La ricerca in laboratorio, gli autori &#39;è sostenuta dal National Institutes of concede Salute-HL041026 R37, R01-R01-HL086483 e HL056786 (SSS) e da F32-HL097463 e T32-AR048523 (PB) dal Servizio States Public Health.

1. Topo a bordo, piedistallo muscolare, cuneo corpo e soluzione superfusione <ol><li> Topo a bordo: una rettangolare in plexiglass trasparente bordo (6 &quot;di larghezza x 8&quot; x lunga 3 / 16 &quot;di spessore) è fatto per stare su palco del microscopio&quot;. Bordo mouse &quot;è dove il mouse anestetizzato è assicurata durante la preparazione chirurgica della il muscolo cremastere. </li><li> Piedistallo muscolare: un piedistallo di gomma trasparente silastic è preparato da Sylgard 184, che viene miscelato secondo le istruzioni del · Produttore s. Uno stampo conveniente si trova a 15 mm x 50 mm di diametro diametro monouso piastra di Petri. Il blocco Sylgard viene tagliato nella forma desiderata con una lametta (vedi Figura 1C).. Un sottile strato di silicone trasparente adesivo resistente all&#39;acqua è usato per fissare il blocco Sylgard alla scheda del mouse. Consigli utili: dopo versare il Sylgard nella capsula di Petri, degasaggio in una camera a vuoto per un&#39;ora rimuove le bolle d&#39;aria e migliora la chiarezza. A seguito di degasaggio, curando tempo per Sylgard è ridotto ponendo il piatto in un forno da laboratorio a 50 ° C per diverse ore. </li><li> Cuneo corpo e la piattaforma di riscaldamento: Un cuneo (2 &quot;X 4&quot; X 15 °) posizionata sotto il mouse e contro il piedistallo si inclina il corpo in avanti che facilita l&#39;estensione del muscolo cremastere sopra il piedistallo dalla sua origine. Dotata di un pianale in alluminio sulla superficie fornisce calore conduttivo. La piattaforma è riscaldata da resistenze collegato ad un alimentatore DC (Figura 1A). Calibrazione della temperatura piattaforma a ~ 40 ° C mantiene la temperatura esofagea a ~ 37 ° C. In caso contrario, il calore radiante da una lampada viene utilizzata. </li><li> Pin. Per proteggere il muscolo cremastere sul piedistallo, perni sono preparati da 0,15 millimetri perni insetti che sono state piegate in una forma a &quot;L&quot;. </li><li> Sale soluzione fisiologica (PSS). I preparativi sono superfused (irrigati) continuamente con bicarbonato-buffered PSS preparati in ultrapura (18,2 MΩ) H 2 O. Soluzioni madri sono preparate a 20X concentrazione finale di lavoro e sterilizzati attraverso un filtro 0,2 micron. Soluzioni stock rimangono buoni per diverse settimane se conservato a 4 ° C. Preparazione sali separatamente dal bicarbonato e mescolandoli con la diluizione, il giorno dell&#39;esperimento impedisce la precipitazione del bicarbonato di calcio. La soluzione salina magazzino è composta da (in mmol / L): 2638 NaCl, 94 KCl, 40 MgS0 4, 23,4 CaCl 2. Il bicarbonato di magazzino è di 360 NaHCO 3. Il giorno di un esperimento, le soluzioni rispettivi portato ad un volume finale (in genere 2 L per un dato esperimento) in un pallone tarato e collocato in un bagno d&#39;acqua a ~ 37 ° C. Equilibrante il PSS con il 5% di CO 2 / 95% N 2 per ~ 15 minuti utilizzando un dispersore di gas regola il pH a ~ 7,4 e previene precipitazioni. Il PSS è bollito continuamente con il 5% di CO 2 / 95% N 2 in tutta esperimenti. La composizione definitiva soluzione di lavoro (in mmol / L): 132 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgS0 4, 2 CaCl 2, 18 NaHCO 3. </li></ol> 2. L&#39;anestesia e la preparazione per la chirurgia <ol><li> A seguito di approvazione da parte della cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa, topi maschi di almeno 12 settimane di età sono utilizzati. Il mouse è anestetizzato con sodio pentobarbital (60 mg / kg) via intraperitoneale (ip) iniezione. Un tubo di contenimento si rivela utile per il fissaggio del mouse durante l&#39;iniezione iniziale. In tutto gli interventi chirurgici ei protocolli sperimentali, l&#39;anestesia è gestito da supplementi (10-20% di iniezione iniziale, ip), se necessario (ogni 30-60 minuti; indicato dal ritiro di risposta ai piedi, o stringere la coda). Suggerimento: diluendo il pentobarbital 10 mg / ml in soluzione salina sterile prima dell&#39;iniezione riduce la possibilità di sovradosaggio. </li><li> Anestesia compromessi regolazione della temperatura in modo che il mouse deve essere tenuto caldo subito dopo la prima iniezione. Posizionando il mouse in un vettore di metallo (cestello in alluminio ventilato) in cima ad una piastra riscaldante (calibrata a ~ 37 ° C) funziona bene. In alternativa, una lampada di calore può essere utilizzato, avendo cura di posizionarlo a una distanza appropriata dal mouse. Il mouse deve essere controllata ogni 5-10 minuti fino a quando il livello appropriato di anestesia si ottiene (mancanza di recesso ai piedi, o stringere la coda). Una dose supplementare può essere richiesto dopo 15-20 minuti. È meglio avere pazienza e procedere con cautela per evitare overdose, soprattutto con gli animali obesi o anziani. </li><li> Capelli è stato rimosso dal basso addome, parte bassa della schiena, scroto e le gambe con attenzione la rasatura rispettive regioni. Particolare attenzione deve essere adottate per evitare traumi allo scroto e testicoli, che altrimenti danneggiare il muscolo cremastere. Rimuovere i capelli sciolti con un tampone imbevuto di alcool fresca. </li><li> Se la vescica è piena che si sentirà come un chicco d&#39;uva piccolo attraverso la parete addominale. Svuotare la vescica con una leggera pressione per evitare che il mouse di urinare sulla preparazione cremastere durante gli esperimenti. Un Kimwipe è una spugna effetto di raccoltat l&#39;urina. </li><li> Posizionare il mouse sulla sua schiena, sdraiato sul cuneo con le gambe a cavallo tra il piedistallo. Una sutura di seta (4-0 o 5-0) legate ad ogni piede fornisce un cordino per il fissaggio del mouse con il suo inguine contro il piedistallo. Un pezzo di nastro adesivo posizionato liberamente sul petto e fissato per il cuneo mantiene la posizione generale del corpo. Le procedure chirurgiche vengono eseguite durante la visualizzazione attraverso uno stereomicroscopio con le forbici e pinze microdissezione angolato. </li></ol> 3. Preparazione chirurgica del muscolo cremastere aperto <ol><li> Un perno viene inserito attraverso l&#39;apice del sacco scrotale (sia il lato destro o sinistro) e fissato nel piedistallo per posizionare la tensione sulla pelle. Superfusione con PSS (34-35 ° C) è iniziata sul campo chirurgico e mantenuto per tutta la dissezione, per mantenere i tessuti esposti caldo e umido. Uno stoppino (a base di Kimwipe) posizionato con una estremità accanto al sacco scrotale e la successiva di altri ad una linea di vuoto rimuove il PSS effluenti. Un cordone di sigillante siliconico aderito alla scheda di plexiglas e completamente circondano il cuneo e piedistallo serve come &quot;fossato&quot; per raccogliere qualsiasi PSS che non è aspirato, che serve come una precauzione efficace per evitare perdite PSS sul microscopio. </li><li> Un&#39;incisione è fatta lungo la superficie ventrale del sacco scrotale. Se il testicolo è stato ritirato dal muscolo cremastere nella cavità addominale, una leggera pressione sul basso addome dirige il testicolo nel sacco. La superficie del muscolo cremastere sovrastante il testicolo devono essere identificati in questo momento. Tessuto connettivo tra la pelle dello scroto e il