Questo lavoro è stato sostenuto da NIH DC009613, il Programma scientifico frontiera umana e Morley cura Fellowship (JR).

1. Il programma di installazione di registrazione La camera di registrazione è montata su un microscopio invertito Nikon TE2000U Eclipse con ottica di contrasto di fase che è montato su un tavolo aria e schermati elettricamente usando una gabbia di Faraday. La camera di registrazione Plexiglass consiste di due sezioni parzialmente separate da una barriera e incollato su un vetrino silanizzato. Una sezione della camera è utilizzato per regolare le cellule, mentre l&#39;altro viene utilizzato per stimolo-esposizione durante la registrazione per ridurre al minimo l&#39;esposizione prematura di una consolidata ma ancora non utilizzate cellule odorizzante. La configurazione di registrazione consiste di una pipetta di aspirazione (vedi sotto) montato su un supporto pipetta pellettato e un elettrodo di massa. La pipetta di aspirazione è posizionato utilizzando un micromanipolatore. Le soluzioni stimolo vengono applicati usando una tripla canna tubo quadrato di vetro, con ogni tubo quadrato essendo 0,7 millimetri x 0,7 mm. Il triplo cilindro in vetro è stato collegato ad un motore passo-veloce sistema di perfusione montato su un manipolatore (Sutter SF-77B, Warner Instruments) ed entra in camera di registrazione ad un angolo di ~ 45 °. La fine della canna triplo vetro è smussata ad un angolo di 45 ° ancora tale che la faccia finale (apertura) del triplo cilindro in vetro era verticale per consentire il posizionamento stretta della pipetta. L&#39;elettrodo pipetta di aspirazione riempito con soluzione standard di Ringer mammiferi e l&#39;elettrodo di massa sono collegati al headstage 1 GΩ di un amplificatore patch clamp (PC-501A, Warner Instruments) in modalità voltage clamp. Il segnale analogico proveniente dall&#39;amplificatore (filtro passa basso a 5 kHz) viene visualizzato su un oscilloscopio digitale per monitorare il segnale in tempo reale ed è anche collegato ad un 8 poli del filtro di Bessel (Krohn-Hite) dove il segnale è basso filtro passa a 50 Hz. Entrambi i segnali (filtro passa basso a 5 kHz e 50 Hz) sono alimentati in un convertitore A / D (Cambridge Electronic Design Micro mkII 1401) che è collegato ad un PC per l&#39;acquisizione dati. I dati vengono registrati tramite segnale 3 ACQuisition software (Cambridge Electronic Design) ad una frequenza di campionamento di 10 kHz. Il segnale viene registrato in due diverse ampiezze di banda prima di registrare il recettore corrente unitamente ai potenziali di azione sovrapposti e quindi il recettore corrente solo (vedere Fig. 2). Il sistema di perfusione viene utilizzato per commutare rapidamente tra Ringer (controllo) e soluzione di stimoli olfattivi o qualsiasi soluzione di composizione desiderata ed è controllato dal PC e Signal 3 software. Le soluzioni sono contenuti in 60 ml siringhe e la portata viene controllata da medicale regolatori di flusso per via endovenosa. Tipicamente, la portata viene impostato a 1 ml / min. L&#39;aspirazione sul pipetta registrazione viene controllato nel modo seguente: La porta lato del supporto pipetta è collegato ad una linea di olio che a sua volta è collegato ad una altezza regolabile serbatoio dell&#39;olio. Alzando o abbassando il serbatoio assicura che la pressione pipetta e quindi il flusso Ringer attraverso la punta del pipette è minima e leggermente positivo. Aspirazione supplementare o pressione può essere applicato attraverso un tubo collegato allo spazio aereo del serbatoio con un bocchino all&#39;altra estremità di succhiare il corpo cellulare di un ORN isolato nella punta della pipetta registrazione. Gli esperimenti vengono eseguiti a 37 ° C per simulare la condizione nativa strettamente fisiologico della cellula. La temperatura è controllata passando le soluzioni attraverso una misura unità di riscaldamento che consiste di resistori ceramici che sono passati attraverso tubi in acciaio inox contenenti le soluzioni 10. La temperatura è controllata mediante un termometro a termocoppia (Fluke). 2. Soluzioni Ringer soluzione di mammifero (mM): 140 NaCl, KCl 5, 1 MgCl2, 2 CaCl 2, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 10 glucosio. Il pH è stato regolato a 7,5 con NaOH. A 10% diluita Ringer soluzione è stata usata per misurare la corrente di giunzione. Odorasoluzioni nt: Acetofenone e eugenolo sono stati preparati tutti i giorni in soluzione di Ringer dalle scorte mm 20 DMSO. 3. Fare Elettrodi <ol><li> Inserire un vetro borosilicato unfilamented capillare in un P-97 Sutter estrattore micropipetta e tirare una micropipetta con un cono lungo. </li><li> Trasferire la pipetta con una misura titolare micropipetta montato su un microscopio Nikon Eclipse E200 che è a sua volta dotato di un reticolo nell&#39;oculare e un coltello mobile diamante montato sulla scena. </li><li> Osservare la punta della pipetta all&#39;obiettivo 20x e utilizzando il reticolo come guida; delicatamente scrivano la pipetta a 90 ° con la misura in cui il coltello di diamante pipetta è di 10 micron di larghezza (diametro esterno). </li><li> Spostare il coltello di diamante più verso la punta e applicare gradualmente la pressione sulla punta con il coltello di diamante. La punta della pipetta deve rompere in modo pulito al punto in cui è stato descritto esso. </li></ol> In alternativa, i passaggi da 3.1 a3,4 possono essere combinati e pipette può essere tirato con dimensioni desiderate direttamente, senza dover tagliare la punta della pipetta, anche se può risultare più difficile da tirare affidabile pipette con un diametro grande punta e bordi tagliati pulito. <ol start="5"><li> Sotto un obiettivo 40x, fuoco lucidare la punta della pipetta per un diametro interno di 5 pm usando un filamento riscaldato elettricamente. Una volta terminata, la micropipetta è pronto per essere utilizzato per correnti di registrazione dalla ORNs topo. La resistenza pipetta aperto dovrebbe essere di circa 1 MW quando è riempita di Ringer. </li></ol> 4. Isolamento dei neuroni recettori olfattivi <ol><li> Sacrifica un mouse seguendo le linee guida