이 작품은 NIH DC009613, 인간 프론티어 과학 프로그램과 몰리 케어 휄로 십 (JR까지)에 의해 지원되었다.

1. 녹음 설정 녹음 챔버는 공기 테이블에 장착되어 전기적으로 패러데이 케이지를 사용하여 차폐되어 위상 대비 광학있는 니콘 TE2000U 이클립스 (Eclipse) 역 현미경에 장착되어 있습니다. 플렉시 글라스 기록 챔버는 두 부분 부분적으로 장벽에 의해 분리되어 silanized 유리 슬라이드에 접착으로 구성되어 있습니다. 챔버의 한 부분이 다른이 odorant에 조기 정착의 노출하지만, 아직 사용하지 않은 셀을 최소화하기 위해 녹화 중에 자극 - 노출에 사용되는 동안 세포를 해결하는 데 사용됩니다. 녹음 설정은 pelleted 피펫 홀더 및 접지 전극에 장착 흡입 피펫 (아래 참조)으로 구성되어 있습니다. 흡입 피펫은 micromanipulator를 사용하여 위치하고 있습니다. 자극 솔루션은 각각의 사각형 튜브가 0.7 mm X 0.7 mm거든요, 트리플 통 유리 사각형 튜브를 사용하여 적용됩니다. 트리플 배럴 유리는 머니퓰레이터에 장착 동력 빠른 단계 재관류 시스템 (Sut에 연결되었습니다적이 SF-77B, 워너 계측기)과 ~ 45 °의 각도로 녹화 챔버를 입력했습니다. 트리플 통 유리의 끝은 트리플 통 유리의 마지막 얼굴 (개방)은 피펫의 가까이에 위치하도록 허용하고, 수직이라고 같은 다시 45 °의 각도로 beveled되었습니다. 표준 포유류의 벨소리 솔루션과 접지 전극으로 가득 흡입 피펫 전극은 전압 클램프 모드에서 패치 클램프 증폭기의 1 GΩ의 headstage (PC-501A, 워너 악기)에 연결되어 있습니다. 앰프 (낮은 패스 5 kHz에서에서 필터링)에서 아날로그 신호는 실시간으로 신호를 모니터링하기 위해 디지털 오실로스코프에 표시되며 신호가 통과 필터링 낮은 8 극 베셀 필터 (Krohn-Hite)에 연결되어 50 Hz에서. 두 신호 (5 kHz에서 50 Hz에서 필터링 저역 통과) 데이터 수집을 위해 PC에 연결되어 A / D 컨버터 (캠브리지 전자 디자인 마이크로 1401의 mkII)에 공급하고 있습니다. 데이터 신호 3 acq를 사용하여 기록됩니다10 kHz에서의 샘플링 주파수에서 uisition 소프트웨어 (캠브리지 전자 디자인). 신호는 먼저 겹쳐 작업 가능성과 함께 현재의 수용체 후 혼자 전류 수용체를 (그림을 참조하십시오. 2) 기록하는 두 개의 서로 다른 대역폭에 기록됩니다. 재관류 시스템은 신호음 (제어) 솔루션과 odorant 자극 또는 원하는 구성의 솔루션을 사이에 빠르게 전환하는 데 사용되며 PC 및 신호 3 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 솔루션은 60 ML의 주사기에 포함되어 있으며 유량은 의료 수준의 정맥 흐름 규제에 의해 제어됩니다. 일반적으로 유량은 1 ML / 분으로 설정되어 있습니다. 녹음 피펫의 흡입은 다음과 같은 방법으로 제어됩니다 : 피펫 홀더의 측면 포트가 차례로 높이 조절 오일 저장조에 연결되어 오일 라인에 연결되어 있습니다. 높이거나 저수지를 낮추면 보장 그 P의 끝을 통해 피펫 압력, 따라서 벨소리 흐름ipette을 최소화하고 약간 긍정적이다. 추가 흡입 또는 압력은 녹음 피펫의 끝으로 격리 ORN의 전지 본체를 빨아 다른 끝에서 마우스 피스와 저수지의 영공에 연결된 튜브를 통하여 적용 할 수 있습니다. 실험 ° C 밀접하게 세포의 기본 생리 조건을 시뮬레이션하기 위해 37 수행됩니다. 온도는 솔루션을 포함하는 스테인리스 스틸 튜브는 10을 통과하는 통과 세라믹 저항기로 구성되어 주문 제작 난방 장치를 통해 솔루션을 전달하여 제어됩니다. 온도는 열전대 온도계 (우연)를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 2. 솔루션 포유류의 벨소리의 솔루션 (MM) : 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 0.01 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 HEPES, 10 포도당. 