KOとACは、米国心臓協会からの助成金やフェローシップでサポートされています。 SIBとRBは、NIHからの補助金によってサポートされています。

<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1435/SOHA_overview.pdf">半自動化されたハートビートの分析（SOHA）手順の概要を表示するにはここをクリック。</a> 半自動の光ビートの分析 1。プリプロセス - このステップでは、収縮期血圧および拡張期心径に関する情報を提供します。 ハートのエッジは最大拡張期と収縮期に識別し、マークされています。光学録音はさらに遅い速度と心臓の最大収縮と弛緩が発生したフレームの正確な同定を可能にする一度に1つのフレームに進めることができます。収縮期のエッジを識別する拡張期のエッジと一組の識別マークの一つのペアが作られています。マークは、心臓に沿って異なる水平位置で重複して行うこともできます。 このステップで得られた心臓の直径は、心臓の収縮性の推定値を提供する追加の測定を計算するために使用されています。この措置は、パーセント短縮率（％FS）であり、それは心の端が収縮しながらお互いに向かって移動する程度を表します。 ％FSを計算するために使用される数式は次のとおりです。 （（（拡張期直径 - 収縮期直径）/拡張期径）× 100） 注 - このセットで識別されたポイントは、直径と短縮率の測定にのみ使用され、動きの検出に使用されていません。 例 ：（。Cammarato、ら2008）ショウジョウバエ、ミオシン重鎖のトランスデューサのドメイン、それらがミオシンのATPase活性を抑制または増強するかどうかに応じて瞳孔が開いたり、制限されている心の中でその結果、モータの酵素活性を調節することが知られている地域での点変異で。これらの測定値の種類は、キューティクルと脂肪によって、心臓の管の全長に沿って心臓のエッジを識別するために、通常は不可能であるとして、そのままハエで作ることができない、（野生型を比較し、D45とMhc5&quot;M -モードでM -モード通常、心臓を取り巻く以下の図&quot;）。他の一般的に用いられる方法で無傷のハエに心臓を視覚化する際に行われた測定は通常、心臓の最も前方部分、円錐状のチャンバーの領域に制限されています。それは、固定組織でこの動的な測定値を得ることも不可能です。 2。動きの検出 - このステップはプログラムによって自動的に行われ、各映画での動きを分析するために二つの異なるアルゴリズムを使用しています。簡単に言えば、最初のアルゴリズムは、&quot;平均フレームの闇&quot;アルゴリズムは、フレームのアプローチによってフレームを使用しています。このアルゴリズムの平均ムービー全体のフレームのための暗闇の強度は、0と1の間の間隔に値を正規化し、プロット時間をかけて映画の中ですべてのフレームのための正規化平均。二つ目のアプローチ、&quot;ピクセル単位&quot;のアルゴリズムは、次のフレームへのすべての個々のピクセルの暗さの変化を分析する。プリセットしきい値以上の強度の変化を示す画素は、フレームごとに加算され、時間をかけて映画の中でフレームごとにプロットされます。 3。間隔をチェックする two動き検出アルゴリズムからの出力は、出力ウィンドウに&quot;ピクセル単位&quot;上記のウィンドウに表示される&quot;平均闇&quot;出力でこのモジュールに表示されます。検出間隔は、我々が直接アルゴリズムの出力ウィンドウの下に分析されるフレームから作られた、エッジトレースまたはMモードを表示する実際の映画の中での動きと一致することを確実にするために。 Mモードは、デジタルムービー内の各フレームから心臓を介して1つのピクセル幅のスライスをカットし、時間をかけて心臓のエッジの動きのスナップショットを提供するために、水平方向に整列させることにより行われます。ウィンドウ&quot;ピクセル単位&quot;で識別される拡張期区間は、直接上記のその間隔に寄与するフレームの数と水平の緑の線で示されます。収縮の間隔は、2つの連続するdiastoles間の間隔として識別されます。収縮期の始まりは、縦の赤い線で示されている青色の縦線と年末までに、M -モードで表示されます。このディスプレイではそれは、アルゴリズムの出力は、実際の心臓の動きと一致しているかどうかを確認することは比較的容易です。 動きの検出が自動的に実行されますが、出力は精度をチェックする必要があります。これにはいくつかの理由があり、1つは、心臓の動きに関連していない光のレベルでの基礎と、徐波の変動がないことがあります。これは通常、ハイパスフィルタを内蔵を使用することによって排除することができます。第二の理由は、アプローチ&quot;ピクセル単位&quot;の感度に関係しています。このアルゴリズムからの出力は通常、2つの動きのトレース、収縮運動用と緩和の動きの一つです。これら二つの動きの間の時間の長さは古いハエで、いくつかの変異体で<html>比較的長くなり、プログラムは2つの別々のビートとして2つの動きを解釈しようとします。これは、&quot;使用の闇&quot;ボックスをクリックして、平均フレームの闇のアルゴリズムのものとピクセルアルゴリズムにより、画素の出力を比較するプログラムを尋ねることによって修正することができます。 例（ビデオを参照してください）：古い5〜7週間で収縮の間隔は一般的に若いハエよりもはるかに長い飛ぶ。これらの長い間隔は、最初に短い拡張期で区切られた2つの別個の収縮として検出されます。