Forschung in der Autoren-Labor wird durch die National Institutes of Health gewährt R37-HL041026, R01-HL086483 und R01-HL056786 (SSS) und F32-HL097463 und T32-AR048523 (PB) von der United States Public Health Service unterstützt.

1. Maus Bord-, Muskel-Sockel, Körper Keil und Superfusion Lösung <ol><li> Maus Bord: Ein transparentes Plexiglas rechteckigen Brett (6 &quot;breit X 8&quot; lang X 3 / 16 &quot;dick) wird auf der Bühne des Mikroskops fit Das.&quot; Maus board &quot;ist, wo die narkotisierten Maus während der chirurgischen Vorbereitung gesichert ist M. cremaster. </li><li> Muscle Podest: Eine transparente Silastic Gummi Sockel ist aus Sylgard 184, die nach Angaben des Herstellers ° s Anweisungen vermischt wird vorbereitet. Eine bequeme Form ist ein 15-mm dick x 50-mm Durchmesser Durchmesser Einweg Petrischale. Die Sylgard Block in die gewünschte Form mit einer Rasierklinge (siehe Abbildung 1C.) Geschnitten. Eine dünne Schicht von klaren wasserdichten Silikon-Kleber wird verwendet, um die Sylgard Block mit der Maus Bord zu sichern. Hilfreiche Tipps: Nach dem Gießen des Sylgard in die Petrischale, Entgasung in einer Vakuumkammer für eine Stunde entfernt Luftblasen und verbessert die Übersichtlichkeit. Nach Entgasung, Aushärtezeit für Sylgard, indem das Gericht in einem Labor Ofen bei 50 ° C für mehrere Stunden verkürzt. </li><li> Körper Keil und Heizung-Plattform: Ein Keil (2 &quot;x 4&quot; x 15 °) unterhalb der Maus und gegen den Sockel positioniert kippt den Körper nach vorn, die Verlängerung des M. cremaster über den Sockel von seinem Ursprung erleichtert. Die Einbeziehung einer Aluminium-Plattform auf der Oberfläche bietet Wärmeleitung. Die Plattform wird von Widerständen verbunden mit einem DC-Netzteil (Abbildung 1A) erwärmt. Kalibrieren der Plattform Temperatur auf ~ 40 ° C hält Speiseröhrenkrebs Temperatur bei ~ 37 ° C. Ansonsten ist Strahlungswärme von einer Lampe verwendet. </li><li> Pins. Zur Sicherung des M. cremaster auf dem Sockel sind die Pins von 0,15 mm Insektennadeln, die in ein &quot;L&quot;-Form gebogen wurden vorbereitet. </li><li> Physiologische Kochsalzlösung (PSS). Die Vorbereitungen sind superfundiert (bewässert) kontinuierlich mit Bicarbonat-gepufferte PSS in Reinstwasser (18,2 MOhm) H 2 O. vorbereitet Stammlösungen sind bei 20X Endbearbeitung Konzentration hergestellt und sterilisiert durch einen 0,2 um-Filter. Stammlösungen gut bleiben für mehrere Wochen bei 4 ° C gelagert Herstellung von Salzen getrennt vom Bicarbonat und Vermischung mit Verdünnung am Tag des Experiments verhindert die Ausscheidung von Kalzium-Bicarbonat. Der Bestand Salzlösung setzt sich zusammen aus (in mmol / L): 2638 NaCl, 94 KCl, 40 MgS0 4, 23,4 CaCl 2. Der Bestand Bicarbonat ist 360 NaHCO 3. Am Tag des Experiments werden die jeweiligen Lösungen auf ein Endvolumen (typischerweise 2 L für einen bestimmten Versuch) in einem Meßkolben gebracht und in einem Wasserbad bei ~ 37 ° C. Äquilibrierende die PSS mit 5% CO 2 / 95% N 2 für ~ 15 Minuten mit einem Gas-Dispergierer stellt den pH auf ~ 7,4 und verhindert, dass Niederschlag. Die PSS wird kontinuierlich mit 5% CO 2 / 95% N 2 in Experimenten geleitet. Die letzte funktionierende Lösung Zusammensetzung (in mmol / L) ist: 132 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgS0 4, 2 CaCl 2, 18 NaHCO 3. </li></ol> 2. Anästhesie und Vorbereitung für die Chirurgie <ol><li> Nach der Zustimmung der Institutional Animal Care und Verwenden Committee, sind männliche Mäuse mindestens 12 Wochen alt werden. Die Maus ist mit