The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

Gli studi su animali sono stati effettuati nel quadro di un protocollo approvato dalla cura degli animali istituzionale e utilizzano Comitato al Virginia Polytechnic Institute e State University. 1. Setup (Tempo: ~ 45 min) <ol><li> Scongelare depositi congelati di 0,25% tripsina, isolamento tampone per mitocondri (IBM) 1 e IBM2 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Sciacquare vetreria e strumenti di dissezione in etanolo al 70% e poi con acqua ad elevata purezza. </li><li> Preparare la soluzione tripsina 0,05% dal 0,25% tripsina magazzino diluendo 1 parte di tripsina in 4 parti IBM1. </li><li> Mescolare proteasi e fosfatasi inibitore cocktail con tampone di lisi cellulare (1: 100 ratio) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga con tappo a vite. </li><li> Aliquote 5 ml (5 ml / topo) di 0,05% tripsina in un tubo di plastica da 15 ml. </li><li> Impostare motorizzato omogeneizzatore tessuto a 80 giri. </li></ol> 2. Isolamento del muscolo scheletrico mitocondri (Tempo: ~ 90 min) <ol><li> L&#39;eutanasia di un mouse da CO 2 </sub&gt; inalazione, seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Rimuovere muscolo rosso dal quadricipite e del muscolo gastrocnemio, che comprende il soleo (~ 75-100 mg totale) come descritto nei seguenti passaggi: <ol><li> Sbucciare la pelle verso il mouse. </li><li> Rimuovere il cuscinetto di grasso sopra il punto di origine del quadricipite. Tagliare il tendine del quadricipite che è collegato alla rotula con sottili forbici a punta. Nota: Il quadricipite è identificato dalla sua posizione anatomica sulla parte anteriore del femore prossimale. </li><li> Lentamente tagliare l&#39;aponeurosi tra l&#39;osso e il quadricipite, evitando l&#39;arteria femorale, per liberare i quadricipiti dall&#39;osso. Tagliare il tendine con sottili forbici a punta in corrispondenza del punto di origine sul femore per liberare il muscolo quadricipite e posizionare il muscolo quadricipite in refrigerate PBS. </li><li> Rimuovere il tessuto adiposo visibile sopra il quadricipite con le forbici. Vibrazione quadricipiti sopra in modo che la porzione del muscolo che è stato sovrapposto il femore sta affrontando up. Aprire il muscolo quadricipite con una pinza in un movimento rotatorio. Rimuovere le due porzioni muscolari rosse visibili da ogni lobo con ammenda forbici a punta e mettere in un bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1. Nota: muscolo quadricipite appaiono come due lobi con una striscia di muscolo rosso si trova vicino al bordo laterale di ciascun lobo. </li><li> Tagliare la pelle sovrastante il tendine di Achille con ammenda punta forbici e sbucciare la pelle verso il mouse. Tagliare il tendine di Achille esposto e staccare il muscolo verso il corpo del mouse. </li><li> Tagliare il tendine ai condili mediale e laterale del femore con sottili forbici a punta per liberare il gastrocnemio e collocare il gastrocnemio attaccato ai suoi tendini in refrigerata PBS. </li><li> Capovolgere il gastrocnemio sopra e staccare il muscolo soleo e mettere nel bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1. Fan aprire il gastrocnemio. Rimuovere le tre porzioni visive rosse muscolari (due strisce rosse laterali e uno mediale superficiale) con multa forbice a puntas e trasferirli al bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1. </li></ol></li><li> Rimuovere un&#39;altra ~ 75-100 mg di muscolo rosso