muscolo cremastere viene accuratamente rimossa per liberare il muscolo cremastere dal tessuto circostante. </li><li> La cute dello scroto è delicatamente retratto dietro il bordo prossimale del piedistallo e fissato su entrambi i lati con uno spillo. La superficie esterna della superficie del muscolo cremastere viene poi eliminato del tessuto connettivo. Superfusione continuo durante la dissezione idrata il tessuto connettivo, favorendo la visibilità e la rimozione. </li><li> Una spilla con l&#39;apice del muscolo cremastere viene usato per metterlo in tensione longitudinale. Una incisione longitudinale viene effettuata attraverso la superficie ventrale del muscolo con grande cura per ridurre al minimo interruzioni nella fornitura vascolare. Dinamica del flusso sanguigno nei pressi della periferia della preparazione sono modificate di questi 14 danni ai tessuti. Pertanto, per minimizzare questi effetti sulla raccolta dei dati, i vasi sanguigni vicino al centro della preparazione sono utilizzati per l&#39;imaging e studi fisiologici. </li><li> Il muscolo cremastere è collegato da un legamento sottile dell&#39;epididimo sotto il testicolo. Riflettendo il testicolo da un lato espone questo legamento, che è accuratamente separati dall&#39;epididimo. Vicino all&#39;apice del muscolo cremastere è piccola arteria e vena che lo collegano alla epididimo. Occlusione questi vasi tra pinza e tirando fuori riduce al minimo il sanguinamento. Il testicolo, epididimo, arteria e vena del testicolo sono legatura prossimale (4-0 o 5-0 sutura seta), tagliato e scartato (orchiectomia) insieme con il cuscinetto di grasso inguinale associati. In alternativa, il testicolo può essere delicatamente spinto indietro nella cavità addominale e conservati con un pezzo di cotone o Kimwipe. L&#39;orchiectomia serve per evitare possibili traumi ai tessuti quando si spinge indietro i testicoli nella cavità addominale. Non abbiamo trovato differenze notevoli nella qualità della preparazione microcircolazione cremastere (vedi Sezione 3.8) utilizzando la procedura di 7,15. </li><li> La superficie esterna del muscolo cremastere viene cancellata del restante tessuto connettivo e poi diffusa radialmente sulla superficie del piedistallo. I bordi sono fissato con perni (vedi Sezione 1.4) a 5-6 posti per creare un foglio piatto di muscoli striati microcircolazione intatto. </li><li> La preparazione è completata trasferiti allo stadio di un microscopio intravitale, superfused continuo (3-5 ml / min, 34 ° C) e equilibrata per 30 minuti. </li><li> L&#39;integrità della preparazione cremastere viene valutata in base a diversi criteri. Spontanea tono vasomotore con il minimo trauma chirurgico è indicato dal flusso vivace nelle arteriole e la mancanza di leucociti aderenti a venule. L&#39;indice più sensibile di un preparato reattivo è costrizione delle arteriole ad innalzare la soluzione superfusione contenuto di ossigeno per 5-10 minuti. Questo è fatto da equilibrare con il 21% O 2 (contro il 5% O 2: si veda Sezione 1.5, tutte con il 5% di CO 2, l&#39;equilibrio N 2). La presenza di leucociti nel arteriole, l&#39;assenza di globuli rossi del sangue che scorre attraverso i capillari, e / o leucociti si accumulano nei tessuti circostanti e venule sono segni di danni ai tessuti e l&#39;infiammazione. </li></ol> 4. L&#39;imaging intravitale della microcircolazione del muscolo cremastere <ol><li> Intravitale immagini viene eseguita su un microscopio personalizzato basato su una piattaforma Stereo Zoom Olympus MVX10. Il microscopio MVX10 corpoè montato su un supporto ibrido MVX10 dotato di transilluminazione (lampada alogena) per campo chiaro (Köhler) imaging e con epi-illuminazione (lampada