산도는 NaOH와 7.5로 조정되었습니다. 10 % 희석 벨소리의 솔루션은 접합 전류를 측정하기 위해 사용되었다. OdoraNT 솔루션 : 아세토 페논 및 유제 놀은 20 MM DMSO 주식에서 벨소리의 솔루션에서 매일 준비했다. 3. 전극을 만들기 <ol><li> 셔터 P-97 micropipette의 풀러의 모세관 unfilamented 붕규산 유리를 놓고 긴 테이퍼와 micropipette를 당겨. </li><li> 접안 렌즈와 무대에 탑재 된 이동식 다이아몬드 나이프의 십자선이 마련되어 차례에 니콘 E200 이클립스 현미경에 장착 주문 제작 micropipette 홀더에 피펫을 전송합니다. </li><li> 20x 목적 아래 피펫의 팁을 관찰하고 reticle을 가이드로 사용하여, 부드럽게 서기 피펫은 10 μm 폭 (외경)입니다 맞춤 제작 다이아몬드 칼을 사용하여 90 ° 각도로 피펫. </li><li> 끝으로 더 다이아몬드 칼을 이동하고 점차 다이아몬드 칼 끝에 압력을 적용 할 수 있습니다. 피펫 팁은이 scribed 된 시점에서 완전히 깨해야합니다. </li></ol> 또는 3.1로 단계를3.4이 결합 될 수 있으며 이러한 큰 팁 직경 깔끔하게 잘라 가장자리를 안정적으로 피펫을 끌어 어려워 증명할 수 있지만 피펫은 직접 피펫 팁을 잘라 할 필요없이 원하는 크기로 끌어 할 수 있습니다. <ol start="5"><li> 40x 목적에서 전기 온수 필라멘트를 사용하여 5 μm의 내부 직경 피펫의 끝을 연마 발사. 일단 완료, micropipette 마우스 ORNs에서 녹화 전류에 사용 할 준비가되어 있습니다. 벨소리로 가득 할 때 열려있는 피펫 저항은 MΩ 한 주변해야합니다. </li></ol> 4. 강한 수용체 뉴런의 절연 <ol><li> 기관 지침 및 규정에 따라 마우스를 희생. , 머리를 제거 벗겨 버릴 피부는 두개골을 놓인하고 medially 중간 선을 따라 머리를 두 갈래로 갈라지다. </li><li> 해부 stereomicroscope 아래 두 반의 뜻 헤드를 배치, 코 중격을 뽑아 후각 turbinates를 제​​거합니다. 포도당 (C)와 배양 접시에있는 모든 조직을 놓으십시오포유류의 벨소리 솔루션을 ontaining. </li><li> 이 turbinates에서 기본 연골에서 후각 상피 껍질을 250 μl 벨소리를 포함하는 Eppendorf 튜브에 조직을 전송합니다. 우리는 우리의 기록 챔버의 크기에 셀의 오른쪽 밀도를 얻을이 turbinates에서 조직을 사용합니다. ° C 나중에 사용하기 위해 4에 남아있는 조직을 저장합니다. </li><li> 중간 속도로 1 초에 두 번 짧게 후각 상피를 포함하는 소용돌이 Eppendorf 튜브. 이 단계는 상피에서 ORNs의 기계 분해로 연결됩니다. </li><li> 녹화 실에서 dissociated ORNs를 포함하는 벨소리 솔루션을 놓으십시오. 고급 집게를 사용하여 정지도 현재 조직의 큰 조각을 제거합니다. </li><li> ORNs은 벨소리와 함께 지속적으로 superfusion를 시작하기 전에 20 분에 정착하고 녹음을 계속하자. </li></ol> 5. 녹음 <ol><li> 녹음 챔버와 regul에 오일 라인에 연결된 흡입 전극을 낮 춥니 다피펫 팁에 약간의 긍정적 인 압력을 수립 할 수있는 오일 탱크의 높이를 먹었다. 이것은 피펫에서 (긍정적 인 압력) 또는 (부정적인 압력)에 대한 멀어 예를 들어 세포 파편을 관찰하여 수행 할 수 있습니다. 셀 쓰레기와 피펫의 팁을 오염하지보십시오. </li><li> 20 40x의 배율을 사용하여 전형적인 바이폴라 형태에 의해 인식 될 수있는 절연 ORN에 대한 기록 챔버를 검사합니다. ORN 전지 본체의 근접에 기록 전극을 이동합니다. 부드럽게 전지 본체는 피펫의 팁을 체결 있도록 빠는 시작합니다. 