Ringraziamo il Dott. canzone Yijun, e membri della Kuruvilla Hattar Zhao tri-lab del Dipartimento di Biologia, Johns Hopkins University per un consiglio e aiuto. Supportato da sovvenzioni NIH DC007395 e DC009946.

Parte 1. Il setup di registrazione EOG L&#39;apparato di registrazione è costituito da un elettrodo di registrazione, elettrodo di riferimento, consegna camera d&#39;aria, lo stadio dei campioni, e microscopio da dissezione, tutte ancorate su un tavolo d&#39;aria all&#39;interno di una gabbia di Faraday. Micromanipolatori sono utilizzati per il posizionamento degli elettrodi e il tubo di mandata aria. Un flusso continuo dell&#39;aria è gorgogliare attraverso acqua distillata da aggiungere prima che l&#39;umidità che passa attraverso il tubo di mandata aria e il campione. Un piatto della cultura 60 millimetri riempito con Sylgard ad una profondità di 6-8 mm è utilizzato come superficie di montaggio per il campione. Un pozzo e un canale sono scavate nella Sylgard nel piatto di montaggio per fornire un mezzo per collegare elettricamente l&#39;elettrodo di riferimento al modello tramite soluzione modificata Ringer. L&#39;elettrodo di registrazione e l&#39;elettrodo di riferimento sono collegati ad un amplificatore. Segnali dal amplificatore vengono inviati a un digitalizzatore e poi a un computer. Software come Axograph o pClamp può essere usato per controllare il protocollo di stimolazione, per registrare il segnale, e per la successiva analisi delle risposte. Un oscilloscopio collegato dopo l&#39;amplificatore può essere conveniente per il monitoraggio in tempo reale del potenziale elettrico, mentre ponendo l&#39;elettrodo di registrazione e durante le registrazioni EOG. Consegna degli stimoli olfattivi è controllato da un Picospritzer, che è collegato allo stesso computer utilizzato per l&#39;acquisizione del segnale. La pressione dell&#39;aria in Picospritzer è impostato a 10 psi. Un serbatoio di aria singola e regolatore può essere utilizzato per fornire aria sia al tavolo aria e la Picospritzer. Un serbatoio di aria secondo e il regolatore viene utilizzato per fornire aria per il flusso di aria umidificata, in quanto ciò richiede una pressione più bassa e una grande quantità di flusso d&#39;aria. Appena prima di fornire uno stimolo olfattivo, l&#39;uscita Picospritzer è collegato a una bottiglia di odorizzante. La bottiglia odorizzante viene poi collegato al tubo di mandata aria. Parte 2: Preparazione di elettrodi L&#39;elettrodo di registrazione è un filo d&#39;argento chlorided in un bicchiere tirato capillare riempito con soluzione modificato Ringer (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 10 HEPES mM, pH 7,4, filtro sterilizzato). L&#39;elettrodo di riferimento è un filo d&#39;argento chlorided. <ol><li> Installare il filo d&#39;argento nel supporto elettrodo. Per l&#39;elettrodo di registrazione, 1-2 centimetri di filo deve sporgere dalla fine del porta elettrodo. Più filo può essere lasciato per l&#39;elettrodo di riferimento. </li><li> Per aggiungere il cappotto AgCl al filo d&#39;argento, la posizione del filo di 0,1 M di NaCl e collegare la porta elettrodo al polo positivo di una potenza 1,5-9 fonte V DC. Il terminale negativo della fonte di alimentazione deve essere collegato elettricamente alla soluzione 0,1 M di NaCl. Lasciare che la reazione chloriding procedere per 10 minuti. Per pareggiare qualsiasi carica elettrostatica tra la registrazione e l&#39;elettrodo di riferimento, brevemente toccare gli elettrodi insieme prima di installarli sul apparecchi di registrazione. </li><li> Tirare un capillare di vetro con un estrattore micropipetta. L&#39;apertura alla punta del capillare dovrebbe essere di circa 5-10 micron di diametro. </li><li> Usare una matita diamante per segnare e rompere la punta smussata del capillare per cui è ~ 2 cm più lungo il filo d&#39;argento. Fire-lucidare l&#39;estremità tagliata con la torcia butano. </li><li> Fate sciogliere lo 0,5% di agarosio in soluzione modificata Ringer. Tirare una piccola quantità di soluzione di agarosio fuso nella punta dell&#39;elettrodo con una pipetta di trasferimento. </li><li> Riempire il capillare tirato circa 1 / 2 del modo con la soluzione modificato Ringer (una siringa che è stato riscaldato e tirato per avere un finale lungo e sottile è utile per questo scopo). Picchiettare lievemente la capillare per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria. Conservare l&#39;elettrodo riempito il vaso di storage con una piccola quantità di soluzione di Ringer modificato in fondo finché non sono pronti per essere utilizzati. Una volta che un campione di tessuto è preparato e pronto per la registrazione, installare un capillare riempito oltre il filo elettrodo di registrazione. </li></ol> Parte 3: Preparazione di soluzioni di odorizzante L&#39;acetato di amile odoranti e heptaldehyde evocano le risposte di grandi dimensioni e sono scelte così buona come stimolanti EOG. <ol><li> In tubi microcentrifuga, preparare una serie di diluizioni di odorizzante in dimetilsolfossido (DMSO). Come punto di partenza per una curva dose-risposta, preparare diluizioni 10-M da 5 a 5 x 10 -6 M. Diluire fresco ogni giorno. </li><li> Diluire ulteriormente il odoranti di 50 volte in acqua