al mercurio) per l&#39;imaging di fluorescenza. Utilizzando epi-illuminazione, GCaMP2 è entusiasta nm 472/30 con emissione raccolti in nm 520/35. Le immagini vengono acquisite attraverso un PLAPO MV 2XC lente (apertura numerica = 0,50; Olympus) utilizzando un XR/Mega-10 intensificato fotocamera digitale (Stanford Photonics, Inc.; SPI) tramite Piper Software di controllo (SPI) su un personal computer. Con questo sistema, il campo osservato di vista (FOV) può essere variata da 553 micron x 442 micron a 22 mm X 18 mm. </li><li> Al termine degli esperimenti di imaging intravitale, il mouse è anestetizzato eutanasia con un&#39;overdose di pentobarbital seguita da dislocazione cervicale. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Bordo del mouse per l&#39;imaging intravitale della preparazione del mouse cremastere. A) cuneo corpo con piattaforma in alluminio (isolato con materiale plastico giallo) viste dal basso. Resistenze di riscaldamento fissato alla parte inferiore della piattaforma forniscono calore condotto. B) La piattaforma di riscaldamento si basa su un cuneo di plastica. C) Il cuneo del corpo viene posto su una tavola di plexiglas per la chirurgia e il successivo trasferimento alla fase del microscopio intravitale. Piedistallo Sylgard è indicato con la freccia rossa. Una goccia di silicone impermeabile circonda l&#39;intera preparazione per contenere qualsiasi soluzione che potrebbe fuoriuscire durante la procedura intravitale, impedendogli di gocciolamento sul microscopio. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Personalizzati microscopio MacroZoom per widefield imaging. A) MVX10 corpo del microscopio (Olympus) con fotocamera XR/Mega-10 ICCD (Stanford Photonics) montato sulla porta trinoculare. B) Primo piano del corpo microscopio. (A) il controllo dello zoom (da 0,63 a 6.3x), (b) ruota portafiltri, (c) immagine duplicatore (NA = 0,50 con ingrandimento ottico 25X). C) condensatore sotto per campo chiaro (Köhler) illuminazione (Condensatore NA = 0.55, Distanza di lavoro = 27 mm). <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Completato la preparazione del mouse cremastere. Topo anestetizzati in posizione supina sul caldo plastificata piattaforma in alluminio (giallo). Posizione del corpo è fissato con del nastro adesivo. Il muscolo cremastere si sviluppa radialmente sul piedistallo di gomma trasparente silastic e appuntato sui bordi. Soluzione superfusione viene introdotto alla fine prossimale attraverso un gocciolatore plastica (freccia bianca). Una linea di vuoto (bianco punta di freccia) rimuove la soluzione attraverso uno stoppino Kimwipe. Due micropipette sono mostrati posizionati con le punte nel tessuto. Un elettrodo di riferimento (filo d&#39;argento) è fissata al bordo inferiore del muscolo cremastere. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Illustrando la gamma di ingrandimento per la visualizzazione di reti arteriolare esprimere GCaMP2 in endotelio. A) fluorescente e B) immagine brightfield prese a un ingrandimento ottico di 3,2 x per un ingrandimento totale = 42X sul monitor video. [Campo visivo (FOV) = 4.375 x 3.470 mm]. Barra di scala = 500 micron. Lavorare in questo ingrandimento facilita il posizionamento di micropipette nelle posizioni desiderate. C) fluorescente e D) brightfield immagine presa con ingrandimento ottico 6.4X per ingrandimento totale 83x = (FOV = 2.200 x 1.759 micron). Barra di scala = 200 micron. E) fluorescente ed F) l&#39;immagine brightfield presi con ingrandimento ottico di 12.6X per ingrandimento totale = 165x (FOV = 1.100 x 885 micron). Barra di scala = 100 micron. G) Con duplicatore di immagine, ingrandimento ottico = 25.2X. Barra di scala = 50 micron.

