general grocery store</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Different colors may be used for marking different genotypes</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

assessing differences in sperm competitive ability in drosophila

La competencia entre los machos conespecíficos para fertilizar los óvulos es uno de los mecanismos de selección sexual, es decir, selección que opera en maximizar el número de eventos de apareamiento con éxito en lugar de sobre la supervivencia y la maximización de la viabilidad 1. La competencia de esperma representa la competencia entre los machos después de copular con la misma hembra 2, en el que sus espermatozoides son coincidentes en el tiempo y el espacio. Este fenómeno se ha informado en varias especies de plantas y animales 3. Por ejemplo, silvestres D. hembras melanogaster por lo general contienen esperma 2-3 machos 4. Los espermatozoides se almacenan en órganos especializados con limitada capacidad de almacenamiento, lo que podría dar lugar a la competencia directa de los espermatozoides de diferentes machos 2,5. Comparando los espermatozoides capacidad competitiva de los diferentes machos de interés (tipos masculinos experimentales) se ha realizado a través de la experimentación de doble acoplamiento controladots en el laboratorio 6,7. En pocas palabras, una sola hembra está expuesto a dos machos diferentes consecutivamente, uno masculino experimental y un macho de referencia cruzada de apareamiento. El mismo esquema de apareamiento es seguido utilizando otros tipos masculinos experimentales, facilitando así la comparación indirecta de la capacidad competitiva de su esperma a través de una referencia común. La fracción de individuos engendrados por los machos experimentales y de referencia se identifica usando marcadores, que permite estimar la capacidad competitiva de espermatozoides usando expresiones matemáticas simples 7,8. Además, la capacidad competitiva de esperma puede ser estimado en dos escenarios diferentes dependiendo de si el macho experimental es segundo o primero para aparearse (delito y ensayo de defensa, respectivamente) 9, que se supone que ser el reflejo de diferentes atributos de competencia. Aquí se describe un método que ayuda a interrogar al papel de los diferentes factores genéticos que supuestamente subyacen tque fenómeno de la capacidad competitiva de esperma en D. melanogaster.

