Yazarların laboratuar araştırmalar, Ulusal Sağlık hibe R37-HL041026, R01-HL086483 ve R01-HL056786 (SSS) ve Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi F32-HL097463 ve T32-AR048523 (PB) Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.

1. Fare kurulu, kas kaide, vücut kama ve superfusion çözümü <ol><li> Fare kurulu: şeffaf bir dikdörtgen Pleksiglas kartı (6 &quot;geniş X 8&quot; uzun X 3 / 16 &quot;kalın) mikroskop sahne sığacak şekilde yapılır.&quot; Anestezi fare cerrahi hazırlanması sırasında güvenli olduğu fare board &quot; Cremaster&#39;ın kas. </li><li> Kas kaide: şeffaf silastik kauçuk kaide, üreticinin ° talimatlarına göre karışık Sylgard 184, hazırlanır. Uygun bir kalıp, 15 mm kalınlığında x 50 mm çap çap tek Petri kabı. Sylgard blok bir jilet (Şekil 1C bakın.) Istenilen şekilde kesilir. Berrak su geçirmez silikon yapıştırıcı ince bir tabaka fare kuruluna Sylgard blok güvence altına almak için kullanılır. Faydalı ipuçları: Petri kabı içine Sylgard dökme, bir saat için bir vakum odasında gaz alma, sonra hava kabarcıkları ortadan kaldırır ve netliğini artırır. Sylgard için süre 50 ° C&#39;de birkaç saat için bir laboratuvar fırın, bulaşık koyarak kısalır kür, gaz alma sonra. </li><li> Vücut kama ve ısıtma platformu: fare altında ve kaide karşı konumlandırılmış bir kama (2 &quot;X 4&quot; X 15 °) kökeni kaide üzerinde Cremaster&#39;ın kas uzanan kolaylaştırır, vücudun ileri yatırır. Yüzeyine alüminyum bir platformda birleştiren iletken ısı sağlar. Bu platform, bir DC güç kaynağı (Şekil 1A) bağlı dirençler tarafından ısıtılır. Kalibre platform sıcaklığı ~ 40 ° C ~ 37 özofagus sıcaklığı korur ° C Aksi takdirde, bir lamba radyant ısı kullanılır. </li><li> Pins. Cremaster&#39;ın kas kaide üzerinde güvenli hale getirmek için bir &quot;L&quot; şeklini içine bükülmüş 0.15 mm böcek pimleri, iğne hazırlanır. </li><li> Fizyolojik tuz solüsyonu (PSS). Hazırlıklar ultra saf (M 18.2) H 2 O. hazırlanan bikarbonat-tamponlu PSS sürekli superfused (sulanan) Stok çözümleri 20X son çalışma konsantrasyonda hazırlanan ve 0,2 mikron filtre ile sterilize edilir. 4 saklandığında Stok çözümleri birkaç hafta için iyi kalır ° C Bikarbonat tuzları ayrı ayrı hazırlanması ve deney günü seyreltme ile karıştırılarak kalsiyum bikarbonat yağış önler. Stok tuz solüsyonu (mmol / L): 2638 NaCl, 94 KCl, 40 MgS0 4, 23.4 CaCl 2 oluşur. Stok bikarbonat 360 NaHCO 3. Bir denemenin yapıldığı gün, ilgili çözümler ölçülü balona son hacmi (genellikle belirli bir deney için 2 L) getirilir ve bir su banyosuna yerleştirilir ~ 37 ° C&#39;de PSS değişikti% 5 CO 2 / ~ 15 dakika bir gaz dağıtıcı kullanarak% 95 N 2 ~ 7.4 pH ayarlar ve yağış önler. PSS% 5 CO 2 /% 95 N 2 deneyler boyunca sürekli kabarmış. Son çalışma çözeltisi bileşimi (mmol / L): 132 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgS0 4, 2 CaCl 2, 18 NaHCO 3. </li></ol> 2. Anestezi ve ameliyat için hazırlık <ol><li> Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayından sonra, en az 12 hafta eski erkek fareler kullanılır. Fare pentobarbital