mescolando il 100 microlitri magazzino diluito in DMSO con 4,9 ml di acqua 2 bottiglie con tappi di silicone oncia. Lasciate che le soluzioni equilibrare in bottiglia per almeno 30 minuti. Si noti che la concentrazione di vapore di odoranti in ogni bottiglia è sconosciuta, ma può variare in funzione della concentrazione di odoranti in fase liquida. </li><li> Inserire due 18-gauge aghi attraverso il tappo di silicone per provide porte di input e di output. Le porte deve essere collegato quando la bottiglia non è in uso. </li></ol> Parte 4: la registrazione dei dati e l&#39;analisi EOG <ol><li> Sacrificio di un mouse da CO 2 l&#39;eutanasia o seguito da overdose di anestetico decapitazione. Rimuovere la cute sovrastante il cranio e sagittalmente dividono in due la testa lungo la linea mediana. </li><li> Montare una metà della testa, lato mediale alto, sul piatto di montaggio. Rimuovere con attenzione il setto per esporre i turbinati. </li><li> Porre la capsula con il tessuto montato sul palco di registrazione. Allineare il palco in modo che la posizione di registrazione sul turbinati è centrata sotto il microscopio. </li><li> Accendere il serbatoio d&#39;aria per fornire aria umidificata alla superficie turbinati. Posizionare il tubo di mandata aria in modo che si tratta di circa 10 mm di distanza dal luogo della registrazione. La portata è ~ 600 ml / min. </li><li> Impostare l&#39;amplificatore in modalità DC (amplificazione AC indurrà artefatti nel segnale EOG) con filtro passa-basso a 1 kHz, e guadagno a 100X. </li><li> Monte di registrazione ed elettrodi di riferimento sul micromanipolatori. </li><li> Abbassare l&#39;elettrodo di riferimento nel pozzo sul piatto di montaggio e coprire con la soluzione in modo che sia collegato elettricamente il tessuto modificato Ringer. </li><li> Abbassare con cautela l&#39;elettrodo di registrazione sulla superficie del turbinati IIb o III. L&#39;elettrodo dovrebbe toccare appena la superficie dell&#39;epitelio olfattivo! Quando l&#39;elettrodo viene in contatto con l&#39;epitelio (cioè completa di un circuito elettrico), una linea di base diritta apparirà l&#39;oscilloscopio. </li><li> Fissare una bottiglia odorizzante alla porta laterale sul tubo di mandata aria. </li><li> Sul computer, avviare un protocollo di stimolazione. La frequenza di campionamento per l&#39;acquisizione dei dati dovrebbero essere 2 kHz o superiore. Il software attiverà un impulso odore e iniziare la registrazione. </li><li> Un tipico protocollo di stimolazione può essere un 100 msec durata dell&#39;impulso singolo, coppia di 100 msec impulsi separati da un intervallo di 1 secondo, oppure a 10 secondi impulso sostenuta. </li><li> Prendetevi del tempo tra i protocolli in modo che il tessuto è minimamente adatta. Un minuto è sufficiente per concentrazioni di liquido di acetato di amile e heptaldehyde fino a 10 m -3; a concentrazioni più elevate a 5 minuti. Dopo la consegna alte concentrazioni di odori (come alla fine di una curva dose-risposta) odore residua può rimanere nel tubo. Lavare il tubo dell&#39;aria con il 95% di etanolo e asciugare prima di continuare con campioni di tessuto aggiuntivo. </li><li> Axograph software offre strumenti per misurare i parametri chiave del segnale EOG. Tali parametri sono l&#39;ampiezza di risposta, la latenza, il tempo di picco, e le costanti di tempo di terminazione. Può essere auspicabile per filtrare digitalmente tracce a 25 Hz prima di ulteriori analisi. </li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Parametri per l&#39;analisi EOG. Diversi parametri di dell&#39;EOG sono particolarmente utili per il confronto delle risposte tra topi, tra cui l&#39;ampiezza di risposta, la latenza (il tempo tra quando lo stimolo viene somministrato e la risposta inizia), tempo di salita (il tempo tra l&#39;inizio della risposta e la vetta), il tempo di picco (il tempo tra l&#39;inizio della stimolazione al picco della risposta), e la costante di tempo di terminazione (τ, determinato dal montaggio della fase di decadimento della risposta a una singola equazione esponenziale ). Per il confronto dei parametri cinetici come la latenza, tempo di salita, e la costante di tempo di risoluzione, si consiglia di normalizzare l&#39;ampiezza di picco delle risposte prima dell&#39;analisi. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Rappresentante EOG segnali in diversi protocolli di stimolazione. (A) Esempi di EOGs da un topo in risposta alla stimolazione con concentrazioni crescenti di acetato di amile. La linea nera nella parte superiore del pannello indica i tempi e la durata della stimolazione odorizzante. Le concentrazioni nella leggenda sono le concentrazioni della soluzione liquida. (B) una relazione dose-risposta in media da cinque topi. Le barre di errore sono gli intervalli di confidenza al 95%. Un calo del picco di ampiezza è spesso osservata a concentrazioni odore molto elevate. (C) Un esempio di EOG in risposta ad una coppia impulsi di stimolazione. Un singolo impulso breve di odorizzante suscita adattamento della durata di alcuni secondi. (D) Un esempio di EOG in risposta ad un 10-secondi sostenuta stimolazione odorizzante. L&#39;EOG mostra desensibilizzazione durante la presentazione odorizzante continuo.