これは、&quot;使用の闇&quot;のチェックボックスを選択して修正することができます。この場合、プログラムは、平均フレーム闇の出力を持つピクセルアルゴリズムによってピクセルで識別される拡張期の間隔を比較します。平均フレーム闇の出力が正の値を持つ場合、そのピクセルのアル​​ゴリズムによってピクセルで識別されるすべての拡張期の間隔は無視され、間隔が正しく指定されます。映画全体は、10秒のセグメントでスキャンされ、受け入れ（&quot;OKデータ&quot;をクリック）または（&quot;データを破棄する&quot;をクリックして）拒否することができます。 HiとLoパスフィルタ感度は、手動で闇のアルゴリズムを採用するときに収縮の間隔を定義する、より正確にできるように調整することができます。 4。出力の統計 - 特定の映画のための出力が受理されたら、プログラムは自動的にパラメータの数を計算するためにその情報を使用します。これらは、収縮の波、心臓の直径、および％FSの方向と速度を収縮期血圧および拡張期区間、心臓周期と心拍数が含まれています。さらに、プログラムは不均一な収縮と弛緩のサイクルを反映しarrhythmicityを定量化するための複数のメソッドが用意されています（フィンクら、2009参照）。統計的な出力は、個別にそれぞれの映画のために、Microsoft Excelなどのスプレッドシートプログラムで開くことができるカンマ区切り値（。csv）ファイルの形式でデータセット全体に対して提供されています。 表1 - <img src="/files/ftp_upload/1435/1435table1.jpg" alt="table1の" /> 半自動化された光学ハートの解析プログラムによって生成される出力の例。 5。アップデートヒストグラム- プログラムのこの部分はヒストグラムの形式でデータセットの中心の間隔でデータがすべて表示されます。心拍数が可変であるため、我々は、ヒストグラムの出力データを正規化する。しかし、間隔の分布は、当社の正規化のための平均間隔の値を使用して、平均の周りの対称ではありません。 例（ビデオを参照してください）：KCNQカリウムチャネルの変異であるハエは非常に不規則な収縮期血圧および拡張期の間隔を示す。一般的に収縮の間隔は、はるかに長いと年齢をマッチさせた野生型のハエよりも不規則である。これは、明らかに（Ocorrらも参照してください。2007）ヒストグラム形式でデータを表示することで見ることができます。 6。 M -モードこのモジュールは、ムービーフレームの中心に沿って任意の位置から作ることができるM -モードを生成します。 M -モードの長さを指定することもできます。 M -モードは心臓が映画の中で何をしているかを定性的に表すのに便利です。 例（ビデオを参照してください）：M -モードを生成するために使用される前心室を示す3日間の古いゼブラフィッシュの幼虫の心臓の動画。電子的に各ムービーフレームから切り出される画素の垂直方向のスライスは、赤線で示されます。 Mモード図 ：ショウジョウバエとゼブラフィッシュからM -モードの例。心臓の制限と時折伝導ブロックを伴う高速化酵素の反応速度論と分子モーターで、前処理段階の結果で説明したミオシンの突然変異の1つ。両方のパラメータが定性的にM -モードを使用して表示することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig1.jpg" alt="M -モードの例" /> 野生型と変異体のハエの両方の心の同じ部分で行われたM -モードは明らかに修正された（（抑うつ酵素の反応速度とミオシンを発現する）MHC 5変異体と拡張型心筋径とD45変異体の不整脈の収縮サイクルに制限された表現型を示すCammaratoら、2008年から）。 前室（デモ、フィンクet.al.、2009年に示したものと同じ心の映画）を示すゼブラフィッシュ幼生の心臓から作られたM -モード。 7。レッドドットのムービー - このモジュールは自動的に赤色に変化するとして識別されるすべてのピクセルを示す分析した映画の鈍化（1:4）、20秒バージョンを生成します。この機能は主に、説明の目的で使用されています。 ムービー1 -赤のプログラムのアルゴリズムによって暗さの強度の変化を持つものとして識別されるピクセルを示す&quot;赤いドットの映画&quot;。ムービーの速度を4倍に元から遅くなる。 w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.aviは&quot;&gt;動画1をダウンロードするには、ここをクリック。 8。追加のアプリケーション - 私たちはしばしば伝統的な方法論を用いて分析することが困難な小さな心で他のモデルのハイスピー​​ドムービーにこの分析システムを適用し始めている。私たちは正常にゼブラフィッシュ幼生の心とマウス胎児の心臓（フィンクら、2009）の両方にこの分析を適用している。 ムービー2 -データの出力とチェックの間隔でマウスの心臓のムービープラスの図。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1435/Mouse%20heart%20clip%201.avi">ムービー2をダウンロードするには、ここをクリック。</a> <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig2.jpg" alt="マウスの心臓の間隔を確認してください" />

