この作品は、NIH DC009613、ヒューマンフロンティア·サイエンス·プログラムとモーリーケアフェローシップ（JRに）によってサポートされていました。

1。録画設定記録室はエアテーブル上に取り付けられ、電気的にファラデーケージを使用してシールドされている位相差光学ニコンTE2000U Eclipseの倒立顕微鏡に搭載されている。プレキシガラスの記録室には2つのセクションが部分的障壁によって分離し、シラン化スライドガラス上に接着で構成されています。他の着臭剤にはまだ決着が使用されていない細胞の早期の曝露を最小限にするために記録中に刺激露光に使用されている間、チャンバの1つのセクションのセルを解決するために使用されます。録画設定をペレットピペットホルダ及び接地電極に取り付けられた吸引ピペット（下記参照）で構成されています。吸引ピペットはマイクロマニピュレーターを使用して配置されています。スティミュラス·ソリューションは、それぞれの正方形の管が0.7ミリメートル×0.7ミリメートルであることと、トリプルバレルガラス正方形の管を使用して適用されます。トリプルバレルガラスがマニピュレータに搭載された電動の高速ステップ灌流システム（SUTに接続されていたTER SF-77B、ワーナー·インスツルメンツ）や〜45°の角度で記録室に入った。トリプルバレルガラスの端はトリプルバレルガラスの最終面（開口部）がピペットの緊密な位置決めを可能にするために、垂直となるように再び45°の角度で面取りした。 標準哺乳類リンゲル液及び接地電極でいっぱい吸引ピペット電極電圧クランプモードでパッチクランプアンプの1GΩヘッドステージ（PC-501A、ワーナー·インスツルメンツ）に接続されている。アンプ（5kHzでローパスフィルタ）からのアナログ信号は、リアルタイムで信号を監視するためにデジタルオシロスコープに表示され、また信号がLow通過フィルタ処理されている8極ベッセルフィルタ（クルーン-ハイト）に接続されている50 Hzで。両方の信号は（5 kHzと50 Hzのローパスフィルタ）データ取得のためにPCに接続されているA / Dコンバータ（ケンブリッジ電子設計マイクロ1401 mkIIの）に供給される。データは、信号3 ACQを使用して記録されている10kHzのサンプリング周波数でuisitionソフトウェア（ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン）。信号は最初のレコードに2つの異なる帯域幅重畳活動電位とその後単独で現在の受容体と一緒に現在の受容体（ 図2参照 ）で記録されます。灌流システムはリンガー（コントロール）ソリューションと匂い物質刺激または所望の組成の任意の解決策の間で急速に切り替えるために使用して、PCおよびシグナル3ソフトウェアによって制御されます。ソリューションは60ミリリットルの注射器に含まれており、流量は医療グレードの静脈フローレギュレータによって制御されます。一般的に、流量は1ml /分に設定されています。 記録ピペットで吸引は、次の方法で制御されます。ピペットホルダーのサイドポートが順番に高さ調節可能なオイルタンクに接続されているオイルラインに接続されている。貯水池を上げるか、下げるとPの先端を介して、そのピペット圧力、したがってリンガーの流れを確実にipetteは最小限とわずかに正である。追加の吸引または圧力が記録ピペットの先端に孤立ORNの細胞体を吸うためにもう一方の端でマウスピースと貯水池の空域に接続されたチューブを介して適用することができます。 実験は密接に細胞の本来の生理的状態をシミュレートするために、37℃で行われる。温度は、溶液を含有するステンレス鋼管が10を通過されるときに通過するセラミック抵抗から構成されてカスタムメイドの加熱ユニットによるソリューションを渡すことによって制御される。温度は熱電対温度計（フルーク）を使用して監視されています。 2。