Pentobarbital-Natrium (60 mg / kg) durch intraperitoneale (ip) Injektion. Ein Verbot Rohr als nützlich erweist für die Sicherung der Maus während der ersten Injektion. Während chirurgischer Eingriffe und experimentelle Protokolle, wird die Narkose durch Nachträge (10-20% der ersten Injektion, ip) bei Bedarf (; gekennzeichnet durch Rückzug als Reaktion auf Zehe oder Schwanz kneifen alle 30-60 Minuten) gehalten. Tipp: Verdünnen der Pentobarbital 10 mg / ml in steriler Kochsalzlösung vor der Injektion reduziert die Möglichkeit einer Überdosierung. </li><li> Anästhesie Kompromisse Temperaturregelung, so dass die Maus müssen warm gehalten werden sofort nach der ersten Injektion. Wenn Sie den Mauszeiger in eine Metall-Träger (belüfteten Aluminium-Korb) auf einer Heizplatte (kalibriert auf ~ 37 ° C) gut funktioniert. Alternativ kann auch eine Wärmelampe eingesetzt darauf achten, dass sie in einem angemessenen Abstand von der Maus zu positionieren. Die Maus sollte alle 5-10 Minuten überwacht werden, bis das richtige Maß an Betäubung erreicht wird (Mangel an Rücktritt bis zu den Zehen oder Schwanz kneifen). Eine ergänzende Dosis kann nach 15-20 Minuten erforderlich sein. Am besten ist es, geduldig zu sein und gehen Sie mit Vorsicht zu Überdosierung zu vermeiden, insbesondere bei übergewichtigen oder älteren Tieren. </li><li> Das Haar ist aus dem Unterbauch, unteren Rücken, Hodensack und Beine durch vorsichtiges Rasieren jeweiligen Regionen entfernt. Besonderes Augenmerk ist darauf zu Verletzungen der Hodensack und Hoden, die sonst verletzen wird der M. cremaster zu vermeiden. Entfernen Sie lose Haare mit einem frischen Alkoholtupfer. </li><li> Wenn die Blase voll ist wird es wie eine kleine Traube durch die Bauchdecke fühlen. Leeren Sie die Blase mit sanftem Druck auf die Maus vom Urinieren auf der cremaster Vorbereitung während der Experimente zu verhindern. Ein Kimwipe ist ein Effekt, Schwamm, um kollektivet des Urins. </li><li> Bewegen Sie die Maus auf dem Rücken liegend auf den Keil mit seinen Beinen rittlings dem Podest. Ein Seidenfaden (4-0 oder 5-0) gebunden an jedem Fuß eine Leine für die Sicherung der Maus mit ihrem Schritt gegen den Sockel. Ein Stück Klebeband lose über der Brust gelegt und mit dem Keil unterhält insgesamt Körperhaltung. Chirurgische Eingriffe werden durchgeführt, während Sie durch ein Stereomikroskop mit Mikrodissektion Schere und Pinzette abgewinkelt. </li></ol> 3. Chirurgische Vorbereitung der offenen M. cremaster <ol><li> Ein Stift wird durch die Spitze der Hodensack (entweder die linke oder rechte Seite) gelegt und in den Sockel, um Spannungen auf der Haut statt. Superfusion mit PSS (34-35 ° C) wird über das OP-Feld initiiert und gepflegt durch Dissektion zu halten freiliegende Gewebe warm und feucht. Ein Docht (aus Kimwipe) mit einem Ende neben dem Hodensack und der andere neben einem Vakuum positioniert entfernt das Abwasser PSS. Eine Perle der Silikon-Dichtstoff verklebt auf dem Plexiglas Bord und komplett umschließt den Keil und Sockel dient als &quot;Wassergraben&quot;, um alle PSS, die nicht abgesaugt wird zu sammeln, die als eine effektive Vorsorge zur PSS Leckage auf das Mikroskop zu verhindern. </li><li> Ein Schnitt entlang der ventralen Oberfläche der Hodensack gemacht. Wenn die Hoden durch den M. cremaster in die Bauchhöhle zurückgezogen worden, leitet sanften Druck auf den Unterleib der Hoden in den Sack. Die Oberfläche des M. cremaster über dem Hoden sollten zu diesem Zeitpunkt erkannt werden. Bindegewebe zwischen den Skrotalhaut