<ol>
	<li>Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).</li><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -. S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging.">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li><li>Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+detection+and+quantification+of+heartbeat+parameters+in+Drosophila,+zebrafish+and+embryonic+mouse+hearts.">A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts.</a> Biotechniques. 46, 101-113 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ショウジョウバエモデルでは、胎生発育から学習や記憶に至るまで、科学的なさまざまな質問に対処するために使用されている強力な遺伝学的ツールであることが証明されている。最近この多目的なモデル生物は、心臓機能の遺伝学を調査するために使用されています。成体ショウジョウバエで心臓生理学を定量化するための試行回数は、腹部のクチクラを通してそのままハエで行った観測に頼ってきた。これらのアプローチのほとんどは、単一のパラメータ、心拍数を定量化するために腹部を透過した光強度の変化を目視や録音によって異なります。これは有用なパラメータですが、それはそれは心臓の機能について教えてくれるものに限られている。私たちの半自動化された光ビートの分析方法は、レコード内のすべてのハートビートのためにそうする心を破っての高速ムービーからの追加の重要なパラメータの数に関する正確な情報を導出するための堅牢なアプローチです。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MatLab software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Math Works, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required environment for the analysis software.</td>
</tr>
<tr>
<td>EM-CCD digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>9100 or 9300</td>
<td>Other high speed digital cameras will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>HC image data capture software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Other image capture software that produces movies in avi format will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Light Microscope with 10x objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