조심스럽게 천천히 전체 전지 본체는 목욕 솔루션에 노출 dendrite과 섬모가 부족해 남겨두고 흡입 피펫의 끝으로 그려 될 때까지 흡입을 적용하고 있습니다. 형편 ORNs 및 피펫 모양의 이미지 7,11를 참조하십시오. 더 흡입이 적용되지 않습니다되면, ORN은 피펫의에서 이동하거나하지 않습니다 있는지 확인하십시오. 그렇다면, 그에 따라 석유 저수지의 높이를 조정합니다. </li><li> 를 사용하여마이크로은 챔버의 기록 섹션에 정착 ORNs를 포함하는 섹션에서 흡입 피펫 이동합니다. 솔루션 교환을위한 3 질주 관 앞의 흡입 피펫을 조심스럽게 넣습니다. ORN은 따라서 혼합 난류를 피 층류에 노출되어 있으며 빠른 솔루션 교환을 달성하기 위해되도록 흡입 피펫은 충분히 3 질주 튜브의 개통에 배치해야합니다. 솔루션 교환은 흡입 피펫의 끝에서 흐르는 솔루션의 병렬 스트림 사이의 인터페이스를 스테핑에 의해 달성된다. 솔루션 교환의 시간 코스는 일반적으로 서로 다른 이온 성분의 솔루션 사이의 셀을 (그림을 참조하십시오. 2) 스테핑에 의해 evoked 접합 전류에서 측정 약 20 밀리 초입니다. 솔루션은 중력에 의해 전달됩니다. </li></ol> &lt;스팬 클래스 = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; 6. 대표 결과 <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg" /> 그림 1. 후각 망울에서 A) 바이폴라 수용체 뉴런. B) 속눈썹의 신호 전달 기계는 궁극적으로 현재의 유입을 흥분성의로 연결됩니다. 다음의 탈분극은 전지 본체의 행동 가능성 생성을 트리거합니다. <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg" /> 그림 2는 솔루션 교류의 속도와 안정성을 보여줍니다. 피펫는 100 밀리와 비슷 이온 농도에 의한 접합 전류가 기록 된 10 % 희석 벨소리로 정상에서 내려올되었습니다. 블랙 추적 번가입니다5 시험의 분노를, 빨강은 SD를 추적. 솔루션 교환시 SD에서 약간의 변화는 시험에서 시험 및 솔루션 스트림 하나를 초과하는 소음의 부족으로 솔루션 교류의 신뢰성을 보여줍니다. <img alt="그림 3." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg" /> 그림 3은 흡입 피펫 기술을 사용하여 ORN에서 유제 놀 유발 응답을 보여줍니다. 녹화 위의 막대로 표시로 ORN은 1 초 동안 100 μM의 유제 놀에 노출되었다. 그림합니다. 만 현재 수용체를 표시하려면 50 Hz에서 그림은 - 3A는 (검은 색 추적) 수용체 전류는 대역폭이 0에서 필터링되었습니다.. 5000 Hz에서 (빨간색 추적)도 작업 잠재력을 (화살표로 표시 APS) 표시 - 3B 지금은 0의 폭 넓은 대역폭에서 필터링 같은 기록을 보여줍니다. 삽입은 응답의 발병에 더 명확하게 APS를 시각적으로 확장 timescale에서 동일한 추적을 보여줍니다. <img alt="4 그림." srC = &quot;/ files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg&quot;/&gt; 유제 놀 - 응답 ORN의 그림 4. 선량 반응 가족 (A). 유제 놀은 0.3 μM에서 100 μM에 이르기까지 다양한 농도에서 사용 된, 자극 기간은 1 초이고 흔적은 0에서 필터링 - 50 Hz에서. odorant 농도의 진보적 인 증가는 odorant 노출이 종료 된 후에는 더 많은 느리게 종료 크고 빠른 응답을 낳았다. ORNs는 중간 odorant 농도 (그림 4B)에서 긴 stimulations 동안 왕복 응답 패턴을 표시 할 수 있습니다. 다음은 acetephenone (3 μM) 응답 ORN은 8 초 동안 자극했다. 자극의 발병에 신속하고 과도 피크 응답 후 작은, 반복 응답의 일련의 관찰됩니다. 50 Hz에서 - 녹화 대역폭은 0이었다.