ソリューション哺乳類リンゲル液（MM）：140のNaCl、5mMのKCl、1 MgCl 2を 、2のCaCl 2、0.01 EDTA、10mM HEPES、10mMグルコース。 pHはNaOHで7.5に調整した。 10パーセント希釈のリンゲル液は、接合電流を測定するために使用された。 OdoraNTソリューション：アセトフェノンとオイゲノールを20mM DMSOストックからリンゲル液で毎日調製した。 3。電極を作る<ol><li>サッターのP-97マイクロピペットプラーの毛細血管unfilamentedホウケイ酸ガラスを置き、長いテーパーでマイクロピペットを引き抜きます。 </li><li>接眼レンズとステージ上に取り付け可動ダイヤモンドナイフでレチクルを装着し、順番にあるニコンE200のEclipseの顕微鏡に搭載されたカスタムメイドのマイクロピペットホルダーにピペットを転送します。 </li><li> 20倍対物レンズ下にピペットの先端を観察し、レチクルをガイドとして使用して、穏やかにスクライブピペットは10μm幅（外径）である場合、カスタムメイドのダイヤモンドナイフを使用して90°の角度でピペット。 </li><li>先端に向かってさらにダイヤモンドナイフを動かして、徐々にダイヤモンドナイフで先端に圧力をかける。ピペットチップは、それがスクライブされた時点ではきれいに破ってはならない。 </li></ol>あるいは、3.1へのステップを3.4を組み合わせることができ、それがこのような大規模な先端径ときれいにカットエッジで確実にピペットを引くのは難しい証明することができますが、ピペットは、ピペットの先端をカットすることなく、直接所望の寸法で引っ張ることができます。 <ol start="5"><li> 40X目的の下で、電気的に加熱されたフィラメントを用いた5μmの内径にピペットの先端を磨いて発射。完了したら、マイクロピペットは、マウスORNsからの電流を記録するために使用する準備ができました。リンゲル液で満たされたときに開いてピペット抵抗は1MΩ前後となるはずです。 </li></ol> 4。嗅覚受容ニューロンの分離<ol><li>制度ガイドラインと規則に従ってマウスを生け贄に捧げる。 、ヘッドを取り外し剥がれ皮膚が頭蓋骨を覆うと内側に正中線に沿って頭を二等分する。 </li><li>解剖顕微鏡下で2つの半頭を置き、鼻中隔をやってのけると嗅覚の甲を削除します。グルコースcでシャーレ内のすべての組織を置く哺乳類リンゲル液をontaining。 </li><li> 2甲から、基礎となる軟骨オフ嗅上皮をむき、250μlのリンガーを含むエッペンドルフチュー​​ブに組織を移す。私達は私達の記録室のサイズのセルの右密度を得るために2甲から組織を使用しています。 ℃で後で使用するために4時に残りの組織を保管してください。 </li><li>渦、中程度の速度で1秒間二回短く嗅上皮を含むエッペンドルフチュー​​ブ。このステップでは、上皮からORNsの機械的解離につながる。 </li><li>録音室で解離ORNsを含むリンゲル液を置きます。細かい鉗子を用いて懸濁液中にも存在する組織の大部分を削除します。 </li><li> ORNsはリンガーで連続灌流を開始する前に20分間静やレコーディングに進みましょう。 </li></ol> 5。録音<ol><li>録音室にオイルラインに接続されており、regul吸引電極を下げる石油貯留層の高さは、ピペットの先端でわずかに陽圧を確立するために食べました。これは、ピペットから（正圧）または（負圧）に向かって遠ざかっ例えば細胞の破片を観察することによって行うことができます。細胞破片とピペットの先端を汚染しないようにしよう。 </li><li> 20-40Xの倍率を使用して、その代表的なバイポーラ·形態によって認識することができる孤立ORNの録音室をスキャンします。 ORN細胞体の近接に記録電極を移動します。穏やかに細胞体がピペットの先端に入るようにしゃぶり始める。