semi-automated optical heartbeat analysis of small hearts

我々から高速光記録を分析するための方法を開発した<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;、ゼブラフィッシュとマウス胎児の心臓（フィンク、ら、2009）。私たちの半自動光ビート解析（SOHAは）個々の収縮と弛緩のイベントに関連付けられている心臓の動きを検出することができる新たな動き検出アルゴリズムを使用しています。プログラムは、収縮期および拡張期の間隔、心拍数だけでなく、ハートビートarrhythmicityの定性的および定量的措置を含む生理学的に適切な読み出しのホストを提供します。プログラムはまた、短縮率と小数面積の変化が計算された拡張期と収縮期の両方の間に心臓の直径の測定値を計算します。出力はほとんどのスプレッドシートプログラムと互換性のあるデジタルファイルとして提供されています。測定は、出力の統計的検出力を増加させる、レコード内のすべてのハートビートのために作られています。我々は、ユーザー入力が必要な各ステップを示し、すべての3つの遺伝的に扱いやすい心モデルにおける心機能の分析に私たちの方法論の適用を示す。

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Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

我々は、より高速の光記録を分析するための半自動化された光ビートの分析法（SOHA）を開発しました<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;、ゼブラフィッシュとマウス胎児の心臓。我々は、ショウジョウバエとマウス胎児の心臓の心機能の分析に私たちの方法論の適用を示しています。

スモールハーツの半自動光ビート解析

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

semi-automated-optical-heartbeat-analysis-of-small-hearts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K ビュー.  The Sanford Burnham Institute for Medical Research. 我々は、より高速の光記録を分析するための半自動化された光ビートの分析法（SOHA）を開発しましたショウジョウバエ、ゼブラフィッシュとマウス胎児の心臓。我々は、ショウジョウバエとマウス胎児の心臓の心機能の分析に私たちの方法論の適用を示しています。

ビデオ: Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

顕微鏡の適切な手入れとクリーニング

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

生物学

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

光学顕微鏡の主要なコンポーネント

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

位相コントラストおよび微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

CRISPR / CASシステムの酵素のための基質の生成

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ：半自動化された葉の形状計測のためのImageJのプラグイン

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

ハイスループットのアプリケーションのための大人のゼブラフィッシュハーツの回復

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

免疫細胞化学とプロイド分析のための固定心からの心筋細胞の分離

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over the past two decades, we have developed a yeast membrane protein expression platform that has been used to study many important fungal membrane proteins. The expression host Saccharomyces cerevisiae AD&#916;&#916; is deleted in seven major endogenous ABC transporters and it contains the transcription factor Pdr1-3 with a gain-of-function mutation that enables the constitutive overexpression of heterologous membrane protein genes stably integrated as single copies at the genomic PDR5 locus. The creation of versatile plasmid vectors and the optimization of one-step cloning strategies enables the rapid and accurate cloning, mutagenesis, and expression of heterologous ABC transporters. Here, we describe the development and use of a novel protease-cleavable mGFPHis double tag (i.e., the monomeric yeast enhanced green fluorescent protein yEGFP3 fused to a six-histidine affinity purification tag) that was designed to avoid possible interference of the tag with the protein of interest and to increase the binding efficiency of the His tag to nickel-affinity resins. The fusion of mGFPHis to the membrane protein ORF (open reading frame) enables easy quantification of the protein by inspection of polyacrylamide gels and detection of degradation products retaining the mGFPHis tag. We demonstrate how this feature facilitates detergent screening for membrane protein solubilization. A protocol for the efficient, fast, and reliable isolation of the small-scale plasma membrane preparations of the C-terminally tagged Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overexpressed in S. cerevisiae AD&#916;&#916;, is presented. This small-scale plasma membrane isolation protocol generates high-quality plasma membranes within a single working day. The plasma membrane preparations can be used to determine the enzyme activities of Cdr1 and Cdr1 mutant variants.

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

This article presents a small-scale plasma membrane isolation protocol for the characterization of Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) protein Cdr1, overexpressed in Saccharomyces cerevisiae. A protease-cleavable C-terminal mGFPHis double tag with a 16-residue linker between Cdr1 and the tag was designed to facilitate the purification and detergent-screening of Cdr1.

カンジダ・アルビカンスCdr1-mGFPHisの分析のための小スケールプラズマ膜調製

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...