sodyum (60 mg / kg) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi. Frenleyici tüp ilk enjeksiyon sırasında fare güvenliğini sağlamak için yararlı kanıtlıyor. Cerrahi işlemler ve deneysel protokolleri boyunca, anestezi gibi gerekli takviyeleri (% 10-20, ilk enjeksiyon ip) (parmak veya kuyruk tutam çekilme yanıt belirtilen her 30-60 dakika) tarafından korunur. İpucu: Sulandırma pentobarbital 10 mg / ml steril serum fizyolojik enjeksiyonu, doz aşımı olasılığını azaltır. </li><li> Anestezi fare ilk enjeksiyondan hemen sonra sıcak tutulmalıdır böylece ısı düzenleme uzlaşır. (Havalandırılan alüminyum sepet) ısıtma plakasının üstüne metal bir taşıyıcı fare yerleştirilmesi (~ 37 kalibre ° C) iyi çalışır. Alternatif olarak, bir ısı lambası özen fare uygun bir mesafe konumlandırmak için kullanılabilir. Uygun anestezi düzeyi (parmak veya kuyruk tutam çekilmesi eksikliği) elde edilene kadar fare her 5-10 dakika takip edilmelidir. 15-20 dakika sonra ek doz gerekebilir. Sabırlı olun ve özellikle obez veya yaşlı hayvanların aşırı dozda önlemek için dikkatli devam etmek en iyisidir. </li><li> Saç dikkatle ilgili bölgelerde tıraş alt karın, bel, skrotum ve bacakları kaldırılır. Aksi Cremaster&#39;ın kas zarar skrotum ve testisler, travmayı önlemek için özellikle dikkat alınmalıdır. Taze bir alkollü bez ile gevşek saç çıkarın. </li><li> Mesane dolu ise karın duvarı üzerinden küçük bir üzüm gibi hissedeceksiniz. Cremaster&#39;ın hazırlık deneyler sırasında idrar fare önlemek için hafif basınç mesane boşaltın. Kimwipe toplama bir etkisi süngert idrar. </li><li> Bacaklarını kaide straddling kama yatarken, sırtında fare yerleştirin. Her ayağın bağlı bir ipek sütür (4-0 veya 5-0), kaide karşı kasık fare güvenliğini sağlamak için bir ip sağlar. Göğsünde gevşek yerleştirilir ve kama için güvenli bir parça bant genel vücut konumunu sürdürmektedir. Mikrodiseksiyon makas ve açılı forseps kullanarak stereomikroskopta üzerinden izlerken Cerrahi işlemler yapılmaktadır. </li></ol> 3. Açık Cremaster&#39;ın kas Cerrahi hazırlık <ol><li> Pin skrotal kese apeks (ya sağ ya da sol tarafı) ile cilde gerginlik yere kaide yerleştirilir ve sabitlenir. PSS (34-35 ° C) ile Superfusion cerrahi alanın üzerine başlatılan ve maruz kalan doku sıcak ve nemli tutmak için diseksiyon boyunca korunur. Skrotal kese ve diğer sonraki bir vakum hattına yanında bir ucundan bir fitil yerleştirilmiş (Kimwipe yapılan), atık su PSS kaldırır. Pleksiglas kurulu yapıştırılır ve kama tamamen çevreleyen ve kaide aspire olmayan herhangi bir PSS toplamak için &quot;hendek&quot; olarak hizmet vermektedir mikroskop üzerine PSS kaçağını önlemek için etkili bir önlem olarak hizmet silikon bir boncuk. </li><li> Skrotal kese ventral yüzeyi boyunca bir kesi yapılır. Testis karın boşluğuna Cremaster&#39;ın kas retrakte olması durumunda, alt karın kese içine hafif bir basınç testisin yönlendirir. Testis üzerinde Cremaster&#39;ın kas yüzeyi, şu anda tespit edilmelidir. Bağ dokusu, skrotal cilt ve Cremaster&#39;ın kas arasındaki Cremaster&#39;ın