慎重に、かつ徐々に全体の細胞体を浴溶液にさらされる樹状突起や繊毛を残し、吸引ピペットの先端に引き込まれるまで吸引を引き続き適用されます。吸い込まORNsとピペットの形状のイメージについては7,11を参照してください。全く吸引が適用されていません一度、ORNは、ピペットの中で移動したり、出ていないことを確認します。そうだとすれば、それに応じてオイル溜まりの高さを調整します。 </li><li>使い方マニピュレーターは、チャンバの記録部に定住ORNsを含むセクションから吸引ピペットを移動します。溶液交換のための3銃身の筒の前に吸引ピペットを慎重に配置します。 ORNは、このように混合乱流を避ける層流にさらされていると高速溶液交換を達成するように、吸引ピペットは十分近い3銃身の管の開口部に配置しなければなりません。溶液交換を吸引ピペットの先端を流れる液のパラレル·ストリームの間のインタフェースを踏むことによって達成されます。溶液交 ​​換の時間経過は、典型的には、異なるイオン組成の解の間のセル（ 図2参照 ）ステッピングによって誘発接合電流から測定された約20 msである。ソリューションは、重力によって配信されます。 </li></ol> &lt;スパンクラス= &quot;pdflinebreak&quot;&gt; 6。代表的な結果<img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg" /> 嗅球における図1）バイポーラ受容ニューロン。 B）の繊毛におけるシグナル伝達機構は、最終的に現在の流入を興奮につながる。その後の脱分極は細胞体における活動電位の発生をトリガーします。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg" /> 図2は、溶液交 ​​換の速度と信頼性を示しています。ピペットは、通常から100ミリと異なるイオン濃度が記録されたから得られる電流接合のための10％希釈リンガーに足を踏み入れた。黒のトレースはaveのです5試験の激怒、赤はそのSDをトレースします。溶液交換時にSDにはほとんど変化がトライアルからトライアルに溶液交換の信頼性といずれかのソリューション·ストリーム内の過剰雑音の欠如を示しています。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg" /> 図3は、吸引ピペット技術を用いて、ORNからオイゲノール誘発性応答を示しています。記録上のバーで示されるようORNは1秒間100μMのオイゲノールにさらさ​​れていた。 図。 3A（黒のトレース）は、現在の受容体は幅0でろ過した-現在使用中の受容体を表示するには、50 Hzの図。 （APは、矢印で示されている）も、活動電位を表示するには、5000 Hzの（赤いトレース） - （b）は、現在0の広い帯域でフィルタリングし、同じ記録を示しています。挿入図は、応答の開始時に、より明確にAPを視覚化するために拡大スケールで同じトレースを示しています。 <img alt="図4。" srC = &quot;/ files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg&quot; /&gt; オイゲノール応答性ORNの図4。用量反応家族（）。オイゲノールを0.3μMから100μMの範囲の濃度で使用された、刺激の持続時間は1秒であったとトレースは0でろ過された - 50 Hzです。着臭剤濃度の漸進的増加は、匂い物質への暴露が終了しましたら、またもっとゆっくり終了し、より大型で高速応答、につながった。 ORNsは中間着臭剤濃度（ 図4B）で長時間刺激時の振動応答パターンを表示することができます。ここacetephenone（3μM）応答ORNは8秒間刺激した。刺激の発症小さく、繰り返し応答の一連の高速性と過渡応答のピークの後に観察されています。 50 Hzの - 記録帯域は0でした。