istituzionali e normative. Togliere la testa, staccarsi la pelle che ricopre il cranio e medialmente dividono in due la testa lungo la linea mediana. </li><li> Posizionare i due emi-testa sotto uno stereomicroscopio da dissezione, tirare fuori il setto nasale e rimuovere i turbinati olfattive. Posizionare tutti i tessuti in una piastra di Petri con c glucosioontaining soluzione Ringer mammiferi. </li><li> Sbucciare l&#39;epitelio olfattivo fuori la cartilagine sottostante da due turbinati e trasferire il tessuto in una provetta Eppendorf contenente 250 microlitri Ringer. Usiamo tessuto da 2 turbinati per ottenere la giusta densità di celle per la dimensione della nostra camera di registrazione. Conservare il restante tessuto a 4 ° C per un uso successivo. </li><li> Vortex la provetta Eppendorf contenente l&#39;epitelio olfattivo brevemente per due volte per 1 sec a velocità media. Questo passaggio porta alla dissociazione meccanica delle ORNs dall&#39;epitelio. </li><li> Posizionare la soluzione Ringer contenente le ORNs dissociate nella camera di registrazione. Rimuovere grandi pezzi di tessuto anche presenti nella sospensione utilizzando una pinza sottile. </li><li> Lasciate che i ORNs accontentarsi di 20 minuti prima di iniziare superfusione continua con Ringer e procedere alle registrazioni. </li></ol> 5. Registrazioni <ol><li> Abbassare l&#39;elettrodo di aspirazione collegato alla linea di olio nella camera di registrazione e regulmangiato l&#39;altezza del serbatoio dell&#39;olio per stabilire pressione leggermente positiva sulla punta della pipetta. Questo può essere fatto osservando detriti es cella allontanando da (pressione positiva) o verso (pressione negativa) della pipetta. Cercate di non contaminare la punta della pipetta con detriti cellulari. </li><li> Scansione camera di registrazione per un ORN isolato che può essere riconosciuto dalla sua morfologia tipica bipolare utilizzando un ingrandimento di 20-40x. Spostare l&#39;elettrodo di registrazione in prossimità del corpo cellulare ORN. Delicatamente iniziare a succhiare in modo che il corpo cellula entra nella punta della pipetta. Attentamente e lentamente continuare ad applicare l&#39;aspirazione finché il corpo intera cella viene aspirato nella punta della pipetta di aspirazione, lasciando il dendrite e ciglia esposto alla soluzione del bagno. Per le immagini di ORNs aspirati e forme pipetta vedere 7,11. Assicurare che una volta non si effettua l&#39;aspirazione, l&#39;ORN non si muove dentro o fuori della pipetta. Se è così, regolare l&#39;altezza del serbatoio dell&#39;olio conseguenza. </li><li> Utilizzando ilmicromanipolatori, spostare la pipetta di aspirazione dalla sezione contenente le ORNs regolate alla sezione della camera di registrazione. Posizionare accuratamente la pipetta di aspirazione davanti alla canna 3-tubo per lo scambio di soluzione. La pipetta di aspirazione deve essere posizionato abbastanza vicino all&#39;apertura del 3-canna tubo in modo che il ORN è esposto ad un flusso laminare evitando turbolenze e miscelazione per ottenere scambio veloce soluzione. Lo scambio soluzione si ottiene intensificando l&#39;interfaccia tra flussi paralleli di soluzione fluisce attraverso la punta della pipetta di aspirazione. L&#39;andamento temporale del cambio soluzione è tipicamente circa 20 ms, misurata dalla corrente giunzione evocato dal passo della cella tra soluzioni di diversa composizione ionica (vedi fig. 2). Le soluzioni sono forniti da gravità. </li></ol> &lt;class span = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; 6. Risultati rappresentativi <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg" /> Figura 1. A) recettori neuroni bipolari nel bulbo olfattivo. B) trasduzione del segnale in macchina le ciglia alla fine porta a eccitatori afflusso di corrente. La depolarizzazione conseguente generazione attiva potenziale d&#39;azione al corpo cellulare. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg" /> La figura 2 mostra la velocità e l&#39;affidabilità del cambio soluzione. Una pipetta è stata rafforzata dal normale 10% in Ringer diluito per 100 ms e la corrente di giunzione risultante dalla concentrazione di ioni dissimile è stato registrato. Nero traccia è l&#39;averabbia su 5 prove, rosso rintracciare la sua SD. La piccola modifica in SD durante il cambio soluzione dimostra l&#39;affidabilità del cambio soluzione da prova a prova e la mancanza di rumore in eccesso in uno dei flussi soluzione. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg" /> La figura 3 mostra una eugenolo indotta risposta da un ORN utilizzando la tecnica della pipetta di aspirazione. La ORN stato esposto a 100 pM eugenolo per 1 secondo, come indicato dalla barra sopra la registrazione. In Fig. 3A (traccia nera) la corrente recettore è stato filtrato con una banda passante 0 - 50 Hz per visualizzare solo il recettore corrente Fig.. 3B mostra la stessa registrazione, ora filtrata alla larghezza di banda larga di 0 - 5000 Hz (traccia rossa) per visualizzare anche potenziali d&#39;azione (AP, indicato dalle frecce). L&#39;inserto mostra la traccia stessa in un lasso di tempo esteso per visualizzare AP più chiaramente al momento della comparsa della risposta. <img alt="Figura 4." src = &quot;/ files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4. Risposta famiglia Dose di eugenolo ORN-reattiva (A). Eugenolo è stato utilizzato a concentrazioni comprese tra 0,3 pM a 100 pM, la durata era uno stimolo s e tracce stati filtrati a 0 - 50 Hz. Un progressivo aumento della concentrazione di odorizzante portato ad una risposta più ampia e più veloce, che termina anche più lentamente dopo l&#39;esposizione odorizzante è stata terminata. ORNs può visualizzare un pattern oscillatorio risposta durante stimolazioni lunghe concentrazioni di odorizzante intermedi (Fig. 4B). Ecco un (3 micron) ORN acetephenone reattiva è stata stimolata per 8 secondi. Dopo una risposta rapida e transitoria picco all&#39;inizio della stimolazione di una serie di piccoli, risposte ricorrenti sono osservati. La larghezza di banda di registrazione è stato 0 - 50 Hz.