<ol>
	<li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium.">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, 1-83 (1956).</li><li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroolfactogram:+a+review+of+its+history+and+uses.">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li><li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel.">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li><li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+in+G(olf)+are+anosmic.">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor.">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279, 237-242 (1998).</li><li>Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+type+III+adenylyl+cyclase+gene+leads+to+peripheral+and+behavioral+anosmia+in+transgenic+mice.">Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice.</a> Neuron. 27, 487-497 (2000).</li><li>Munger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+the+CNGA4+channel+subunit+in+Ca2+-calmodulin-dependent+odor+adaptation.">Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation.</a> Science. 294, 2172-2175 (2001).</li><li>Michalakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CNGB1+protein+leads+to+olfactory+dysfunction+and+subciliary+cyclic+nucleotide-gated+channel+trapping.">Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping.</a> J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).</li><li>Buiakova, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+marker+protein+(OMP)+gene+deletion+causes+altered+physiological+activity+of+olfactory+sensory+neurons.">Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).</li><li>Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+chloride+accumulation+in+olfactory+epithelium+of+mice+lacking+NKCC1.">Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1.</a> J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).</li><li>Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+CNG+channel+desensitization+by+Ca2+/CaM+via+the+B1b+subunit+affects+response+termination+but+not+sensitivity+to+recurring+stimulation.">Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation.</a> Neuron. 58, 374-386 (2008).</li><li>Cygnar, K. D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons.">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+"IP(3)-odors".">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li><li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice.">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li><li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram.">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li><li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram.">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li></ol>

Topi sono stati trattati e eutanasia con metodi approvati dalla cura degli animali e dei Comitati uso della Johns Hopkins University.