<ol>
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저자는 공개 할 수 없어요.

<p class="jove_content"&gt; 흡입 피펫 기술은 동시에 ORN에서 냄새 유발 느린 수용체 전류와 빠른 biphasic 작업 잠재력을 기록하는 데 사용됩니다 electrophysiological 방법입니다. 세포의 플라즈마 막이 위반되지 않기 때문에,이 방법은 odorant 응답은 세포 내 요소의 세포질 이온 농도 또는 희석의 변화로 인해 변경되지 않도록 보장 방해받지 세포 환경을 남긴다. 셀은 긴 기간 (마우스 개구리 1 H에서 최대 4 H)에에서 기록 할 수 있습니다. 전지 본체는 기록 피펫 내부이기 때문에이 기술의 또 다른 장점은 자극이 ORN의 꼭대기 부분에만 전달되어,이 즉, 속눈썹 및 수지상 손잡이 (같은 경우가<em&gt; 생체 내</em&gt;) 따라서 전체 셀이 노출 된 경우 발생할 수있는 비 특정 효과를 제거. 셀이 비교적 잘 피펫, 높은 솔루션 유량의 끝에서 안정적으로 앉아에 의해 보호되며, 따라서 빠른 솔루션 변경 달성 될 수 있으므로 또한, 고 유량 쉽게 실의 손실이 발생할 수있는 긴밀한-인감 기록 구성에 비해 . 세포 액세스 권한이 확보되지 않기 때문에 반대로,이 기술은 연구 전압 개폐 전류를 예를 들어 할 수있는 셀을 전압 클램프하는 데 사용할 수 없습니다. 이 느슨한 - 인감 기술이기 때문에 또한, 녹음은 다양한 소스로부터 발생할 수 전기 노이즈에 민감합니다. 케어는 전극 홀더가 잠재적 잡음 소스가 될 수 전기적 전도성 않도록 할 수 있도록 깨끗하고 소금 / 벨소리 솔루션에 코팅하지 않도록주의해야한다. 또한, 장비 및 패러데이 케이지의 모든 접지는 신중하게 수행해야합니다.</p&gt;<p class="jove_content"개방의 대칭의 부족 전지 본체와 피펫 사이에 가난한 인감 될 수 있으므로&gt; 피펫 팁의 크기와 일관성이 매우 중요합니다. 또한, 개방의 크기는 매우 중요합니다. 형편 ORN 너무 큰 팁은 소음과도 녹화 중에 손실되는 ORN에 더욱 취약 녹음을 떠날 매우 느슨한 인감 될 수 있습니다. 너무 작은 팁 손상 및 단기 녹화 기간을 일으키는, 너무 꽉 셀을 당겨 수 있습니다. 동일한 피펫은 여러 세포에서 녹화에 사용할 수 있습니다, 끝이 파편에 의해 차단됩니다 경우, 그렇지 않으면 새로운 피펫을 사용해야합니다 ultrasonicator를 사용하여 세척해야합니다.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> 물질의 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 에어 테이블 </td><td> 장비 </td><td> 뉴 포트 (Newport) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에어 펌프 </td><td> 장비 </td><td> 뉴 포트 (Newport) </td><td> ACGP </td><td></td></tr><tr><td> 피펫 풀러 </td><td> 장비 </td><td> 셔터 </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> 붕규산 유리 </td><td> 장비 </td><td> WPI </td><td> 1B150-4 </td><td></td></tr><tr><td> 니콘 이클립스 역 현미경 </td><td> 장비 </td><td> 니콘 </td><td> TE2000U </td><td> HG 램프, GFP 필터 및 목표 20X 및 최소 5 배를 갖춘 </td></tr><tr><td> 앰프 PC-501A </td><td> 장비 </td><td> 워너 </td><td> 64-0008 </td><td> Headstage 1 GΩ </td></tr><tr><td> 다이아몬드 나이프 </td><td> 장비 </td><td> 맞춤 양복 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 디지타이저 Mikro1401 A / D </td><td> 장비 </td><td> 캠브리지 전자 디자인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 필터 유닛 3382 </td><td> 장비 </td><td> Krohn Hite 법인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 신호 </td><td> 소프트웨어 </td><td> 캠브리지 전자 디자인 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 자세 / AgCl 펠릿 성형 </td><td> 장비 </td><td> WPI </td><td> 64-1297 </td><td></td></tr><tr><td> 피펫 홀더 </td><td> 장비 </td><td> 워너 </td><td> 64-0997 </td><td> 맞춤에 맞게 수정 headstage </td></tr><tr><td> 녹음 챔버 </td><td> 장비 </td><td> 맞춤 양복 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator MP85-1028 </td><td> 장비 </td><td> 셔터 악기 </td><td> Micromanipulator MP85-1028 </td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> 용액 </td><td> 시그마 </td><td> 330779-1L </td><td></td></tr><tr><td> 오실로스코프 TDS 1001 </td><td> 장비 </td><td> 텍트로닉스 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 세 질주 평방 유​​리관 </td><td> 장비 </td><td> 워너 </td><td> 64-0119 </td><td> 5cm 길이 0.6 mm의 ID, </td></tr><tr><td> 판막 </td><td> 장비 </td><td> 리 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Valvelink 8.2 </td><td> 장비 </td><td> 과학 자동화 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SF-77B 재관류 빠른 단계 </td><td> 장비 </td><td> 워너 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique

동물은 비강에있는 chemosensory 시스템을 통해 주위의 향기가있는 환경을 드셔보세요. Chemosensory 신호는 식품 선택, 육식 동물, conspecific 및 동료 인식과 다른 사회적 관련 신호로 복잡한 동작에 영향을 미칩니다. 후각 수용체 뉴런은 (ORNs) 후각 상피에 포함 된 비강의 등 부분에 위치하고 있습니다. 이러한 양극성 뉴런은 (그림을 참조하십시오. 1, 원래 일반 생리학의 저널에 출판 Reisert &amp; 조 1) 후각 망울에 축삭을 보내 후각을 커버 점액에있는 솜털의 방출에서 상피 국경에 하나의 dendrite를 확장 상피. 채널 (그림 1) - 속눈썹은 궁극적으로 ciliary 전달 채널, 순환 염기 - 게이트 (CNG) 채널 및 칼슘 2 + - 활성화의 망할 CIA를 통해 현재의 유입을 흥분성의로 연결 신호 전달 기기가 포함되어 있습니다. 다음의 depolarization는 전지 본체 2-4에서 행동 가능성 생성을 트리거합니다. 이 비디오에서 우리는 ORNs에서 odorant 유발 반응을 기록 할 수있는 &#39;흡입 피펫 기술 &quot;의 사용을 설명합니다. 이 방법은 원래로드 photoreceptors 5에서 기록하기 위해 개발되었으며,이 방법의 변형은 마우스 콘 photoreceptors 6 일부터 기록하도록 수정 jove.com에서 찾을 수 있습니다. 흡입 피펫 기술은 나중에도 ORNs 7,8에서 기록하도록 구성되었습니다. 간단히, 후각 상피 및 세포 분리의 분리에 따라, ORN의 전체 전지 본체는 기록 피펫의 끝으로 빨려 있습니다. dendrite과 속눈썹은 목욕 솔루션에 노출 예를 들어 odorant 또는 약리 차단 응용 프로그램을 활성화하는 솔루션 변경에 따라서 액세스 할 수 남아 있습니다. 이 구성에서, 세포 내 환경에 더 접근 얻은 없습니다 (NO 전체 셀 전압 클램프)와 세포 내 전압이 다를 무료로 남아있다. 이 모든속눈썹과 전지 본체 9 발사 빠른 작업 잠재력에 유래 속도가 느린 수용체 전류의 동시 녹음을 ows. 이 두 신호 사이의 속도론의 차이는 그들에게 서로 다른 필터 설정을 사용하여 분리 할 수​​ 있습니다. 이 기술은 모든 야생 유형 또는 녹아웃 마우스에서 사용할 수 있습니다 또는도 ORNs의 특정 하위 집합에 라벨을 GFP를 표현 ORNs에서 선택적으로 기록하기 위해, 예를 들어 주어진 odorant 수용체 또는 이온 채널을 표현.