und der M. cremaster wird sorgfältig entfernt, um den M. cremaster vom umgebenden Gewebe frei. </li><li> Die scrotal Haut wird sanft hinter dem proximalen Rand des Sockels eingefahren und gesichert auf jeder Seite mit einem Stift. Die Außenfläche des M. cremaster Oberfläche wird dann von Bindegewebe gelöscht. Kontinuierliche Superfusion beim Präparieren Hydrate des Bindegewebes, die Erleichterung Sichtbarkeit und Entfernung. </li><li> Ein Stift durch die Spitze des M. cremaster wird verwendet, um es unter Längsspannung Platz. Ein Längsschnitt durch die ventrale Oberfläche des Muskels mit großer Sorgfalt vorgegangen, um Störungen der Blutversorgung zu minimieren. Der Blutfluss Dynamik in der Nähe der Peripherie der Vorbereitung sind von dieser Gewebeschäden 14 verändert. Deshalb zur Minimierung dieser Auswirkungen auf die Datenerhebung, die Blutgefäße in der Nähe der Mitte der Vorbereitung sind für die Bildgebung und physiologische Studien verwendet. </li><li> Der M. cremaster ist von einer dünnen Bänder auf den Nebenhoden unter dem Hoden verbunden. Entsprechend der Hoden auf der einen Seite macht diese Band, die sorgfältig aus dem Nebenhoden getrennt ist. In der Nähe der Spitze des M. cremaster ist klein Arterie und Vene, die ihn an den Nebenhoden. Okkludierende diese Schiffe zwischen Zange und zieht sie auseinander minimiert Blutungen. Der Hoden, Nebenhoden, Hoden-Arterie und Vene sind proximal (4-0 oder 5-0 Seidenfaden) ligiert, durchtrennt und verworfen (Orchiektomie) zusammen mit den zugehörigen inguinal Fettpolster. Alternativ können die Hoden sanft zurückgeschoben werden in die Bauchhöhle und behielt mit einem Stück Baumwolle oder Kimwipe. Die Orchiektomie dient dazu, mögliche Verletzung des Gewebes zu vermeiden, wenn Drücken der Hoden wieder in die Bauchhöhle. Wir haben keine auffälligen Unterschiede in der Qualität der cremaster Mikrozirkulation Vorbereitung (siehe Abschnitt 3.8) mit Hilfe der beiden Verfahren 7,15 gefunden. </li><li> Die Außenfläche des M. cremaster ist der verbleibende Bindegewebe gelöscht und breitete sich dann radial auf der Oberfläche des Sockels. Die Kanten sind mit Stiften (siehe Abschnitt 1.4) in 5-6 Plätze gesichert, um eine flache Platte der quergestreiften Muskulatur mit intakter Mikrozirkulation zu schaffen. </li><li> Das fertige Präparat wird zur Bühne eines intravitalen Mikroskop übertragen, superfundiert kontinuierlich (3-5 ml / min, 34 ° C) und äquilibriert für 30 Minuten. </li><li> Die Integrität der cremaster Zubereitung ist nach verschiedenen Kriterien ausgewertet. Spontane Vasomotorentonus mit minimalen chirurgischen Traumas ist durch eine rege fließen in Arteriolen und der Mangel an adhärenten Leukozyten in Venolen angegeben. Die empfindlichste Index einer ansprechenden Vorbereitung ist Verengung der Arteriolen zur Steigerung der Superfusion Lösung Sauerstoffgehalt für 5-10 Minuten. Dies ist durch Äquilibrieren mit 21% O 2 durchgeführt (vs. 5% O 2, siehe Abschnitt 1.5, die alle mit 5% CO 2, Rest N 2). Die Anwesenheit von Leukozyten in Arteriolen, das Fehlen von roten Blutkörperchen fließt durch die Kapillaren sind und / oder Leukozyten, der sich in Venolen und des umgebenden Gewebes Anzeichen von Gewebeschäden und Entzündungen. </li></ol> 4. Intravital Bildgebung des M. cremaster Mikrozirkulation <ol><li> Intravital Bildgebung ist auf einem benutzerdefinierten Mikroskop auf einer Olympus MVX10 Stereo Zoom-Plattform durchgeführt. Die MVX10 Mikroskopkörperist es, eine MVX10 Hybrid Stand mit Durchleuchtung (Halogenlampe) für