dalla altra gamba del mouse (come descritto al punto 2.2) e posto in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga con proteasi e fosfatasi inibitore cocktail e tampone di lisi cellulare (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, NaCl 150 mm, 1% dodecil solfato di sodio, 0,5% deossicolato di sodio, 1% Poliossietilene (9) nonylphenylether, ramificata. Subito lampeggiare-freeze questo secondo campione in azoto liquido per un uso successivo a assorbente occidentale (vedi punto 6.1). </li><li> Mettere una superficie di plastica piatta pre-raffreddata su ghiaccio in un grande secchio. Versare una goccia di IBM1 sulla superficie di plastica e utilizzare pinzette per mettere tutti del muscolo rosso sezionato (passo 2.2.4 e 2.2.7) in IBM1 goccia. Tritare il tessuto muscolare per 2 minuti utilizzando 3 singole lame di rasoio bordo cambiando rasoi ogni 40 sec. </li><li> Trasferire il tessuto tritato in un becher con 5 ml di IBM1 fresco tenendo superficie plastica sopra the becher e raschiare il muscolo nel becher con una lama di rasoio. Prendete questa soluzione e di scarico attraverso un colino cella di 100 micron collocato su un tubo da 50 ml. </li><li> Tamponare il tessuto con un tergicristallo compito delicato e poi trasferisce in 5 ml della soluzione di tripsina 0,05%. Utilizzare pinzette per rimuovere il tessuto dal tergicristallo compito. </li><li> Incubare il tessuto muscolare in ghiaccio per 30 minuti in soluzione tripsina 0,05%. </li><li> Gira le tubo da 15 ml miscela contenente tripsina / muscolo a 200 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Versare il surnatante tripsina in un contenitore per rifiuti e risospendere il pellet con 3 ml di ghiaccio freddo IBM1. Trasferire il tessuto 45 ml tubo omogeneizzatore vetro. Sciacquare i tubo da 15 ml con un altro 1,5 ml IBM1 raccogliere qualsiasi campione rimanente e aggiungere questo al tubo omogeneizzatore vetro. </li><li> Posizionare il tubo di omogeneizzatore vetro in un bicchiere o contenitore di plastica pieno di ghiaccio a metà strada quindi l&#39;omogeneizzatore vetro si muove minimamente all&#39;interno del bicchiere. </li><li&gt; Omogeneizzare la miscela di tessuti / IMB1 con il pestello in PTFE collegati ad un comando a motore omogeneizzatore tessuto con 10 passaggi a 80 giri al minuto. Tenere la parte inferiore di ogni pass per ~ 2 sec. </li><li> Trasferire il tessuto omogenato di un nuovo tubo da 15 ml conica e sciacquare il tubo omogeneizzatore vetro con 6,5 ml di IBM1. Versare il IBM1 nel tubo da 15 ml contenente tessuto omogenato. </li><li> Spin tubo conico da 15 ml a 700 g per 10 minuti a 4 ° C. Delicatamente versare il surnatante in una provetta da centrifuga ad alta resistenza vetro e scartare il pellet. </li><li> Spin il supernatante dal passo a 8000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante IBM1 e risospendere il pellet aggiungendo lentamente 500 ml di IBM2. Tagliare la fine di un puntale e omogeneizzare delicatamente il pellet in IBM2 con miscelazione e agitazione movimenti. Aggiungere altri 4,5 ml di IBM2 alla miscela dopo il pellet è completamente sospesa. Nota: Evitare l&#39;eccessiva triturazione mentre rompendo pezzi pellet più grandi come tla sua può danneggiare le membrane mitocondriali. </li><li> Spin l&#39;omogeneizzato / tessuto IBM2 a 8000 xg per 10 minuti a 4 ° C. Nota: Questo passaggio può essere ripetuto in una provetta pulita centrifuga ad alta resistenza per più precisa quantificazione delle