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Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

후각 수용체 뉴런 (ORNs)는 수용체에 첫 소절에 후각 망울에서 두 번째 주문 뉴런에 전달 아르 액션 잠재력을 실행하는 현재의 냄새 신호를 변환합니다. 여기 동시에 odorant 유발 수용체 마우스 ORNs의 현재와 실천 가능성을 기록 할 수있는 흡입 피펫 기술을 설명합니다.

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

odorant-induced-responses-recorded-from-olfactory-receptor-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K 조회수.  Monell Chemical Senses Center. 후각 수용체 뉴런 (ORNs)는 수용체에 첫 소절에 후각 망울에서 두 번째 주문 뉴런에 전달 아르 액션 잠재력을 실행하는 현재의 냄새 신호를 변환합니다. 여기 동시에 odorant 유발 수용체 마우스 ORNs의 현재와 실천 가능성을 기록 할 수있는 흡입 피펫 기술을 설명합니다.

비디오: Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

연구

신경과학

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

동적 클램프 기법을 사용 랫 Midbrain Dopaminergic 뉴런에서 NMDA 수용체의 전도의 응용

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

모쓰 강한 시스템에서 Electrophysiological 측정

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

척수 전기 생리학 II : 세포 흡입 전극 제작

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

결합을 사용하여 타겟팅 후각 망울의 뉴런 VIVO에서 Electroporation 및 Gal4 기반 향상제 트랩 Zebrafish 라인

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

강한 감각 뉴런의 속눈썹에 갇힌 화합물의 플래시 광분해

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

루시 페라 제 활동을 통해 수용체 활성화의 측정 : 포유류의 후각 수용체의 높은 처리량 분석

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...