Hellfeld (Köhler) Bildgebung und mit epi-Beleuchtung (Quecksilber) für Fluoreszenz-Bildgebung ausgestattet montiert. Mit Epi-Illumination ist GCaMP2 bei 472/30 nm mit Emission bei 520/35 nm gesammelt aufgeregt. Mit einem XR/Mega-10 intensiviert Digitalkamera (Stanford Photonics, Inc.; SPI) über Piper Control Software (SPI) auf einem Personal Computer; Bilder werden durch eine MV PLAPO 2XC Objektiv (Olympus numerische Apertur = 0,50) erworben. Mit diesem System können die beobachteten Field of View (FOV) von 553 um X 442 pm bis 22 mm X 18 mm variiert werden. </li><li> Nach Abschluss der Intravitalmikroskopie Imaging Experimenten wird die narkotisierten Maus mit Überdosis Pentobarbital durch Genickbruch folgte eingeschläfert. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Maus Bord für intravitale Bildgebung der Maus cremaster Vorbereitung. A) Body Keil mit Aluminium-Plattform (isoliert mit gelben Kunststoff) von unten angesehen. Heizwiderstände befestigt, um die Unterseite der Plattform bieten Wärmeleitung. B) Die Heizung-Plattform beruht auf einer Kunststoff-Keil. C) Der Körper Keil befindet sich auf einem Plexiglas Bord für die Chirurgie und die anschließende Übertragung auf der Bühne des intravitalen Mikroskop gelegt. Sylgard Sockel ist mit rotem Pfeil gekennzeichnet. Eine Perle aus wasserdichtem Silikon umschließt die gesamte Vorbereitung auf jede Lösung, die während der Intravitalmikroskopie Verfahren Leck kann verhindern, dass es tropft auf das Mikroskop enthalten. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Benutzerdefinierte MakroZoom Mikroskop für Weitfeld Bildgebung. A) MVX10 Mikroskopkörper (Olympus) mit XR/Mega-10 ICCD Kamera (Stanford Photonics) auf trinokularen Anschluss montiert. B) Nahaufnahme des Mikroskops Körper. (A) Zoom-Steuerung (0,63 bis 6.3x), (b) Filterrad; (c) Bild Verdoppler (NA = 0,50 mit optischem 25fach-Vergrößerung). C)-Kondensor für Hellfeld (Köhler) Beleuchtung (Kondensor NA = 0,55, Arbeitsabstand = 27 mm). <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Completed Maus cremaster Vorbereitung. Narkotisierten Maus in Rückenlage auf warme Kunststoff-Aluminium-Plattform (gelb). Körperlage ist mit Klebeband befestigt. Der M. cremaster ist radial auf dem transparenten Silastic Gummi Podest zu verbreiten und merken sich an den Rändern. Superfusion Lösung ist am proximalen Ende durch eine Kunststoff-Tropfer (weißer Pfeil) eingeführt. Ein Vakuum-Linie (weiße Pfeilspitze) entfernt die Lösung über eine Kimwipe Docht. Zwei Mikropipetten gezeigt positioniert mit ihren Spitzen in das Gewebe. Eine Referenzelektrode (Silberdraht) ist am unteren Rand des M. cremaster gesichert. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Veranschaulichung der Vergrößerungsbereich für die Visualisierung von Netzwerken arteriolären Ausdruck GCaMP2 in Endothel. A) Leuchtstoff-und B) Hellfeld Bild bei einer optischen Vergrößerung von 3,2 x für eine totale Vergrößerung = 42X auf dem Videomonitor genommen. [Field of View (FOV) = 4.375 x 3.470 pm]. Maßstab = 500 um. Arbeiten bei dieser Vergrößerung erleichtert die Platzierung von Mikropipetten an gewünschten Stellen. C) Leuchtstoff-und D) Hellfeld Bild mit optischen Vergrößerung 6.4X für insgesamt Vergrößerung aufgenommen = 83X (FOV = 2.200 x 1.759 um). Maßstab = 200 um. E) Leuchtstoff-und F) Hellfeld Bild mit optischen Vergrößerung 12.6X für insgesamt Vergrößerung aufgenommen = 165X (FOV = 1.100 x 885 um). Maßstab = 100 um. G) Mit Bild Verdoppler, optische Vergrößerung = 25.2X. Balken = 50 um.