proteine ​​di mitocondri isolati al punto 4 dal residuo BSA può contribuire al contenuto totale di proteine. </li><li> Rimuovere il surnatante e delicatamente, ma completamente risospendere il pellet con l&#39;aggiunta di due incrementi 25 microlitri di IBM2 con un puntale con il suo punto di taglio. Mescolare delicatamente e miscelare il pellet dopo ogni aggiunta di 25 ml di IBM2. Mettere questo stock mitocondriale su ghiaccio. </li></ol> 3. omogeneizzazione di tutto il tessuto lisato (Tempo: ~ 45 min; può essere effettuato durante Passo 7) <ol><li> Rimuovere il muscolo da che è stato posto in azoto liquido dal punto 2.3 e incubare a temperatura ambiente fino completamente scongelati. </li><li> Tritare il tessuto per ~ 30 secondi sul ghiaccio con pregiati forbici a punta. </li><li> Aggiungere due cucchiai 100 microlitri di ZircoPerline in ossido di zirconio alla provetta da 1,5 ml microcentrifuga con tappo a vite dal punto 3.2 che contiene il tessuto tritato. Omogeneizzare il tessuto in un omogeneizzatore tessuto mulino tallone con due o tre cicli di 5 min ad una impostazione di velocità di 4-6 (regolazione media). </li><li> Spin la miscela dal punto 3.3 a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con una pipetta 1000 ml punta dopo lo spin e il trasferimento in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Eliminare il pellet e posizionare il surnatante su ghiaccio. </li></ol> 4. Determinazione delle proteine ​​(Tempo: ~ 30 min) <ol><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​di tutto il lisato tissutale (punto 3.4) e magazzino mitocondriale (passo 2.17) utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​BCA secondo le specifiche del costruttore. </li></ol> 5. I mitocondri Membrana di integrità; Citrato sintasi (CS) Attività (Tempo: ~ 15 min) <ol><li> Fare due separati 1: 20 diluizioni dello stock mitocondriale in acqua ad elevata purezza. Aggiungere0,1% di Triton 100-X per un campione e sonicare è a un livello basso (765 watt, l&#39;ampiezza di 2). Lasciare l&#39;altra soluzione sul ghiaccio. Riportare il campione ghiaccio dopo sonicazione. </li><li> Eseguire un test citrato sintasi sia con il non-sonicato e sonicato diluizioni mitocondriali utilizzando un saggio spettrofotometrico precedentemente descritto 11,12. </li><li> Determinare la percentuale delle membrane mitocondriali intatte in base alle seguenti equazioni: (Attività CS non sonicato ÷ sonicato CS attività) * 100 </li></ol> 100- N (cento raggiunto da sopra) 6. I mitocondri isolamento di qualità; Western Blotting (Tempo: Secondo Lab Protocol) <ol><li> Eseguire Western blotting su tutta lisato tissutale e mitocondri isolati come descritto in precedenza 12. Nota: Utilizzare anticorpi primari per GAPDH (1: 1.000 diluizione 5% BSA / TBS-T) e COXIV (1: 1.000 diluizione 5% senza grassiLatte / TBS-T), seguita da anti-capra, e anticorpi secondari di coniglio, rispettivamente, (1: 10.000). </li></ol> 7. respirometrici Assay Run (Tempo: ~ 90 min) <ol><li> Effettuare test respirometrici desiderati usando basato O 2 tecnologia di misurazione del consumo di micropiastre come descritto in precedenza (vedi articolo correlato e Rogers et al 8). </li><li> Determinare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) dividendo Stato 3 per Stato 4o (RCR) o dividere 3u Stato per Stato 4o. Utilizzare il mezzo (media) il punto, o il più alto (Stato 3) e tariffe più basse (4o Stato) dal punto a punto le tracce per determinare RCR. </li></ol>