<ol>
	<li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on:+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology:+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding.">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li><li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects:+differences+and+commonalities.">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+retinal+rods+to+single+photons.">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li><li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors.">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).</li><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-dependent+Ca2++extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells.">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li><li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells.">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13 (1999).</li><li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2++concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells.">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

<p class="jove_content"&gt;吸引ピペット技術が同時にORNから臭気誘起遅い受容体電流と高速二相性活動電位を記録するために使用される電気生理学的な手法である。細胞の形質膜が破られていないので、この方法は、付臭剤応答が細胞内因子の細胞質イオン濃度または希釈の変化に起因する変更されていないことを確実に邪魔されずに細胞内の環境を残します。細胞は、長期間（マウスの中の蛙と1時間で最大4時間）のから録音することができます。細胞体は記録ピペットの内側にあるので、この手法のもう一つの利点は、刺激が唯一ORNの先端部に配信されていること、そうであるように繊毛や樹状ノブ（IEです<em生体内で&gt;</em&gt;）このように、セル全体が露出した場合に発生する可能性の非特異的効果を排除。セルは比較的よくピペット、高い溶液流量の先端に安定座っにより保護されていますので、高速なソリューションの変更を達成することができるとしても、高流量が簡単にシールが失われる可能性がありタイトなシール記録構成に比べ。細胞内のアクセスが得られていないので、逆に、この技術は研究電位依存性電流をEGにセル電圧クランプするために使用することはできません。それが緩んシール技術であるため、また、録音は様々なソースから発生する可能性のある電気的なノイズに敏感です。ケアは、電極ホルダーを清潔にし、潜在的なノイズ発生源とすることができる導電性であることから、それを防止するために、塩/リンゲル液でコーティングされていないことを保証するために取られるべきである。また、すべての機器のアースとファラデーケージは慎重に行う必要があります。</p&gt;<p class="jove_content"開口部に対称性の欠如は、細胞体との間にピペット貧しいシールをもたらすことができるように&gt;ピペットチップの大きさや一貫性は非常に重要です。また、開口部の大きさは非常に重要です。吸い込まORNは大きすぎるチップは、ノイズとも録音時に失われてORNにさらに脆弱な録音を残して非常に緩やかなシールをもたらすことができます。小さすぎてチップが損傷し、短い記録期間を引き起こして、あまりにもタイトセルを絞ることができます。同じピペットを複数のセルからの録音のために使用することができ、先端は破片によってブロックされる場合、それはそうでない場合は、新しいピペットを使用する必要があり、超音波処理装置を用いて洗浄する必要があります。</p

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料の名称 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ/ 型番 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>空気テーブル</td><td>機器</td><td>ニューポート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>空気ポンプ</td><td>機器</td><td>ニューポート</td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td>ピペットプラー</td><td>機器</td><td>サッター</td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス</td><td>機器</td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td>ニコン倒立顕微鏡エクリプス</td><td>機器</td><td>ニコン</td><td> TE2000U </td><td> Hgランプ、GFPフィルターや目標少なくとも20Xと5X装備</td></tr><tr><td>アンプのPC-501A </td><td>機器</td><td>ワーナー</td><td> 64から0008 </td><td>ヘッドステージ1GΩ </td></tr><tr><td>ダイヤモンドナイフ</td><td>機器</td><td>カスタムメード</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタイザMikro1401、A / D </td><td>機器</td><td>ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィルタユニット3382 </td><td>機器</td><td>クルーンハイト法人</td><td></td><td></td></tr><tr><td>信号</td><td>ソフトウェア</td><td>ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ag / AgCl電極ペレット成形</td><td>機器</td><td> WPI </td><td> 64から1297 </td><td></td></tr><tr><td>ピペットホルダ</td><td>機器</td><td>ワーナー</td><td> 64から0997 </td><td>カスタムは、適合するように変更 ヘッドステージ</td></tr><tr><td>記録室</td><td>機器</td><td>カスタムメード</td><td></td><td></td></tr><tr><td>極微操作装置 MP85-1028 </td><td>機器</td><td>サター·インストゥルメント</td><td>極微操作装置 MP85-1028 </td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td>鉱油</td><td>ソリューション</td><td>シグマ</td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープのTDS 1001 </td><td>機器</td><td>テクトロニクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三連発四角いガラス管</td><td>機器</td><td>ワーナー</td><td> 64から0119 </td><td> 5センチメートル長い0.6ミリメートルのID、 </td></tr><tr><td>バルブ</td><td>機器</td><td>リー·カンパニー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Valvelink 8.2 </td><td>機器</td><td>科学自動化</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SF-77B潅流高速ステップ</td><td>機器</td><td>ワーナー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique

動物は鼻腔に位置化学感覚系を介してそれらの周りに臭気環境をサンプリングする。化学感覚シグナルには、食べ物の選択、捕食動物、同種と認識メイトや他の社会的に関連する手がかりとして複雑な動作に影響を与えます。嗅覚受容ニューロン（ORNs）が嗅上皮に埋め込まれた鼻腔の背の部分に位置しています。これらのバイポーラニューロンは嗅球（ 図1参照 、もともと一般生理学のジャーナルで発表Reisert＆趙1）に軸索を送って、嗅覚をカバー粘液にどこ繊毛上皮から放射国境に単一の樹状突起を延ばす上皮。チャネル（ 図1） -繊毛は、最終的に毛様体伝達チャネル、環状ヌクレオチド依存性（CNG）をチャネルとCa 2 +活性化Clを通る電流の流入を興奮につながるシグナル伝達機構が含まれています。その後depolarizationは、細胞体2から4で活動電位の発生をトリガーします。 このビデオでは、ORNsから匂い物質誘発性の応答を記録するための &quot;吸引ピペット技術&quot;の使用方法について説明します。このメソッドは当初、桿体5から記録するために開発され、この方法の変形例は、マウスの錐体6から記録するように修正jove.comで見つけることができます。吸引ピペット技術は後でまたORNs 7,8から録音するように適合された。簡単に言えば、嗅上皮と細胞単離の解離後、ORNの全体の細胞体は、記録ピペットの先端に吸引される。デンドライトと繊毛は浴溶液にさらされると、例えば匂い物質または薬理ブロッカーアプリケーションを有効にするソリューションの変更することがアクセス可能な状態のままです。この構成では、細胞内環境へのアクセスが得られません（無細胞全体の電圧クランプ）と細胞内の電圧が変化すること自由に残っています。これは、すべて繊毛と細胞体9によって発射速い活動電位を起点遅い受容体電流の同時記録をOWS。これらの2つの信号間の動態の違いは、それらが異なるフィルタ設定を使用して分離することができるようになります。この手法は、任意の野生型またはノックアウトマウスで使用することができますまたはもORNsの特定のサブセットを標識するためにGFPを発現ORNsから選択的に記録するために、例えば与えられた嗅覚受容体やイオンチャネルを発現している。

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Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

嗅覚受容ニューロン（ORNs）が受容体に最初のターンで嗅球の2次ニューロンに伝達される活動電位を引き起こすことを、現在の匂い信号を変換します。ここでは同時に匂い物質誘発性受容体マウスORNsから現在の活動電位を記録するための吸引ピペットのテクニックについて説明します。

吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

odorant-induced-responses-recorded-from-olfactory-receptor-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K ビュー.  Monell Chemical Senses Center. 嗅覚受容ニューロン（ORNs）が受容体に最初のターンで嗅球の2次ニューロンに伝達される活動電位を引き起こすことを、現在の匂い信号を変換します。ここでは同時に匂い物質誘発性受容体マウスORNsから現在の活動電位を記録するための吸引ピペットのテクニックについて説明します。

ビデオ: Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

神経科学

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

ダイナミッククランプ法を用いたラット中脳ドーパミン作動性ニューロンにおけるNMDA受容体のコンダクタンスのアプリケーション

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

蛾嗅覚系の電気生理学的測定

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

脊髄電気生理学II：細胞外吸引電極の作製

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

げっ歯類やヒトから鼻嗅覚幹細胞を単離する

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

組み合わせることを使用してターゲットと嗅球の神経細胞インビボでのエレクトロポレーションとGAL4ベースエンハンサートラップゼブラフィッシュの行

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

イメージング初代培養マウス神経細胞における形質膜に受容体の挿入をpHluorinタグ付き

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

ルシフェラーゼ活性を介し受容体活性化の測定：哺乳類嗅覚受容体のハイスループット分析

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...