<ol>
	<li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology:+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding.">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li><li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects:+differences+and+commonalities.">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+retinal+rods+to+single+photons.">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li><li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors.">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).</li><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-dependent+Ca2++extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li><li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells.">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13 (1999).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2++concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<p class="jove_content"&gt; La tecnica pipetta di aspirazione è un metodo elettrofisiologico che viene utilizzato per registrare l&#39;odore indotta corrente lenta recettore e le potenziali veloce azione bifasici da un ORN simultaneamente. Poiché la membrana plasmatica della cellula non è violato, questo metodo lascia l&#39;ambiente intracellulare indisturbata garantire che le risposte odorizzante non sono alterati a causa di cambiamenti delle concentrazioni degli ioni citoplasmatici o di diluizione di fattori intracellulari. Le cellule possono essere registrati da per lunghi periodi (fino a 4 ore in rana e 1 h nel topo). Un altro vantaggio di questa tecnica è, in quanto il corpo cellulare è all&#39;interno della pipetta di registrazione, che lo stimolo viene erogata soltanto alla parte apicale del ORN, cioè le ciglia e manopola dendritico (come è il caso<em&gt; In vivo</em&gt;) Eliminando così eventuali effetti non specifici che potrebbero insorgere se l&#39;intera cella sono stati esposti. Inoltre, poiché la cella è relativamente ben protetto da seduto stabilmente nella punta dei tassi soluzione, ad alta portata, pipette e modifiche soluzione così veloce può essere ottenuto rispetto ad una configurazione a tenuta di registrazione dove portate elevate può facilmente provocare la perdita di tenuta . Al contrario, poiché l&#39;accesso intracellulare non è acquisita, questa tecnica non può essere utilizzata per voltage-clamp della cellula, ad esempio, di studio correnti voltaggio-dipendenti. Inoltre, poiché si tratta di un loose-tenuta tecnica, le registrazioni sono sensibili ai disturbi elettrici che potrebbero derivare da varie fonti. Si deve prestare attenzione a garantire che il supporto dell&#39;elettrodo è pulito e non rivestite in sali / soluzione di Ringer in modo da evitare di essere elettricamente conduttivo che può essere una potenziale fonte di rumore. Inoltre, tutti a terra delle apparecchiature e la gabbia di Faraday deve essere fatto attentamente.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; La dimensione e la consistenza della punta della pipetta è molto importante come qualsiasi mancanza di simmetria nell&#39;apertura può causare una scarsa tenuta tra il corpo cellulare e la pipetta. Inoltre, la dimensione dell&#39;apertura è cruciale. Una punta troppo grande per l&#39;ORN aspirata può risultare in una tenuta molto sciolto lasciando le registrazioni anche più vulnerabili al rumore e alla ORN anche essere perso durante la registrazione. Una punta troppo piccola può spremere la cella troppo stretta, causando danni e durata della registrazione brevi. La stessa pipetta può essere utilizzato per la registrazione da più celle, se la punta viene bloccato da detriti, deve essere pulito con un ultrasonicatore, altrimenti una nuova pipetta deve essere utilizzato.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Air tavolo </td><td> attrezzatura </td><td> Newport </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pompa </td><td> attrezzatura </td><td> Newport </td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td> Pipettare Puller </td><td> attrezzatura </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro borosilicato </td><td> attrezzatura </td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Eclipse Microscopio invertito </td><td> attrezzatura </td><td> Nikon </td><td> TE2000U </td><td> Dotato di lampada Hg, GFP filtro e obiettivi 20X e 5X almeno </td></tr><tr><td> Amplificatore PC-501A </td><td> attrezzatura </td><td> Ammonitore </td><td> 64-0008 </td><td> Headstage 1 GΩ </td></tr><tr><td> Diamante coltello </td><td> Attrezzatura </td><td> Fatto su misura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digitizer Mikro1401 A / D </td><td> attrezzatura </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Unità filtro 3382 </td><td> attrezzatura </td><td> Krohn Hite società </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Segnale </td><td> software </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stampato Ag / AgCl Pellet </td><td> attrezzatura </td><td> WPI </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettare titolare </td><td> attrezzatura </td><td> Ammonitore </td><td> 64-0997 </td><td> Personalizzato modificati per adattarsi headstage </td></tr><tr><td> Registrazione camera di </td><td> Attrezzatura </td><td> Fatto su misura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipolatore MP85-1028 </td><td> attrezzatura </td><td> Sutter Instrument </td><td> Micromanipolatore MP85-1028 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> Olio minerale </td><td> Soluzione </td><td> Sigma </td><td> 330.779-1L </td><td></td></tr><tr><td> Oscilloscopio TDS 1001 </td><td> attrezzatura </td><td> Tektronix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tre-canna tubo di vetro quadrato </td><td> Attrezzatura </td><td> Ammonitore </td><td> 64-0119 </td><td> 0,6 mm ID, 5 cm </td></tr><tr><td> Valvola </td><td> attrezzatura </td><td> La Lee Società </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ValveLink 8,2 </td><td> attrezzatura </td><td> Automatizzare scientifico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SF-77B passo perfusione veloce </td><td> attrezzatura </td><td> Ammonitore </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique

Animali campionare l&#39;ambiente intorno odorosa attraverso i sistemi chemiosensoriali situati nella cavità nasale. Segnali chemiosensoriali influenzare comportamenti complessi come la scelta degli alimenti, predatore, conspecifici e il riconoscimento mate e altri segnali socialmente rilevanti. Neuroni recettori olfattivi (ORNs) sono situati nella parte dorsale della cavità nasale incorporato nell&#39;epitelio olfattivo. Questi neuroni bipolari inviare un assone al bulbo olfattivo (vedi fig. 1, Reisert &amp; Zhao 1, originariamente pubblicato nella Gazzetta di Fisiologia Generale) e di estendere un singolo dendrite al confine epiteliale da cui si irradiano le cilia nel muco che copre l&#39;olfatto epitelio. Le ciglia contiene il macchinario di trasduzione del segnale che porta infine al eccitatori afflusso di corrente attraverso i canali di trasduzione ciliari, un ciclico nucleotide-gated (CNG) e un canale Ca 2 +-attivata Cl - canale (Fig. 1). Il depola conseguenterizzazione innesca generazione potenziale d&#39;azione al corpo cellulare 2-4. In questo video si descrive l&#39;uso della &quot;tecnica di aspirazione pipetta&quot; per registrare odorizzante risposte indotte da ORNs. Questo metodo è stato originariamente sviluppato per registrare da bastoncelli 5 e una variante di questo metodo può essere trovato alla jove.com modificato per registrare da fotorecettori cono del mouse 6. La tecnica pipetta di aspirazione è stato in seguito adattato per registrare anche da ORNs 7,8. Brevemente, dopo dissociazione dell&#39;epitelio olfattivo e isolamento cellulare, il corpo intera cella di un ORN viene aspirato nella punta di una pipetta di registrazione. Il dendrite e le ciglia rimangono esposti alla soluzione del bagno e quindi accessibili a soluzione cambia per abilitare odorizzante es o applicazione bloccante farmacologica. In questa configurazione, nessun accesso all&#39;ambiente intracellulare viene acquisita (non whole-cell voltage clamp) e la tensione intracellulare rimane libero di variare. Tutto questodeve il la registrazione simultanea della corrente recettore lento che ha origine alla ciglia e potenziali d&#39;azione veloci generati dal corpo cellulare 9. La differenza nella cinetica tra questi due segnali permette loro di essere separati mediante diverse impostazioni di filtro. Questa tecnica può essere utilizzato su qualsiasi tipo selvaggio o di topo knockout o per registrare selettivamente da ORNs anche che esprimono GFP etichettare specifici sottoinsiemi di ORNs, ad esempio esprimere un recettore olfattivo dato o canale ionico.