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George Rogers is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument for which this protocol was modified.

I metodi qui presentati forniscono una descrizione dettagliata di una procedura di isolamento mitocondriale da quantità minime (~ 75-100 mg) di topo muscoli scheletrici. Questa procedura di isolamento è in grado di produrre ad alto funzionamento, i mitocondri puro (~ 450 mg) come evidenziato da O 2 tassi di consumo, valori RCR, la massima attività citrato sintasi e di espressione proteica da immunoblotting. È importante sottolineare che i mitocondri isolati da questa procedura può essere utilizzato per più saggi respirometirc con tecnologia basata consumo micropiastra O 2 che consente un throughput elevato. L&#39;isolamento dei mitocondri dei muscoli scheletrici spesso richiede metodi duri per liberare i mitocondri da tessuto connettivo circostante e proteine ​​strutturali 7,16. Di conseguenza, le membrane mitocondriali possono diventare perturbato, compromettendo così l&#39;attività (e quindi l&#39;accuratezza) mitocondriale consumo di O 2 durante la successiva respiromesaggi elettriche. Includendo un passaggio aggiuntivo di tessuto macinazione usando lame di rasoio dopo l&#39;asportazione del tessuto di un protocollo precedentemente descritto 7, una velocità del rotore significativamente ridotta per motore omogeneizzazione guidato era possibile (80 rpm vs. 1.600 rpm). Queste tecniche di omogeneizzazione e risospensione dolci porta ad una elevata percentuale di mitocondri con membrane intatte (92,5 ± 2,0%), come valutato dall&#39;attività citrato sintasi seguendo la procedura di isolamento. I nostri risultati sono coerenti con Asmann et al. 17, che riportano tra 90-95% intatte preparati mitocondriali seguente isolamento dal muscolo scheletrico umano. È importante notare che la misurazione dell&#39;attività citrato sintasi è più adatto per misurare l&#39;integrità fisica delle membrane mitocondriali e non deve essere usato per valutare l&#39;integrità funzionale dei mitocondri isolati. D&#39;altra parte, O 2 saggi di consumo e determinare RCR ottenuti in questi test dovrebbero essere utilizzati per meache la funzione di mitocondri isolati 1. Inoltre, RCR può anche essere utilizzato come indicatore di mitocondri accoppiati. Pertanto, l&#39;OCR e stati mitocondriali entro un intervallo tipico dal piruvato / malato dosaggio 8, ei valori elevati RCR ottenuti da una varietà di saggi respirometrici indica che i mitocondri derivati ​​da questo protocollo sono strettamente accoppiati e altamente funzionale. Isolamento dei mitocondri intatti e puri ha importanti implicazioni per le analisi respirometic. La contaminazione di proteine ​​non mitocondriali nella preparazione mitocondriale finale può causare caricamento quantità di proteina mitocondriale disuguali ad ogni pozzetto durante le misurazioni consumo di O 2, diminuendo così la precisione di qualsiasi confronto tra esperimenti effettuati utilizzando diverse preparazioni di mitocondri. Inoltre, la contaminazione della preparazione mitocondriale con altri organelli che respirano (ad esempio, perossisomi) can diminuire ulteriormente la precisione delle misurazioni consumo di O 2. La presenza della proteina mitocondriale interna, COXIV, e l&#39;assenza di una fascia importante della citosolica (e potenzialmente nucleare) proteine, GAPDH, nella nostra preparazione isolato mitocondriale seguente immunoblotting è indicativo di scarsa contaminazione da fonti non mitocondriali durante la procedura di isolamento . È importante notare che, sebbene l&#39;isolamento di una preparazione mitocondriale purificata è importante rispetto a quanto sopra citato, il mantenimento dell&#39;integrità mitocondriale è di estrema importanza in saggi respirazione. La membrana mitocondriale esterna può essere facilmente danneggiata durante la procedura di isolamento, che porta alla fuga di citocromo c nel buffer isolamento e divenendo così limitante nel consumo di O 2 e la sintesi di ATP 18. Pertanto, l&#39;integrità dei mitocondri isolati può essere ulteriormente valutata quantificando citocromoec espressione della proteina nel supernatante della preparazione mitocondriale (passo 2.15, prima della risospensione) e nei mitocondri isolati con Western blotting. Citocromo c non dovrebbe essere presente nella preparazione supernatante mitocondriale se le membrane mitocondriali sono intatte seguendo le procedure di isolamento. Tutte le fasi di questo protocollo sono importanti, ma ci sono tre passaggi critici di questo protocollo. In primo luogo, la macinazione di rosso muscolo scheletrico con tre differenti lame (punto 2.4) è fondamentale, perché questo passaggio permette velocità del rotore più lente durante la fase di omogeneizzazione (passo 2.11). In secondo luogo, le prestazioni di molti passaggi su ghiaccio o in tamponi refrigerati è fondamentale per mantenere i mitocondri in uno stato di riposo prima saggi respirometrici su micropiastra. Infine, la risospensione dolce del pellet mitocondri in IBM2 è della massima importanza. Mescolare delicatamente mantiene l&#39;integrità mitocondriale, che è cruciale per resp precisosaggi irometic. Alcuni limiti di questa tecnica sono degni di nota. Innanzitutto, l&#39;apparecchiatura necessaria (ad esempio, ultracentrifuge, motorizzato omogeneizzatore, etc.) per eseguire la procedura di isolamento può essere costoso. Inoltre, sono necessari diversi metodi di controllo della qualità al fine di garantire mitocondri puliti e intatti. Tuttavia, una volta che il ricercatore è esperto nella procedura di isolamento, mitocondri alta qualità sono ceduti che può essere utilizzato in una moltitudine di misurazioni compresi, ma non limitati a: Western blot, saggi enzimatici, RT-PCR, PCR, H 2 O 2 saggi , misure e alta produttività micropiastre respiratorie. È importante notare che questa procedura di isolamento è stato ottimizzato e modificato per piccole quantità di topo muscoli scheletrici e cautela dovrebbe essere presa quando si tenta di applicare tecniche di isolamento da un dato tessuto dalla stessa specie (e anche allo stesso tessuto da specie diverse ) ad altri tessuti / species. Per ottenere risultati ottimali, la ricerca della letteratura sarà l&#39;opzione migliore quando si cerca di trovare il miglior metodo di isolamento per i tessuti / specie destinate.