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	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. 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Tutte le procedure ei protocolli che coinvolgono animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Usa dell&#39;Università del Missouri ed eseguito in accordo con il National Institutes of Health Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. La produzione di questo video-articolo è stato sponsorizzato da Stanford Photonics.

Qui si descrive la preparazione del muscolo cremastere aperto nel topo per osservare il microcircolo in vivo. Questa procedura è modellato dopo la preparazione &quot;aperto&quot; Cremaster descritta la prima volta nel ratto 4. Con la pratica l&#39;intera procedura chirurgica può essere completato in meno di 1 ora. La versatilità di questo preparato permette una serie di manipolazioni sperimentali ed è facilmente adattabile per criceti e topi, permettendo una varietà di modelli sperimentali di essere studiato in modo simile. La preparazione è limitata agli animali di sesso maschile e le misure dovrebbero essere verso il centro del tessuto, evitando regioni danneggiate vicino ai bordi del muscolo 14. Si deve anche riconoscere che, mentre le distribuzioni di pressione e portata sono alterati quando i vasi comunicanti del muscolo cremastere vengono tagliati 16, microvasi rimangono reattiva e adatta per riproducibile raccolta dei dati. La limitazione principale per visualizzare la microcircolazione del muscolo cremastere è l&#39;accumulo di tessuto connettivo come animali maturi e aumento delle dimensioni, in particolare nei ratti, ma anche nei criceti. Inoltre, come animali da ingrassare, diventa più difficile da controllare, perché l&#39;anestesia pentobarbital è lipofilo e può essere assorbita nel tessuto adiposo. Il modo migliore per procedere è quello di essere paziente, garantendo nel contempo che la temperatura corporea I ° animale s è mantenuta a ~ 37 ° C mentre il tessuto è esposto continuamente irrigato con PSS.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente o dispositivo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Pescatore </td><td> S642-212 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> Solfato di Magnesio </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Sigma </td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio Bicarbonato </td><td> Pescatore </td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di sodio Nembutal </td><td> Lundbeck </td><td> NDC 67386-501-55 </td><td> Indicato anche come sodio pentobarbital </td></tr><tr><td> Controllore di temperatura </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td> Si alternano: regolabile 12V DC alimentazione </td></tr><tr><td> Serie 20 kit riscaldatore piattaforma RH-2 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0274 </td><td> Richiede custom-built lamiera di alluminio </td></tr><tr><td> Mega-10 Fotocamera </td><td> Stanford Fotonica </td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2XC lente </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10 supporto ibrido </td><td> Leeds </td><td> LBX-Hybrid </td><td></td></tr><tr><td> Piper Software di controllo </td><td> Stanford Fotonica </td><td></td><td> Programma per Mega-10 fotocamera </td></tr><tr><td> Microscopio stereo </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone sigillante impermeabile (Cancella) </td><td> General Electric </td><td> 47970-72643-LW5000 </td><td> Altri sigillanti in silicone trasparente anche il lavoro </td></tr><tr><td> 60 x 15 millimetri Petri Dish </td><td> Pescatore </td><td> 08-757-13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td> Microdissezione Forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont Pinza </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> # 5 / 45 </td><td></td></tr><tr><td> GP Millipore Express PLUS membrana </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Minutiens Insect Pins </td><td> Austerlitz </td><td> Taglia M 0,15 millimetri </td><td></td></tr><tr><td> Pet Trimmer compatto </td><td> Wahl Clipper Corp. </td><td> Modello 9966 </td><td> Pulire dopo ogni utilizzo </td></tr></tbody></table>

the mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation

In tutto il corpo, il mantenimento dell&#39;omeostasi richiede l&#39;apporto costante di ossigeno e sostanze nutritive concomitante con rimozione di sottoprodotti metabolici. Questo equilibrio si ottiene il movimento del sangue attraverso la microcircolazione, che comprende il più piccolo rami della fornitura vascolare in tutti i tessuti e organi. Ramo arteriole dalle arterie a formare reti che controllano la distribuzione e la grandezza di sangue ossigenato scorre nella moltitudine di capillari intimamente associata con le cellule parenchimali. Capillari forniscono un&#39;ampia superficie per lo scambio diffusionale tra le cellule dei tessuti e l&#39;afflusso di sangue. Venule raccogliere effluenti capillare e convergere il loro ritorno deossigenato sangue verso il cuore. Per osservare questi processi in tempo reale richiede un approccio sperimentale per la visualizzazione e la manipolazione del microcircolo vivente. Il muscolo cremastere di ratti è stato usato come modello per studiare l&#39;infiammazione con istologia e microscopia elettronica a 1,2 post mortem. Il primo in rapporto vivo del muscolo cremastere ratti esposti intatto indagato microvascolari risposte ai farmaci vasoattivi con luce riflessa 3. Tuttavia curvatura del muscolo e la mancanza di illuminazione focalizzata limitato l&#39;utilità di questa preparazione. L&#39;importante passo avanti comportato l&#39;apertura del muscolo, distogliendolo dal testicolo e diffonderla radialmente come una lastra piana per transilluminazione sotto un microscopio composto 4. Mentre dimostrato di essere una preparazione utile per studiare la fisiologia del microcircolo nei ratti criceti 5 e 6, il muscolo cremastere nei topi 7 ha dimostrato particolarmente utile nel sezionare percorsi cellulari coinvolti nella regolazione della funzione microvascolare 8-11 e imaging in tempo reale di intercellulare segnalazione 12. Il muscolo cremastere è derivata dalla muscoli interni addominale obliquo e trasversale come i testicoli scendono attraverso il canale inguinale 13. Serve a sostenere (in greco: cremastere bretella =) e mantenere la temperatura dei testicoli. Come descritto qui, il muscolo cremastere è preparato come un sottile foglio appartamento in eccellente risoluzione ottica. Con il mouse mantenuti ad una temperatura corporea stabile e piano di anestesia, la preparazione chirurgica comporta liberando il muscolo dal tessuto circostante e testicoli, diffondendolo sul piedistallo trasparente di gomma silastic e garantire i bordi con perni insetti mentre si continua l&#39;irrigazione con soluzione salina fisiologica . Il presente protocollo utilizza topi transgenici che esprimono GCaMP2 arteriolare in cellule endoteliali. GCaMP2 è geneticamente codificato indicatore fluorescente 12 di calcio molecola. Widefield di imaging e di un intensificato ad accoppiamento di carica fotocamera del dispositivo consentono studio in vivo di segnalazione calcio nel endotelio arteriolare.

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The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Una preparazione dei tessuti è descritto per la visualizzazione e manipolazione sperimentale del microcircolo viventi. In anestetizzati topi maschi, il sottile, altamente vascolarizzata muscolo cremastere è preparato per la microscopia intravitale per studiare le reti microvascolare tra arteriole, capillari e venule. Questa preparazione è facilmente adattato per ratti e criceti.

La preparazione muscolare mouse Cremaster for Imaging intravitale del microcircolo

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

32.2K Views.  University of Missouri. Una preparazione dei tessuti è descritto per la visualizzazione e manipolazione sperimentale del microcircolo viventi. In anestetizzati topi maschi, il sottile, altamente vascolarizzata muscolo cremastere è preparato per la microscopia intravitale per studiare le reti microvascolare tra arteriole, capillari e venule. Questa preparazione è facilmente adattato per ratti e criceti.

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The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Ricerca

Biologia

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophoresis e Micromanipolazione per intravitale Imaging di fluorescenza del microcircolo

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l&#39;analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

L&#39;isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparazione del campione per l&#39;analisi di massa Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualizzazione e la quantificazione dello strato acellulare nelle arteriole del muscolo Cremaster Rat

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...