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Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Neuroni recettori olfattivi (ORNs) convertire i segnali olfattivi prima in un recettore corrente che a sua volta attiva i potenziali d&#39;azione che vengono trasmessi ai neuroni di secondo ordine nel bulbo olfattivo. Qui si descrive la tecnica pipetta di aspirazione di registrare simultaneamente l&#39;odorizzante indotta recettore correnti e potenziali d&#39;azione da ORNs mouse.

Odorizzante indotte risposte registrate da neuroni recettori olfattivi con la tecnica della pipetta di aspirazione

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

odorant-induced-responses-recorded-from-olfactory-receptor-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Views.  Monell Chemical Senses Center. Neuroni recettori olfattivi (ORNs) convertire i segnali olfattivi prima in un recettore corrente che a sua volta attiva i potenziali d'azione che vengono trasmessi ai neuroni di secondo ordine nel bulbo olfattivo. Qui si descrive la tecnica pipetta di aspirazione di registrare simultaneamente l'odorizzante indotta recettore correnti e potenziali d'azione da ORNs mouse.

Video: Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l&#39;aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

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Neuroscienze

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

L&#39;applicazione di una conduttanza recettore NMDA nei neuroni dopaminergici mesencefalo Rat Utilizzando la tecnica dinamica morsetto

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

Le misurazioni elettrofisiologiche da un sistema olfattivo Moth

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o Umani

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

High-throughput Analisi dei mammiferi olfattive Recettori: Misurazione del recettore Attivazione tramite Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...