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies3-5.
Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays. 
Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several &#181;g per well8. Therefore, we present a modification of previously published methods7 to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O2 consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research9,10.

<table><tbody><tr><td>Essentially Fatty</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acid Free- BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris/HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6511</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>N/A</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium Chloride&lt;br/&gt; White Crystals or Crystalline Powder&lt;br/&gt; &amp;ge;99.0 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771&amp;nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750&amp;nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Single Edge Razor Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>352360</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Halt Protease &amp;amp; Phosphatse Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861284</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap</td><td>Thermo Scientific</td><td>3474</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zirconium Oxide beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>C9012112</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH antibody (1D4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-59540</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Anti- COXIV antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4844s</td><td>Any mitochondrial inner membrane protein will suffice</td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>711-035-152</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>115-001-003</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pyruvic Acid, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>Store at 4 &amp;deg;C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td>Succinic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &amp;ge;95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oligomycin A, &amp;ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Store at 2-8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>phenylhydrazone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;ge;98% (TLC), powder [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A from streptomyces sp.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>Store at -20 &amp;deg;C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Store at room temperature</td></tr></tbody></table>

isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Disfunzionali mitocondri dei muscoli scheletrici hanno un ruolo nel metabolismo alterato osservata con l&#39;invecchiamento, l&#39;obesità e il diabete di tipo II. Saggi respirometrici mitocondriali da isolate preparati mitocondriali consentono la valutazione della funzione mitocondriale, nonché la determinazione del meccanismo (s) d&#39;azione dei farmaci e proteine ​​che modulano il metabolismo. Procedure di isolamento attuali richiedono spesso grandi quantità di tessuto per produrre mitocondri di alta qualità necessari per le analisi respirometrici. I metodi qui presentati descrivono come di alta qualità mitocondri purificato (~ 450 mg) può essere isolato da quantità minime (~ 75-100 mg) di topo muscolo scheletrico per l&#39;uso in misure respiratorie throughput elevato. Abbiamo determinato che il nostro metodo di isolamento si ottiene il 92,5 ± 2,0% mitocondri intatti misurando l&#39;attività citrato sintasi spettrofotometricamente. Inoltre, l&#39;analisi Western Blot in mitocondri isolati portato alla debole espressione del cytosoproteine ​​lic, GAPDH, e il robusto espressione della proteina mitocondriale, COXIV. L&#39;assenza di una banda di GAPDH prominente nei mitocondri isolati è indicativo di poco la contaminazione da fonti non-mitocondriali durante la procedura di isolamento. Soprattutto, la misura di O 2 tasso di consumo con tecnologia basata micropiastra e determinare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) per saggi respirometrici accoppiati mostra altamente accoppiate (RCR;&gt; 6 per tutti i saggi) e mitocondri funzionali. In conclusione, l&#39;aggiunta di una fase di macinazione separata e riducendo significativamente motorizzato velocità omogeneizzazione di un metodo riportato in precedenza ha permesso l&#39;isolamento di alta qualità e mitocondri purificati da piccole quantità di topo muscoli scheletrici che si traduce nei mitocondri altamente accoppiate che respirano con alta funzione durante micropiastra saggi respirometirc.