doku çevresindeki kas serbest dikkatle kaldırılır. </li><li> Skrotal cilt hafifçe kaide proksimal kenarı arkasında retrakte ve her iki tarafında bir iğne ile güvence altına alınmıştır. Cremaster&#39;ın kas yüzeyi dış yüzeyi daha sonra bağ dokusu temizlenir. Diseksiyonu nemlendirir bağ dokusu sırasında sürekli superfusion, görünürlük ve kaldırma kolaylaştırılması. </li><li> Cremaster&#39;ın kas apeks ile pin boyuna gerilim altında yerleştirmek için kullanılır. Vasküler arz kesintileri en aza indirmek için alınan büyük bir özen ile kas ventral uzunlamasına bir kesi ile yapılır. Bu doku hasarı 14 hazırlık çevresine yakın kan akışını dinamikleri değişmiş. Bu nedenle, en aza indirmek için bu görüntüleme ve fizyolojik çalışmalar için kullanılan veri toplama, hazırlama merkezine yakın kan damarlarını etkiler. </li><li> Cremaster&#39;ın kas epididim testisin altında ince bir bağ ile bağlıdır. Bir tarafa testis yansıtan epididim dikkatli bir şekilde ayrılmış olan bu bağ, ortaya çıkarır. Cremaster&#39;ın kas apeks civarında küçük arter ve ven epididim bağlamak. Forseps arasında bu gemiler kapatılmasıy ve bunları birbirinden çekerek kanama en aza indirir. Testis, epididim, testis arter ve ven, (4-0 veya 5-0 ipek sütür) proksimale bağlandı ilgili kasık yağ yastığı ile birlikte kopmuş ve (orşiektomi) atılır. Alternatif olarak, testis karın boşluğuna hafifçe geri itti ve bir parça pamuk veya Kimwipe ile muhafaza edilebilir. Orşiektomi testisler karın boşluğuna geri iterek, doku mümkün travması önlemek için hizmet vermektedir. Biz işlemi 7,15 birini kullanarak Cremaster&#39;ın mikrosirkülasyon hazırlık kalitesinde gözle görülür farklılıklar (bkz. Bölüm 3.8) bulamadı. </li><li> Cremaster&#39;ın kas dış yüzeyinde kalan bağ dokusu temizlenir ve daha sonra kaide yüzeyinde radyal yayıldı. Kenarları bozulmamış mikrosirkülasyon çizgili kas düz bir sayfa oluşturmak için 5-6 yerlerde pimleri (bkz. Bölüm 1.4) ile teminat altına alınmıştır. </li><li> Tamamlanan hazırlık aşamasında, intravital bir mikroskop, (3-5 ml / dk, 34 ° C) sürekli superfused ve 30 dakika için dengelenmiş. </li><li> Cremaster&#39;ın hazırlık Dürüstlük, çeşitli kriterlere göre değerlendirilecektir. Minimal cerrahi travma ile Spontan vazomotor sesi arteriol ve venüller yapışık lökosit eksikliği tempolu akışı ile gösterilir. En hassas, duyarlı bir hazırlık indeks 5-10 dakika superfusion çözüm oksijen içeriği yükselterek arteriyollerin daralma. Bu% 21 O 2 ile değişikti tarafından yapılır (vs% 5 O 2; bkz. Bölüm 1.5,% 5 CO 2, denge N 2). Arteriollerde lökosit varlığı, yokluğu, kılcal damarların akan kırmızı kan hücreleri ve / veya venüller biriken ve çevre dokulara lökosit, doku hasarı ve inflamasyon belirtileri. </li></ol> 4. Cremaster&#39;ın kas mikrosirkülasyon intravital görüntüleme <ol><li> Olympus MVX10 Stereo Zoom platformu dayalı özel bir mikroskop intravital görüntüleme yapılır. MVX10 mikroskop vücutMVX10 melez standı aydınlık (Köhler) görüntüleme için transillüminasyon (halojen lamba) ve floresan görüntüleme için epi-aydınlatma (cıva lambası) ile donatılmış bir monte edilir. Epi-aydınlatma kullanarak, GCaMP2 520/35 nm&#39;de emisyon toplanan ile 472/30 nm heyecanlı. Piper Kontrol Yazılımı (SPI) ile bir kişisel bilgisayar; XR/Mega-10 yoğun bir dijital fotoğraf makinesi (SPI Stanford Fotonik, Inc.) Kullanarak; Görüntüler MV PLAPO 2XC lens (Olympus sayısal diyafram = 0.50) ile elde edilir. Bu sistem sayesinde, view (FOV) gözlenen alan 553 mm X 442 mm, 22 mm X 18 mm çeşitli olabilir. </li><li> Intravital görüntüleme deneylerin tamamlanmasından sonra, anestezi fare servikal dislokasyon pentobarbital doz aşımı ile ötenazi. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 fare Cremaster&#39;ın hazırlık intravital görüntüleme için Fare kurulu. A) alüminyum platformu ile Vücut kama (sarı plastik izolasyonlu) alttan izlendi. Platformun alt güvenli Isıtma dirençleri yapılan ısı sağlar. B) ısıtma platformu, bir plastik takoz aittir. C) vücut kama cerrahi ve intravital mikroskop sahne sonraki transfer için bir Pleksiglas tahta üzerine yerleştirilir. Sylgard kaide kırmızı ok ile gösterilir. Su geçirmez silikon boncuk mikroskop damlamasını engelleyen intravital prosedürü sırasında sızıntı olabilir herhangi bir çözüm içeren tüm hazırlık çevreler. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: widefield görüntüleme Özel MacroZoom mikroskop . A) MVX10 mikroskop XR/Mega-10 ICCD kamera ile vücut (Olympus) (Stanford Fotonik) trinoküler port üzerine monte edilmiş. B) mikroskop vücut Close-up. (A) Zoom kontrolü (0.63 6.3x), (b) filtre tekerleği, (c) görüntü doubler&#39;i (25X optik büyütme ile NA = 0.50). C) Askat aydınlık (Köhler) aydınlatma (Kondenser NA = 0.55, Çalışma Mesafesi = 27 mm) için kondansatör. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 fare Cremaster&#39;ın hazırlık tamamlandı. Sıcak plastik kaplamalı alüminyum platform (sarı) yatar pozisyonda anestezi altında fare. Vücut pozisyonu bant ile sabitlenir. Cremaster&#39;ın kas şeffaf silastik lastik kaide üzerinde radyal yayıldı ve kenarlarında tutturulmuş. Superfusion çözüm plastik damlatıcı (beyaz ok) ile proksimal sonunda tanıtıldı. Bir vakum hattı (beyaz ok ucu) Kimwipe fitil yoluyla çözüm kaldırır. İki mikropipetler doku ve ipuçları ile yer gösterilir. Cremaster&#39;ın kasının alt kenarında bir referans elektrot (gümüş tel) güvence altına alınmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 endotelde GCaMP2 arterioler ağları ifade görselleştirmek için büyütme aralığı anlama. A)) Floresan ve B aydınlık görüntü, video monitör toplam = 42x büyütme için 3.2x optik büyütme alınır. [Görüş alanı (FOV) = 4375 x 3470 mm. Ölçeği bar = 500 mm. Bu büyütme Çalışmak istenilen noktada mikropipetler yerleştirme kolaylaştırır. Toplam büyütme 6.4X optik büyütme alınan C) Floresan ve D) aydınlık görüntü = 83x (FOV = 2.200 x 1.759 mm). Ölçeği bar = 200 mm. E) Floresan ve F) aydınlık görüntü toplam büyütme 12.6X optik büyütme = 165X (FOV = 1.100 x 885 mm). Ölçeği bar = 100 mikron. G) görüntü katlayıcı, optik büyütme = 25.2X. Ölçek çubuğu = 50 mm.

<ol>
	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+(Rat+Cremaster).">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats.">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li><li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle.">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li><li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

Missouri Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvanları da içeren tüm prosedürleri ve protokolleri için National Institutes Sağlık Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyum içinde gerçekleştirildi. Bu video-makale Üretim Stanford Fotonik tarafından sponsor oldu.

Burada, in vivo olarak mikrosirkülasyon gözlemlemek için fare açık Cremaster&#39;ın kas hazırlık açıklar . Bu prosedür, ilk olarak rat 4 açıklanan &quot;açık&quot; Cremaster&#39;ın hazırlık sonra modellenmiştir. Uygulama ile tüm cerrahi işlem en az 1 saat içinde tamamlanabiliyor. Bu preparatın çeşitli deneysel manipülasyon için çok yönlülük sağlar ve benzer bir biçimde incelenmesi gereken çeşitli deneysel modellerin kolayca sağlayan, hamsterlar olarak sıçanlara uyarlanmıştır. Hazırlık erkek hayvanların sınırlı ve ölçümleri, 14 kas kenarlarına yakın hasarlı bölgeler kaçınarak, dokusunun merkeze doğru yapılmalıdır . Ayrıca, basınç ve debi dağılımları Cremaster&#39;ın kas damarları birbirine 16 kesilir değişmiş iken, mikrodamarlar duyarlı ve tekrarlanabilir veri toplama için uygun kalır, kabul edilmelidir . Cremaster&#39;ın kas mikrosirkülasyon görselleştirmek için birincil kısıtı özellikle sıçanlarda hem de hamster, olgun hayvanlar ve boyutu artış gibi bağ dokusu oluşumunu. Ayrıca, hayvanların yağ olsun, pentobarbital lipofilik ve adipoz dokuda absorbe edilebilir, çünkü anestezi kontrol etmek daha da zorlaşıyor. Ilerlemek için en iyi yolu olduğunu, hayvanın ° vücut sıcaklığını 37 ~ muhafaza sağlarken hasta tarafından ° C maruz kalan doku PSS ile sürekli sulanmaktadır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Adı reaktif ya da cihaz </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Balıkçı </td><td> S642-212 </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum Klorür </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum Sülfat </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür </td><td> Sigma </td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Balıkçı </td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td> Nembutal Sodyum Çözümü </td><td> Lundbeck </td><td> NDC 67386-501-55 </td><td> Ayrıca pentobarbital olarak sodyum anılacaktır </td></tr><tr><td> Sıcaklık Kontrolör </td><td> Warner Aletleri </td><td> TC-344B </td><td> Alternatif: ayarlanabilir 12V DC güç kaynağı </td></tr><tr><td> Series 20 platformu ısıtıcı kiti RH-2 </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0274 </td><td> Özel yapılmış alüminyum levha gerektirir. </td></tr><tr><td> Mega-10 Kamera </td><td> Stanford Fotonik </td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2XC objektif </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10 hibrid stand </td><td> Leeds </td><td> LBX-Hybrid </td><td></td></tr><tr><td> Piper Kontrol Yazılımı </td><td> Stanford Fotonik </td><td></td><td> Mega-10 kamera Programı </td></tr><tr><td> Stereo Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Su geçirmez Silikon (Sil) </td><td> General Electric </td><td> 47.970-72.643-LW5000 </td><td> Diğer açık silikon sızdırmazlık ürünleri aynı zamanda iş </td></tr><tr><td> 60 x 15mm Petri Dish </td><td> Balıkçı </td><td> 08-757-13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrodisseksiyon Makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> # 5 / 45 </td><td></td></tr><tr><td> GP Millipore Express PLUS Membran </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Minutiens Böcek Pins </td><td> Austerlitz </td><td> M boyut 0,15 mm </td><td></td></tr><tr><td> Kompakt Pet Giyotin </td><td> Wahl Clipper Corp. </td><td> Model 9966 </td><td> Her kullanımdan sonra temizleyin </td></tr></tbody></table>

the mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation

Homeostazının korunması, vücutta metabolik yan ürünleri ile kaldırılması ile oksijen ve besin eşlik eden sabit bir kaynağı gerektirir. Bu denge kan, tüm doku ve organları boyunca vasküler kaynağı en küçük dalları kapsayan mikrosirkülasyon aracılığıyla hareketi ile elde edilir. Arterlerden arteriol şube parankimal hücreleri ile yakından ilişkili çok sayıda kılcal damarların akan oksijenli kan dağılımı ve büyüklüğü kontrol ağları oluşturur. Kılcal damarların doku hücreleri ve kan akımı arasındaki difüzyonal değişimi için büyük bir yüzey alanı sağlar. Venüllerde kılcal atık toplamak ve kalbe doğru deoxygenated kan dönüş olarak yakınsama. Görselleştirilmesi ve yaşam mikrosirkülasyon manipüle için gerçek zamanlı olarak bu süreçleri gözlemek için deneysel bir yaklaşım gerektirir. Sıçan Cremaster&#39;ın kas ilk histoloji ve elektron mikroskobu post mortem 1,2 kullanılarak inflamasyon çalışmaları için bir model olarak kullanılmıştır. Maruz sağlam sıçan Cremaster&#39;ın kas in vivo raporda ilk ışığı 3 yansıyan vazoaktif ilaçlar mikrovasküler tepkiler araştırdık. Ancak bu hazırlık odaklı aydınlatma eksikliği kas ve eğrilik yararlılığı sınırlı. Büyük bir atılım, kas açılış testis ayrılmakta ve bileşik mikroskop altında 4 transillüminasyon için düz bir levha olarak radyal yayılmasını gerektirmişti. Sıçanlarda 5 ve hamster 6 mikrosirkülasyon fizyolojisi incelemek için değerli bir hazırlık olduğu gösterilmiş olsa da, farelerde 7 Cremaster&#39;ın kas mikrovasküler fonksiyon 8-11 ve hücrelerarası gerçek zamanlı görüntüleme düzenleyen hücresel yollar diseksiyon özellikle yararlı olduğunu kanıtlamıştır 12 sinyalizasyon. Testisler inguinal kanal 13 üzerinden iner gibi Cremaster&#39;ın kas iç oblik ve transvers abdominus kas türetilmiştir. Ve testislerin sıcaklığını korumak: destek (Cremaster&#39;ın = askı Yunanca) hizmet vermektedir. Burada açıklandığı gibi, Cremaster&#39;ın kas üstün optik çözünürlük için ince düz bir levha olarak hazırlanmıştır. Fare istikrarlı bir vücut ısısı ve anestezi düzlemde devam cerrahi hazırlık, çevredeki doku ve testislerin fizyolojik tuz çözeltisi ile sürekli sulama ise kas kurtararak, silastik kauçuk şeffaf kaide üzerine yayılan ve böcek iğneli kenarları güvence . İşbu Protokol arterioler endotel hücreleri GCaMP2 transgenik farelerin ifade kullanır. GCaMP2 genetik olarak kodlanmış bir floresan kalsiyum göstergesi molekülü 12 . Widefield görüntüleme ve yoğun bir şarj çiftli aygıt kamera arterioler endotel kalsiyum sinyal in vivo çalışmada sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation at JoVE.com

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Bir doku hazırlanması, görselleştirme ve yaşam mikrosirkülasyon deneysel manipülasyon için tarif edilir. Anestezi erkek farelerde, ince, yüksek vaskülarize Cremaster&#39;ın kas arteriol, kapiller ve venüllerde mikrovasküler ağları da dahil olmak üzere çalışma intravital mikroskopi için hazırlanmıştır. Bu preparat, sıçan ve hamster için kolayca adapte.

Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremaster&#39;ın kas Hazırlık

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

the-mouse-cremaster-muscle-preparation-for-intravital-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

32.2K Görüntüleme.  University of Missouri. Bir doku hazırlanması, görselleştirme ve yaşam mikrosirkülasyon deneysel manipülasyon için tarif edilir. Anestezi erkek farelerde, ince, yüksek vaskülarize Cremaster'ın kas arteriol, kapiller ve venüllerde mikrovasküler ağları da dahil olmak üzere çalışma intravital mikroskopi için hazırlanmıştır. Bu preparat, sıçan ve hamster için kolayca adapte.

Video: The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Biyoloji

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Mikrosirkülasyon intravital Floresans Görüntüleme Microiontophoresis ve Mikromanipülasyon

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Sıçan Cremaster&#39;ın Muscle arteriyollerde Hücre-serbest Katman Görselleştirme ve

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...