La tabla 2 resume algunas de las características más destacadas de dos experimentos delito (ensayos 1 y 2) en el que D. melanogaster machos experimentales con y sin (Tipo I y II, respectivamente) un grupo funcional NaDCC se comparan 14. Después de tomar en cuenta las diferentes incidencias encontradas con algunas repeticiones, 58-83% de las mujeres resultaron ser de carácter informativo, por lo que los recuentos de paternidad de su progenie se podrían utilizar para el cálculo de P 2. Los resultados de las pruebas no paramétricas fueron consistentes con una capacidad competitiva de esperma menor en los hombres sin el cúmulo SDIC (Tipo II), en comparación con los hombres con el grupo intacto (Tipo I) 14. Este patrón fue reproducible a través de los ensayos realizados delito. Una tendencia similar pero no estadísticamente significativa se encontró en los ensayos de defensa realizados en paralelo (no mostrado). Es importante destacar que la ausencia de diferencias de tipo de apareamiento (paso 3.4) descartó la posibilidad de queel genotipo masculino femenino podría afectar el comportamiento de aparearse de nuevo 14. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Ensayo Ofensa </td><td colspan="3"> Ensayo Defensa </td></tr><tr><td> Experimental ♂ Tipo </td><td> w 1118 ♀ </td><td> O-R ♂ </td><td> Experimental ♂ </td><td> w 1118 ♀ </td><td> Experimental ♂ </td><td> O-R ♂ </td></tr><tr><td> Yo </td><td> 60-70 </td><td> 60-70 </td><td> 180-210 </td><td> 60-70 </td><td> 60-70 </td><td> 180-210 </td></tr><tr><td> II </td><td> 60-70 </td><td> 60-70 </td><td> 180-210 </td><td> 60-70 </td><td> 60-70 </td><td> 180-210 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Número de personas requeridas en los experimentos de doble acoplamiento para comparar dos tipos masculinos experimentales. OR-R, Oregon-R. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="5"> ♀ </td><td></td></tr><tr><td> Experimental ♂ Tipo </td><td> Conteo inicial </td><td> No fecundación exitosa con referencia ♂ </td><td> No fecundación exitosa con experimental ♂ </td><td> Problemática 1 </td><td> Informativo (%) </td><td> P 2 2 </td></tr><tr><td> Ensayo 1 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B +(Tipo I) </td><td> 60 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 2 </td><td> 47 (78%) </td><td> 1,000 (1,000-0,987) </td></tr><tr><td> A-(Tipo II) </td><td> 55 </td><td> 1 </td><td> 7 </td><td> 5 </td><td> 42 (76%) </td><td> 0,986 (1,000-0,936) </td></tr><tr><td> Ensayo 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> + I (Tipo I) </td><td> 74 </td><td> 9 </td><td> 7 </td><td> 15 </td><td> 43 (58%) </td><td> 1,000 (1,000-0,979) </td></tr><tr><td> E-(Tipo II) </td><td> 75 </td><td> 3 </td><td> 8 </td><td> 2 </td><td> 62 (83%) </td><td> 0,983 (1,000-0,927) </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Resumen del impacto de diferentes eventos en el número de hembras utilizadas en ensayos de delito realizó para probar las diferencias entre los tipos masculinos experimentales. 1 muerto, escaped durante el ensayo, o dando lugar a un número de crías por debajo de un valor umbral. 2 mediana (rango intercuartil). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50547/50547fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig1.jpg" /> Figura 1. Diseño experimental para el delito y los ensayos de defensa. El código de color utilizado para cada genotipo indica el color de los ojos de la mosca adulta. Oregon-R machos se utilizan como referencia para comparar indirectamente la capacidad competitiva de esperma de dos machos experimentales: uno que lleva la forma de tipo salvaje del factor genético en estudio (Tipo I) y uno en el que la funcionalidad del factor genético ha sido perturbado (Tipo II). El clúster NaDCC, el factor genético en este caso, se encuentra en el cromosoma X, mientras que el sw transgén se encuentra en el cromosoma 2. Los experimentos representados son parte de las que se realizan en <shasta&gt; 14. Df (SDIC, sw), la deficiencia incluida la familia multigénica SDIC y sw gen adyacente. Y, el cromosoma Y, P {sw}, transgén; w 1118, un alelo mutante del gen blanco. <img alt="La figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50547/50547fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig2.jpg" /> Figura 2. La identificación del sexo en D. melanogaster. (A) dorsal, (B) lateral, y (C) vista ventral de 1 hr viejas hembras (izquierda) y machos (derecha) anestesiados con CO2 bajo el microscopio estereoscópico. Los genitales masculinos es mucho más pigmentada que la placa vaginal dando lugar a una mancha oscura aparente, lo que es el personaje más fiable que se utilizará para determinar el sexo. Además, el tarso de las patas delanteras hombres poseen una franja oscura de cerdas (sexo peine) ausente en elfemenina. (D) la identificación de género fiable y rápida de las moscas mayores a simple vista es muy recomendable cuando se transfieren a viales de individuos que utilizan aspiradores. En los adultos mayores, hombres abdomen dorsal es mucho más oscuro que el de la hembra. Las hembras son generalmente más grandes y tienen un abdomen más pálido que los machos. El ovipositor hace que el abdomen de una mujer señaló. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig3.jpg" /> Figura 3. Papel multi-plegada utilizado para aumentar la superficie disponible para deambular larvas. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50547/50547fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig4.jpg" /> La Figura 4. Esquema del experimento de ensayo a las diferencias en la capacidad competitiva de esperma en D. melanogaster. apareamiento Misa durante 2 horas con vir<html> ginebra w hembras 1118 y Oregon-R varones se inician cada día durante 5 días. En cada apareamiento masa, una vez terminado, 12-14 hembras deben ser aspiradas por separado en viales individuales (v1). Dos días más tarde, cada hembra se transfiere a un nuevo vial (v2) junto con tres machos experimentales del mismo genotipo. Estos individuos pueden aparearse durante la noche. Los varones se descartan después de ~ 12 horas mientras que las hembras pueden poner huevos durante 2 días. Posteriormente, las hembras se transfieren a nuevos viales (v3), se dejó oviposit otra vez, y finalmente desecharse después de 3 días. Trece de los quince y los 17 días después de las hembras empezaron a poner huevos tanto en v2 y v3, progenie engendrada por la experimentación y los machos de referencia se identificaron utilizando marcadores adecuados y registrados. Después de las progenies en V2 y V3 son inspeccionados dos veces, los viales se descartan. Flecha hacia abajo, los individuos descartados, símbolo del ojo, la inspección vial. Adaptado de 9.d/50547/50547fig4large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande la figura. <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig5.jpg" /> Figura 5. Aspirador flexible. Montado en tubo de látex de color ámbar, uno 1 ml graduada punta para recibir las moscas y otros funcionan como aparato bucal desechable. Para evitar que las moscas sean succionados al interior del tubo, tela de malla fina se utiliza para proteger la mosca de la recepción de la punta en la unión al tubo. <img alt="La figura 6" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50547/50547fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50547/50547fig6.jpg" /> La Figura 6. Fenotipos esperados en la progenie de la prueba de delito. Izquierda y derecha, cruza para evaluar la capacidad competitiva de esperma de control y knock-out machos respectivamente. Genotipo y color de los ojos de parentales y progenie de dos fse muestran athers. Debido a los marcadores genéticos particulares utilizados en este ensayo, sólo la progenie hembra puede ser utilizado para el cálculo de P 1 (o P 2) puntuaciones (véase el texto para más detalles); parte de la progenie macho engendrado por el macho experimental es de color blanco y con los ojos . tanto fenotípicamente indistinguibles de la progenie masculina del varón referencia Df, deficiencia, P {sw}, transgén,. w alelo mutante 1118 del gen blanco <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50547/50547fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

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Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Diferencial espermatozoides capacidad competitiva entre<em&gt; Drosophila</em&gt; Machos con genotipos distintos se pueden determinar a través de experimentos de doble contacto. Cada uno de estos experimentos consiste en uno de los machos de interés y un macho de referencia. Marcadores fácilmente identificables en la progenie permiten la inferencia de la fracción de individuos engendrados por cada macho.

Diferencias Evaluación de Capacidad Competitiva de espermatozoides en<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

assessing-differences-in-sperm-competitive-ability-in-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

14.6K vistas.  University of California, Irvine. Diferencial espermatozoides capacidad competitiva entre Drosophila Machos con genotipos distintos se pueden determinar a través de experimentos de doble contacto. Cada uno de estos experimentos consiste en uno de los machos de interés y un macho de referencia. Marcadores fácilmente identificables en la progenie permiten la inferencia de la fracción de individuos engendrados por cada macho.

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Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescencia In situ</emHibridación> (FISH) Protocolo en el esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Investigación

Biología

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Técnicas de Imagen Ca 2 + Señalización en el esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualización y seguimiento de ARNm endógenos en cámaras de huevo Drosophila melanogaster en vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Rendimiento medio de selección de ensayos para la evaluación de efectos sobre la Ca2 +-señalización y reacción acrosómica en espermatozoides humanos

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...