Attività citrato sintasi serve come misura per l&#39;integrità della membrana dal citrato sintasi si trova nella membrana mitocondriale interna, e quindi non dovrebbero essere presenti nelle sospensioni di mitocondri con membrane intatte. La Figura 1 rappresenta l&#39;attività citrato sintasi in campioni non sonicato mitocondriali rispetto sonicato campioni dello stesso isolamento. Sonicating i risultati dei mitocondri in un aumento statisticamente significativo nell&#39;attività citrato sintasi (P &lt;0,01). È importante sottolineare che il 92,5 ± 2,0% dei mitocondri erano intatti dopo l&#39;isolamento. La figura 2 illustra GAPDH ed espressione COXIV nei mitocondri isolati e l&#39;intero lisato tessuto muscolare scheletrico. GAPDH è una proteina localizzata nel citosol, ma può anche essere trovato nel nucleo dopo traslocazione, mentre COXIV è una proteina trova nella membrana mitocondriale interna. L&#39;espressione di GAPDH e COXIV sono evidenti in tutta tisslisato ue. Nel mitocondri isolati, espressione di COXIV si osserva, mentre solo deboli bande di GAPDH sono evidenti. Questi risultati indicano buoni isolamenti mitocondriali, con poca contaminazione da componenti non mitocondriali durante la procedura di isolamento. La figura 3 è un tracciato rappresentante dei tassi di consumo di O 2 (OCR) in funzione del tempo per un test di accoppiamento (malate 10 mM di piruvato / 5 mm) eseguite dai mitocondri isolati utilizzando questo protocollo e eseguite con base di O 2 tecnologia consumo micropiastre. Ogni pannello rappresenta consumo di O 2 in diversi stati mitocondriali come descritto da Chance e Williams 13. Il primo pannello rappresenta basale consumo di O 2, o Stato 2. Il secondo pannello, dopo l&#39;iniezione di ADP, rappresenta la massima accoppiato respirazione, o Stato 3. Il terzo pannello, dopo l&#39;iniezione di oligomicina A (un inibitore del Complesso V), representi respirazione a causa della perdita di protoni, o dello Stato 4o. Il quarto pannello, dopo l&#39;iniezione di FCCP, rappresenta la massima respirazione disaccoppiati, o 3U Stato. Infine, il quinto pannello, dopo l&#39;iniezione di Antimicina A, rappresenta l&#39;inibizione della respirazione ossidativa. Il rapporto di controllo respiratorio (RCR), una misura della funzione mitocondriale 1, è stato calcolato dividendo Stato 3 per Stato 4o. Tabella 4 sono riportati i valori medi RCR per le prove di accoppiamento substrato alternative che possono essere eseguite dal rendimento mitocondri da questo protocollo. È importante sottolineare che il consumo di O 2 tracciamento e gli alti valori RCR rappresentano altamente funzionante e mitocondri accoppiati. RCR valori qui riportati sono superiori o simili di quanto precedentemente riportato mediante protocolli di isolamento simili a murino muscolo scheletrico 7,14,15, accentuando così l&#39;alta qualità dei mitocondri isolati durante questa procedura. Figura 1: citrato sintasi attività. Citrato sintasi attività enzimatica come determinato spettrofotometricamente in preparazioni non sonicati e sonicati mitocondri. I valori sono espressi come media ± SEM. ** p &lt;0.01. I dati rappresentano n = 3 accoppiato repliche biologiche e relativa espressa in mg di proteina. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53217/53217fig1.jpg" /> Figura 2:. Citosolico e l&#39;espressione della proteina mitocondriale in mitocondri isolati e intero lisato tessuto Sia mitocondri isolati e intere lisati di tessuto sono stati immunoblotted con COXIV e anticorpi GAPDH. La proteina mitocondriale, COXIV, era evidente in entrambi i campioni, tuttavia GAPDH era solo debolmente evidente nei mitocondri isolati. L&#39;assenza di una banda GAPDH prominente in the mitocondri isolati è indicativo di poco la contaminazione da fonti non-mitocondriali durante la procedura di isolamento. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53217/53217fig3.jpg" /> Figura 3:. Tracciamento Rappresentante di test accoppiamento con mitocondri isolati da topo muscoli scheletrici 10 malato mM piruvato / 5 mm accoppiato mitocondriali tracciati del test di respirazione come determinato dalla misurazione multi-bene di consumo di O 2. I valori sono espressi come media ± SD. Proteina mitocondriale caricato per bene era di 2,5 mg. OCR = O 2 tasso di consumo; ADP = adenosina difosfato; Oligo = Oligomicina A; FCCP = carbonile cyanide- 4 - (trifluorometossi) fenilidrazone; Anti-A = Antimicina A. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reagente </td><td> Concentrazione di stock </td><td><strong&gt; MW </td><td> Volume finale </td><td> Messa Aggiunto </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (g / mol) </td><td> (ml) </td><td> (g) </td></tr><tr><td> Tris / HCl, pH 7,4 </td><td> 2 </td><td> 157.56 </td><td> 250 </td><td> 78,8 </td></tr><tr><td> Tris / HCl, pH 7,4 </td><td> 1 </td><td> 157.56 </td><td> 250 </td><td> 39.39 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 1 </td><td> 74.55 </td><td> 500 </td><td> 37.28 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> 1 </td><td> 121.14 </td><td> 100 </td><td> 12.11 </td></tr><tr><td> EDTA, pH 8 </td><td> 0.5 </td><td> 416,2 </td><td> 100 ml (in 1 M Tris Base) </td><td> 20.81 </td></tr><tr><td> EGTA, pH 7,2 </td><td> 0.1 </td><td> 380,35 </td><td> 100 (in 1 M Tris Base) </td><td> 3,801 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: preparazione delle soluzioni madre. <table border = cellpadding &quot;0&quot; = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> Reagente </td><td> Concentrazione di stock </td><td> Messa Aggiunto </td><td rowspan="2"> Molarità Finale / Percentuale </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (go ml) </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> - </td><td> 11.47 g </td><td> 67 mM </td></tr><tr><td> Tris / HCl, pH 7,4 </td><td> 2 </td><td> 12,5 ml </td><td> 50 mm </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 1 </td><td> 25 ml </td><td> 50 mm </td></tr><tr><td> EDTA / Tris Base, pH 8 </td><td> 0.5 </td><td> 10 ml </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Essenzialmente FA gratuito BSA </td><td> - </td><td> 1 g </td><td> 0.20% </td></tr><tr><td colspan="4"> pH 7.4, 500 ml: Aliquota 50 ml e congelare </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Preparazione di isolamento tampone per mitocondri 1 (IBM1).<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reagente </td><td> Concentrazione di stock </td><td> Messa Aggiunto </td><td rowspan="2"> Molarità Finale / Percentuale </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (go ml) </td></tr><tr><td> D-mannitolo </td><td> - </td><td> 10,9 g </td><td> 200 MM </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> - </td><td> 7,188 g </td><td> 70 MM </td></tr><tr><td> EGTA / Tris Base </td><td> 0.1 </td><td> 15 ml </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 7.4 </td><td> 1 </td><td> 3 ml </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td colspan="4"> pH 7.4, 300 ml: Aliquota 15 ml e congelare </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Preparazione di isolamento tampone per mitocondri 2 (IBM2). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody&gt; <tr><td> Substrato media </td><td> Concentrazione finale </td><td> RCR </td></tr><tr><td> Piruvato / Malate </td><td> 10 mM / 5 mM </td><td> 16.2 ± 4.6 </td></tr><tr><td> Succinate / Rotenone </td><td> 10 mm / 2 micron </td><td> 10.6 ± 3.8 </td></tr><tr><td> Palmitoil L-Carnitina / Malate </td><td> 40 mM / 1 Malate mM </td><td> 6,7 ± 0,6 </td></tr><tr><td> Il glutammato / Malate </td><td> 10 mM / 10 mM </td><td> 8.6 ± 0.4 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: Rapporti di controllo delle vie respiratorie per Coupled rapporti di controllo mitocondriale respirazione Assays respiratorie come determinato dalla prima misurazione O 2 consumi con test respirometrici su micropiastra, seguiti dividendo massima accoppiato respirazione (ADP stimolata Stato 3) con la respirazione a causa di perdita protonica (Oligomicina. Uno Stato 4o risposta). I valori sono espressi come meuna SE ±. Proteina mitocondriale caricato per bene era di 2,5 mg per il piruvato / malato e succinato / saggi rotenone, e 3,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto per il palmitoil L-carnitina / malato e glutammato / saggi malate.