Con la configurazione descritta in questo protocollo, gli stimoli olfattivi sulla superficie dell&#39;epitelio olfattivo sarà coerente tra i preparati di tessuto, permettendo il confronto tra topi wild-type e mutanti, anche se la concentrazione di odorizzante esatta e le dinamiche sono sconosciute. Diversi fattori, in particolare la posizione di registrazione e la portata di aria umidificata, causare variazioni nel EOG. Si deve prestare attenzione a registrare da posizioni simili sulla stessa turbinato per minimizzare variazione. Questo può essere facilmente ottenuto la registrazione costantemente dallo stesso lato della testa e mantenendo l&#39;impronta del microscopio, la consegna tubo odore, e micromanipolatori sul tavolo aria invariato tra campioni di tessuto. Inoltre, campioni di tessuto devono essere immediatamente inseriti nel flusso di aria umidificata, dopo la dissezione, per evitare l&#39;essiccamento eccessivo del tessuto. Registrazioni EOG sui topi possono anche essere effettuata con un apparato di perfusione liquido al passaggio del mouse preparato turbinati 7, 14, 15, oppure lasciando la testa intatta e inserendo l&#39;elettrodo in un piccolo foro perforato al di sopra della turbinati 16, 17. Ogni variazione di registrazione EOG ha i suoi pregi: aria fase registrazioni sulla preparazione dei tessuti, come descritto in questo protocollo richiede una quantità minima di impostazione e sono più facili da condurre, registrazioni con un apparato di liquido di perfusione facilitare l&#39;uso di reagenti farmacologico, anche se il natura idrofobica di odoranti molti complica consegna odore, infine, le registrazioni in cui viene lasciato intatto il capo può essere utilizzato in &#39;artificiale annusare&#39; esperimenti, anche se il posizionamento dell&#39;elettrodo è più difficile rispetto a quando turbinati sono completamente esposti.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Air delivery tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute</td>
</tr>
<tr>
<td>Air table</td>
<td>equipment</td>
<td>Newport</td>
<td>LW3030B-OPT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>equipment</td>
<td>Warner</td>
<td>DP-301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and Data Acquisition Software</td>
<td>equipment</td>
<td>Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.</td>
</tr>
<tr>
<td>Butane torch</td>
<td>equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A cr&egrave;me br&ucirc;l&egrave;e torch works well</td>
</tr>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>equipment</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scope</td>
<td>equipment</td>
<td>Scienscope</td>
<td>SSZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode holder</td>
<td>equipment</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>64-1021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Holding Devices (12 mm)</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M3301R M3301L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope</td>
<td>equipment</td>
<td>Tektronix </td>
<td>5110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>equipment</td>
<td>Parker Instrumentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone tubing</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalge Nunc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Specimen stage</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.</td>
</tr>
<tr>
<td>18 gage needles</td>
<td>material</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305195</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 oz. glass bottles</td>
<td>material</td>
<td>VWR International</td>
<td>16152-201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass capillaries</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW150F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone stoppers size 16D</td>
<td>material</td>
<td>Chemware</td>
<td>D1069809</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver wire</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>AGW1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SylGuard 184</td>
<td>material</td>
<td>Dow Corning </td>
<td>SYLG184</td>
<td>From World Precision Instruments</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amyl acetate</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>W504009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-1016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptaldehyde</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>H2120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9272</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
<td>reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>3624-05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>flowmeter</td>
<td>equipment</td>
<td>Gilmont</td>
<td>GF-2260</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording

Gli animali dipendono da olfatto per molti comportamenti critici, quali la ricerca di fonti di cibo, evitando i predatori, e di individuare i conspecifici per l&#39;accoppiamento e altre interazioni sociali. L&#39;(EOG) registrazione electroolfactogram è un metodo informativo, facile da condurre, e affidabile per la funzione di analisi olfattiva a livello dell&#39;epitelio olfattivo. Dato che la descrizione 1956 del EOG da Ottoson nelle rane 1, la registrazione EOG è stata applicata in molti vertebrati compreso salamandre, conigli, ratti, topi ed esseri umani (recensione da Scott e Scott-Johnson, 2002, rif. 2). I recenti progressi nella modificazione genetica nei topi hanno riacceso l&#39;interesse per la registrazione EOG per la caratterizzazione fisiologica della funzione olfattiva in knock-out e knock-in topi. EOG registrazioni sono state applicate con successo per dimostrare il ruolo centrale dei componenti olfattive trasduzione del segnale 3-8, e più recentemente per caratterizzare il contributo di alcuni meccanismi di regolazione di risposte OSN 9-12. Rilevazione odorizzante avviene alla superficie dell&#39;epitelio olfattivo sulle ciglia di OSNs, dove una cascata di trasduzione del segnale porta all&#39;apertura di canali ionici, generando una corrente che fluisce nel ciglia e depolarizza la membrana 13. L&#39;EOG è il potenziale negativo registrato extracellulare sulla superficie dell&#39;epitelio olfattivo sulla stimolazione odorizzante, frutto di una sommatoria dei cambiamenti potenziali causate da singoli OSNs reattivo nel campo di registrazione 2. Confronto fra l&#39;ampiezza e la cinetica del EOG quindi fornire preziose informazioni su come modificazione genetica e le altre manipolazioni sperimentali influenzare la segnalazione molecolari alla base della risposta OSN di odore. Qui si descrive un impianto di fase di registrazione EOG su una preparazione di turbinati del mouse olfattivo. In breve, dopo aver sacrificato il mouse, i turbinati olfattivi sono esposti da bisecando la testa lungo la linea mediana e la rimozione del setto. La preparazione turbinati viene poi messo nel setup di registrazione, e un elettrodo di registrazione è posto alla superficie dell&#39;epitelio olfattivo su uno dei turbinati mediale. Un elettrodo di riferimento è collegato elettricamente al tessuto attraverso una soluzione tampone. Un flusso continuo di aria umidificata è soffiato sulla superficie dell&#39;epitelio per mantenerlo umido. Il vapore di soluzioni odorizzante si gonfia nel flusso di aria umidificata per stimolare l&#39;epitelio. Le risposte sono registrati e digitalizzati per ulteriori analisi.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording at JoVE.com

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

L&#39;(EOG) è una registrazione electroolfactogram informativo, facile da condurre, e affidabile di valutazione della funzione olfattiva a livello dell&#39;epitelio olfattivo. Questo protocollo descrive una configurazione di registrazione, di preparazione dei tessuti del mouse, raccolta dati e analisi dei dati di base.

Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l&#39;aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

analyzing-responses-mouse-olfactory-sensory-neurons-using-air-phase

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Views.  Johns Hopkins University. L'(EOG) è una registrazione electroolfactogram informativo, facile da condurre, e affidabile di valutazione della funzione olfattiva a livello dell'epitelio olfattivo. Questo protocollo descrive una configurazione di registrazione, di preparazione dei tessuti del mouse, raccolta dati e analisi dei dati di base.

Video: Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Registrazione di risposte comportamentali alla riflessione in gamberi di fiume

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Ricerca

Neuroscienze

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Preparazione di un mouse Awake per la registrazione di risposte neurali e iniezione Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorizzante indotte risposte registrate da neuroni recettori olfattivi con la tecnica della pipetta di aspirazione

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracellulare di registrazione, sensoriale Campo Mapping, e la coltura neuroni identificata nel Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Utilizzando Sensillum singolo controllo per rilevare olfattiva Neuron Risposte di cimici a semiochimici

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...