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	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. 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C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. 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Alle Verfahren und Protokolle mit Tieren wurden von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of Missouri genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Produktion dieses Video-Artikel wurde von Stanford Photonics gefördert.

Hier beschreiben wir die offene cremaster Muskel-Präparat in der Maus für die Beobachtung der Mikrozirkulation in vivo. Dieses Verfahren ist nach dem &quot;offenen&quot; Cremaster Zubereitung erstmals in der Ratte 4 beschrieben modelliert. Mit etwas Übung das gesamte OP-Verfahren kann in weniger als 1 Stunde abgeschlossen sein. Die Vielseitigkeit dieser Vorbereitung kann für eine Vielzahl von experimentellen Manipulationen und ist leicht zu Hamstern sowie Ratten angepasst, so dass eine Vielzahl von experimentellen Modellen in ähnlicher Weise untersucht werden. Die Zubereitung ist für männliche Tiere beschränkt und Messungen sollten zur Mitte des Gewebes vorgenommen werden, zu vermeiden geschädigten Regionen in der Nähe der Ränder des Muskels 14. Es sollte auch anerkannt, dass, während Druck und Durchfluss-Distributionen verändert werden bei der Verschaltung Gefäße des M. cremaster 16 sind geschnitten, Mikrogefäßen reagieren und eignet sich für reproduzierbare Datenerfassung bleiben. Der primäre Beschränkung auf die Visualisierung der Mikrozirkulation in der M. cremaster ist der Aufbau des Bindegewebes wie Tiere reifen und an Größe zunehmen, besonders bei Ratten, sondern auch bei Hamstern. Ferner ist, wie Tiere Fett zu bekommen, wird es immer schwieriger zu kontrollieren, weil Anästhesie Pentobarbital ist lipophil und kann im Fettgewebe absorbiert werden. Der beste Weg, um fortzufahren ist, indem sie Patienten gleichzeitig sicherzustellen, dass das Tier ° s Körpertemperatur bei ~ 37 ° C gehalten wird, während freiliegende Gewebe kontinuierlich mit PSS bewässert.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes oder Gerät </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fischer </td><td> S642-212 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesium-Sulfat </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Kalziumchlorid </td><td> Sigma </td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbikarbonat </td><td> Fischer </td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td> Nembutal Natrium-Lösung </td><td> Lundbeck </td><td> NDC 67386-501-55 </td><td> Auch als Natrium-Pentobarbital bezeichnet </td></tr><tr><td> Temperaturregler </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td> Alternate: einstellbar 12V DC Spannungsversorgung </td></tr><tr><td> Series 20-Plattform Heizung Kit RH-2 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0274 </td><td> Benötigt custom-built Aluminiumplatte </td></tr><tr><td> Mega-10 Kamera </td><td> Stanford Photonics </td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td> Olymp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2XC Linse </td><td> Olymp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10 Hybrid-Stand </td><td> Leeds </td><td> LBX-Hybrid </td><td></td></tr><tr><td> Piper Control Software </td><td> Stanford Photonics </td><td></td><td> Programm für Mega-10-Kamera </td></tr><tr><td> Stereo-Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Waterproof Silicondichtungsmasse (Clear) </td><td> General Electric </td><td> 47.970 bis 72.643-LW5000 </td><td> Andere klaren Silikon-Dichtstoffe auch Arbeit </td></tr><tr><td> 60 x 15mm Petrischale </td><td> Fischer </td><td> 08 bis 757-13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrodissektion Scissors </td><td> Feine Science Tools </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont Pinzetten </td><td> Feine Science Tools </td><td> # 5 / 45 </td><td></td></tr><tr><td> GP Millipore Express PLUS Membran </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Minutiens Insect Pins </td><td> Austerlitz </td><td> Größe M 0,15 mm </td><td></td></tr><tr><td> Compact Pet Trimmer </td><td> Wahl Clipper Corp </td><td> Modell 9966 </td><td> Reinigen Sie nach jedem Gebrauch </td></tr></tbody></table>

the mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation

Während des gesamten Körpers erfordert die Aufrechterhaltung der Homöostase der konstante Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen gleichzeitig mit der Entfernung der metabolischen Nebenprodukte. Dieses Gleichgewicht wird durch die Bewegung des Blutes durch die Mikrozirkulation, die die kleinsten Verzweigungen der Gefäßversorgung in allen Geweben und Organen umfasst erreicht. Arteriolen Zweig von Arterien Netzwerke zu bilden, dass die Verteilung und Größe der sauerstoffreiches Blut fließt in die Vielzahl von Kapillaren eng mit Parenchymzellen zugeordnete Steuerelement. Kapillaren bieten eine große Oberfläche für die diffusiven Austausch zwischen Gewebezellen und die Blutversorgung. Venolen sammeln Kapillare Abwasser und konvergieren, da sie sauerstoffarmes Blut zum Herzen zurück. Zur Beobachtung dieser Prozesse in Echtzeit erfordert einen experimentellen Ansatz zur Visualisierung und Manipulation der lebenden Mikrozirkulation. Der M. cremaster von Ratten wurde zunächst als Modell für die Untersuchung Entzündung mit Histologie und Elektronenmikroskopie post mortem 1,2 verwendet. Die erste in vivo Bericht der exponierten intakten Ratte M. cremaster untersuchten mikrovaskulären Reaktionen auf vasoaktive Medikamente mit reflektierte Licht 3. Allerdings Krümmung des Muskels und der Mangel an konzentrierte Ausleuchtung begrenzt die Nützlichkeit dieser Vorbereitung. Der große Durchbruch brachte Eröffnung des Muskels, der Trennung vom Hoden und verbreiten es radial als eine flache Platte für Durchlicht unter einem zusammengesetzten Mikroskop 4. Während gezeigt, dass eine wertvolle Vorbereitung auf die Physiologie der Mikrozirkulation bei Ratten 5 und Hamstern 6 Studie, hat der M. cremaster in Mäusen 7 Bewährte besonders nützlich in Sezieren zelluläre Signalwege bei der Regulierung der mikrovaskulären Funktion 8-11 und Echtzeit-Bildgebung der interzellulären beteiligt Signalisierung 12. Der M. cremaster ist von der internen schräg und quer abdominis Muskeln abgeleitet, wie die Hoden durch den Leistenkanal Canal 13 steigen. Es dient der Unterstützung (griechisch: cremaster = Hosenträger) und halten Temperatur der Hoden. Wie hier beschrieben, ist der M. cremaster als dünne flache Platte für herausragende optische Auflösung vorbereitet. Mit der Maus auf eine stabile Körpertemperatur und Ebene der Narkose gehalten, umfasst chirurgische Vorbereitung der Befreiung der Muskel umgebende Gewebe und die Hoden, verbreiten sie auf transparenten Sockel Silastic Gummi und die Sicherung der Ränder mit Insektennadeln während Bewässerung es kontinuierlich mit physiologischer Kochsalzlösung . Das vorliegende Protokoll nutzt transgenen Mäusen, die GCaMP2 in Arteriolen Endothelzellen. GCaMP2 ist eine genetisch kodierte fluoreszierende Kalzium-Indikator-Molekül 12. Weitfeld Bildgebung und eine verstärkte charge-coupled device Kamera in-vivo-Studie von Calcium-Signalgebung in den Arteriolen Endothel zu ermöglichen.

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The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Ein Gewebe Vorbereitung ist für die Visualisierung und experimentelle Manipulation des Lebendigen Mikrozirkulation beschrieben. In narkotisierten männlichen Mäusen ist die dünne, stark vaskularisierten M. cremaster für Intravitalmikroskopie zu mikrovaskulären Netzwerken, einschließlich Arteriolen, Kapillaren und Venolen Studie vorbereitet. Die Zubereitung ist leicht für Ratten und Hamstern angepasst.

Die Maus Cremaster Muscle Vorbereitung Intravital Imaging der Mikrozirkulation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

32.2K Aufrufe.  University of Missouri. Ein Gewebe Vorbereitung ist für die Visualisierung und experimentelle Manipulation des Lebendigen Mikrozirkulation beschrieben. In narkotisierten männlichen Mäusen ist die dünne, stark vaskularisierten M. cremaster für Intravitalmikroskopie zu mikrovaskulären Netzwerken, einschließlich Arteriolen, Kapillaren und Venolen Studie vorbereitet. Die Zubereitung ist leicht für Ratten und Hamstern angepasst.

Serie: The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Forschung

Biologie

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophoresis und Mikromanipulation für Intravital Fluoreszenz-Imaging der Mikrozirkulation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Ein schnelles automatisiertes Protokoll zur Muskelfaser Populationsanalyse in Rattenmuskelquerschnitte Mit Myosin Heavy Chain Immunhistochemie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...