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Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  Virginia Tech. Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

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Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, mitochondria exist in a series of complex morphologies, ranging from small oval organelles to a broad, reticulum-like network. Understanding how the mitochondrial reticulum expands and develops in response to diverse stimuli such as alterations in energy demand has long been a topic of research. A key aspect of this growth, or biogenesis, is the import of precursor proteins, originally encoded by the nuclear genome, synthesized in the cytosol, and translocated into various mitochondrial sub-compartments. Mitochondria have developed a sophisticated mechanism for this import process, involving many selective inner and outer membrane channels, known as the protein import machinery (PIM). Import into the mitochondrion is dependent on viable membrane potential and the availability of organelle-derived ATP through oxidative phosphorylation. Therefore its measurement can serve as a measure of organelle health. The PIM also exhibits a high level of adaptive plasticity in skeletal muscle that is tightly coupled to the energy status of the cell. For example, exercise training has been shown to increase import capacity, while muscle disuse reduces it, coincident with changes in markers of mitochondrial content. Although protein import is a critical step in the biogenesis and expansion of mitochondria, the process is not widely studied in skeletal muscle. Thus, this paper outlines how to use isolated and fully functional mitochondria from skeletal muscle to measure protein import capacity in order to promote a greater understanding of the methods involved and an appreciation of the importance of the pathway for organelle turnover in exercise, health, and disease.

Mitochondria are key metabolic organelles that exhibit a high level of phenotypic plasticity in skeletal muscle. The import of proteins from the cytosol is a critical pathway for organelle biogenesis, essential for the expansion of the reticulum and the maintenance of mitochondrial function. Therefore, protein import serves as a barometer of cellular health.

Misurazione della capacità di importazione di proteine dei mitocondri del muscolo scheletrico

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Biochimica

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Medicina

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biologia

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento mitocondriale dai roditori per studi bioenergetici di alta qualità

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry to study metabolic impairments and disease. Consistent mitochondrial quality is necessary to properly investigate mitochondrial physiology and bioenergetics; however, many different published isolation methods are available for researchers. Although different experimental strategies require different isolation methods, the basic principles and procedures are similar. This protocol details a method capable of extracting well-coupled mitochondria from a variety of tissue sources, including small animals and cells. The steps outlined include organ dissection, mitochondrial purification, protein quantification, and various quality control checks. The primary quality control metric used to identify high-quality mitochondria is the respiratory control ratio (RCR). The RCR is the ratio of the respiratory rate during oxidative phosphorylation to the rate in the absence of ADP. Alternative metrics are discussed. While high RCR values relative to their tissue source are obtained using this protocol, several steps can be optimized to suit the individual needs of researchers. This procedure is robust and has consistently resulted in isolated mitochondria with above-average RCR values across animal models and tissue sources.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Scoprire il ruolo del fosfato di calcio mitocondriale nell'insufficienza cardiaca e nella bioenergetica

Bioenergetic and metabolomic studies on mitochondria have revealed their multifaceted role in many diseases, but the isolation methods for these organelles vary. The method detailed here is capable of purifying high-quality mitochondria from multiple tissue sources. Quality is determined by respiratory control ratios and other metrics assessed with high-resolution respirometry.

Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori 

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

L'isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Misurazione della capacità di importazione di proteine dei mitocondri del muscolo scheletrico

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico

Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori

Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori

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Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico