Colture Cellulari Le cellule possono essere coltivate utilizzando tecniche consolidate, ma deve essere placcato sulla # 1 coprioggetto di vetro spalmato con un adesivo cellulare (come polilisina, polyornithine o laminina) per impedire alle cellule di distacco o in movimento durante gli esperimenti di imaging. Soluzioni Esperimenti di imaging del calcio può essere eseguito utilizzando una varietà di soluzioni fisiologiche tra cui terreni di coltura delle cellule. E &#39;importante, tuttavia, per assicurarsi che le soluzioni sono liberi di rosso fenolo, che aumenta notevolmente lo sfondo fluorescente. Noi usiamo soluzione Tyrodes, che è fatto facilmente e mima liquido cerebrospinale, e lo integrano con il 0,1% di BSA. Noi utilizziamo depolarizzazione con 60-90 mM cloruro di potassio per attivare canali del calcio voltaggio gated e Thapsigargin 1μM (1 magazzino mM in DMSO) o 2μM ionomicina (1 magazzino mM in DMSO) per attivare memorizzare canali delle unità CRAC. Spesso è conveniente togliere il calcio dalla soluzione extracellulare per dimostrare che il calcio elevazioni sono dovuti a influsso di calcio. Quando si rimuove il calcio è necessario mantenere la concentrazione totale dei cationi bivalenti (Mg 2 + e Ca 2 +) costante. Quando si sostituisce potassio per il sodio è necessario per mantenere l&#39;equilibrio osmotico. Tyrodes soluzioni: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Basso di potassio 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Basso di potassio 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Alto di potassio 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Alto di potassio 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 129 </td><td> 129 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 129 </td><td> 129 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td></tr></tbody></table> Regolare il pH a 7,4 con NaOH Caricamento della Fura-2 colorante calcio Noi celle di carico con acetossi-metil-estere Fura-2 (Fura-2 AM), che diffonde attraverso la membrana cellulare ed è de-esterificato dalle esterasi cellulari per produrre Fura-2 acido libero. I parametri esatti per la Fura-2 carico variano molto tra i tipi di cellule. Si consiglia di provare varie condizioni di carico attraverso la preparazione di soluzioni diverse che contiene una concentrazione più di Fura-2 infuria 1-4 micron, incubando cellule nella soluzione di carico per una serie di tempi da 15 minuti a 2 ore e il carico di prova a temperatura ambiente e a 37 gradi. Un protocollo semplificato per i neuroni corticali è il seguente: <ol><li> In primo luogo, preparare il 1 mM Fura-2:00 magazzino con l&#39;aggiunta di 50μl di DMSO ad una fiala 50μg disponibile da Invitrogen. E &#39;importante utilizzare DMSO secco confezionato sotto azoto ed è necessario rimuovere il DMSO con un ago da puntura del setto per evitare l&#39;idratazione del DMSO. Dopo aver preparato la Fura-2 AM soluzione di conservarlo in un luogo buio e asciutto. Fura-2 AM in DMSO è stabile a temperatura ambiente per 24 ore ed è stabile a - 20 gradi in un contenitore asciutto per diversi mesi. </li><li> Aliquota di 2 ml di terreni di coltura in un tubo da 15 ml, calda a 37 gradi. e aggiungere 2μl di Fura-2:00 magazzino per generare un 1μM Fura-2:00 soluzione. Vortex la soluzione vigorosamente per 1 minuto. </li><li> Trasferire la soluzione di carico per un 35 piatto di coltura di tessuti mm e trasferire il vetrino con le cellule nel piatto. </li><li> Incubare i neuroni a 37 gradi per 30 minuti in un incubatore scuro. Il tempo di incubazione con precisione. </li><li> Preparare un piatto 35 millimetri contenente 2 ml di terreni di coltura tissutale senza Fura-2 AM. Rimuovere il vetrino dalla soluzione di carico e posto nel nuovo piatto. </li><li> Montare il coprioggetto sulla camera di imaging. Rimuovere il vetrino dal piatto 35 mm e rapido montaggio sulla camera avendo cura di evitare l&#39;essiccazione delle cellule. Noi usiamo una camera di imaging prodotto da Warner strumenti che permette ad un coprioggetto 10 millimetri che contiene le cellule da montare sul fondo e un coprioggetto secondo per essere montato sulla parte superiore formando un panino. I due coprioggetto sono assicurate con grasso vuoto alla camera e due tubi alle due estremità della camera consentono di perfusione di soluzioni attraverso la camera. La linea di ingresso è collegato ad una siringa e la linea di uscita è collegato ad un bene che viene svuotato da una linea di aspirazione collegato ad una trappola vuoto. </li></ol> Il microscopio Usiamo un invertito Nikon Eclipse TE2000-U microscopio dotato di una lampada ad arco allo xeno (Sutter Instruments), una fase automatica (Ludl), una ruota di eccitazione filtro (Ludl), e un raffreddamento carica paio dispositivo (CCD) della fotocamera (Hamamatsu Orka II). Il microscopio è controllato da un com Macintoshcomputer con software Open Lab (improvvisazione). Diversi altri pacchetti software sono disponibili per l&#39;imaging raziometrico. Per l&#39;imaging che usiamo 40, 60 o 100x Nikon Fluor obiettivi olio da immersione con un NA superiore a 1,2. Imaging Protocol <ol><li> Calibrare la fase microscopio. </li><li> Carico Tyrodes soluzione nella linea di ingresso avendo cura di evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Collegare la camera alle linee di perfusione e profumato soluzione Tyrodes attraverso la camera, ancora una volta, avendo cura di evitare la formazione di bolle nella camera </li><li> Mettere una goccia di olio sull&#39;obiettivo, posizionare la camera sul palco microscopio e mettere a fuoco le cellule a luce trasmessa. </li><li> Esaminare la fluorescenza delle cellule con illuminazione a 340 ed a 380 nm usando gli oculari. Cellule a riposo dovrebbe essere debole a 340 e luminoso a 380. In generale, le cellule non devono essere illuminati con luce UV per più di 10 o 15 secondi e l&#39;intensità della luce di eccitazione deve essere ridotto con un filtro a densità neutra per evitare fototossicità. </li><li> Esaminare le cellule con la fotocamera e impostare il guadagno e di esposizione della fotocamera per generare un&#39;immagine che è vicino alla saturazione (ma non saturi) quando è illuminato a 380 nm e ben al di sotto saturazione quando è illuminato a 340 nm. Mantenere l&#39;esposizione al di sotto 200ms, se possibile. Una volta impostato, non modificare il guadagno della telecamera o l&#39;esposizione a meno che non si ha intenzione di modificare anche lo sfondo, Rmin e Rmax (vedi sotto). </li><li> Raccogliere un&#39;immagine ad ogni lunghezza d&#39;onda e utilizzare la regione di interesse (ROI), strumento per misurare l&#39;intensità dello sfondo in una varietà di posizioni nelle immagini per ogni lunghezza d&#39;onda. </li><li> Media i valori di fondo e inserire i valori di fondo nelle sedi appropriate nel programma di imaging. Il valore del fondo verrà sottratto da ogni pixel in campo. </li><li> Raccogliere un&#39;immagine rapporto pratica e regolare i valori di soglia per ogni lunghezza d&#39;onda per generare un&#39;immagine rapporto che include solo le cellule e non lo sfondo e che non è rumoroso nella regione vicino ai bordi delle celle. </li><li> Impostare il valore minimo di rapporto (Rmin) da circa il 10% sotto del più basso rapporto tra una cella nel campo. </li><li> Impostare il Rmax a circa 12 volte il Rmin. Non modificare la Rmin o Rmax tra gli esperimenti che si prevede di confrontare quanto renderà il confronto difficile. Noi raramente cambiano i valori e Rmin Rmax sul nostro rig imaging. </li><li> Utilizzare il palco automatizzati per trovare i campi che si prevede di immagine, e registrare la posizione di ogni campo usando il software. In genere raccogliere cinque campi di vista durante un esperimento. Le mosse fase automatizzato a un campo, raccoglie un rapporto immagine e passa al campo successivo. </li><li> Impostare il time-lapse intervallo di raccogliere immagini tra 0,1 e 10 secondi di distanza a seconda del tipo di segnali che si aspetta di vedere. </li><li> Avviare l&#39;esperimento. </li><li> Durante il test di sistema di imaging del calcio è spesso utile usare stimoli come tyrodes potassio alto (65 mM KCl) o ionomicina (2μM) che causerà un aumento intracellulare di calcio e calcio soluzione gratuita extracellulare che (contenente i buffer di calcio come EGTA e Bapta ) che riduce la concentrazione di calcio. </li></ol> Analisi Una volta che l&#39;esperimento è completo si desidera convertire l&#39;insieme di immagini in rapporto time-lapse misure di calcio per le singole celle o zone di interesse all&#39;interno delle cellule. Per fare questo: <ol><li> Utilizzare la regione di strumento di interesse (ROI) per definire le aree dell&#39;immagine in cui si vuole misurare calcio. In genere è utile avere almeno un ROI che copre il corpo cellulare della cellula. Nella definizione del ROI, è utile per riprodurre il filmato delle immagini per verificare che le cellule non si muovono durante il corso dell&#39;esperimento. </li><li> Utilizzare il software per raccogliere time-lapse misure di rapporto per ogni ROI in ogni immagine. </li><li> Importare le misure rapporto in un programma di analisi. Avrete bisogno di vedere le tracce di calcio per cellule specifiche o ROI, mediamente più celle o ROI e convertire le misure rapporto di valori intracellulari di calcio. Noi utilizziamo un insieme di macro scritte in Igor Pro che ci permettono di fare tutte queste attività di analisi comune, ma altri programmi come Excel, anche se meno conveniente può anche essere usato. </li><li> L&#39;equazione [Ca] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd può essere utilizzato per convertire il Fura-2 valori del rapporto per le concentrazioni di calcio intracellulare. [Ca] è la concentrazione di calcio, R è la Fura-2 340/380 rapporto, Rmin e Rmax sono i rapporti di 340/380, in assenza di calcio o in presenza di una concentrazione saturante di calcio, rispettivamente, e Sf * Kd è il prodotto della Kd di Fura-2 (circa 120 nm a RT) e un valore di scala. Per misurare R Min, Max e R Sf * Kd che è necessario eseguire sia un in vivo o in vitro di calibrazione. Nella calibrazione in vivo richiede uncombinazione di patch di bloccaggio e di imaging di calcio, che può essere complicato, ma è anche molto preciso. Nella calibrazione in vitro può essere fatto utilizzando una fatta in casa camera di calibrazione che consiste di due lamelle separate da un distanziatore coprioggetto sottile per generare un sottile strato di soluzione in cui eseguire la calibrazione. Il modo più comodo per misurare Fura-2 valori del rapporto in funzione delle concentrazioni di calcio è quello di utilizzare un kit di calibrazione che contengono molteplici soluzioni di calcio tamponato e Fura-2 acido libero. Questi possono essere ottenuti da Invitrogen (Molecular Probes) e contengono precise istruzioni per l&#39;uso. </li></ol>

<ol>
	<li>Grynkiewicz, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Lewis, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2++and+transmembrane+Ca2++current+in+human+leukemic+T+cells.">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li><li>Dolmetsch, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+intracellular+Ca2++stores+and+depletion-activated+Ca2++channels+generates+[Ca2+]i+oscillations+in+T+lymphocytes.">Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).</li></ol>

In questa presentazione abbiamo superato tutti i passaggi per eseguire l&#39;imaging di calcio con Fura-2 AM. Abbiamo utilizzato i neuroni corticali come modello, ma di imaging calcio può essere utilizzato per misurare intracellulari di calcio in tempo reale in una varietà di cellule. Nel fare questa procedura è importante utilizzare coprioggetto di vetro al posto della plastica, dal momento che la plastica è spesso fluorescente a lunghezze d&#39;onda ultraviolette, il che rende difficile l&#39;imaging. Inoltre, è importante pre-coat i coprioggetti con polyornithine e laminina al fine di impedire alle cellule di distacco. Infine, è importante ricordarsi di evitare la creazione di bolle d&#39;aria quando perfusione soluzioni attraverso la camera di imaging.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Fura-2 AM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F1221</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>DMSO</td>
<td>EM Science</td>
<td>MX1457-6</td>
<td>Keep in dry place to prevent hydration</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Albumin from bovine serum</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8022-100G</td>
<td>Store at 4&#176;</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Imaging Chamber</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>Model RC-20H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Potassium chloride</td>
<td>SIGMA</td>
<td>P9333-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Calibration Kit</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>F6774</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am

Immagini di calcio è una tecnica comune che è utile per misurare i segnali di calcio in cellule in coltura. Tecniche di imaging del calcio usufruire di coloranti indicatore di calcio, che sono molecole organiche a base di Bapta che cambiano le loro proprietà spettrali in risposta al legame di ioni Ca2 +. Coloranti indicatore di calcio si dividono in due categorie, rapporto-metrica coloranti come il Fura-2 e Indo-1 e singola lunghezza d&#39;onda coloranti come Fluo-4. Rapporto-metrica coloranti cambiare sia la loro eccitazione o il loro spettri di emissione, in risposta al calcio, permettendo la concentrazione di calcio intracellulare da determinare in base al rapporto di emissione di fluorescenza o eccitazione a lunghezze d&#39;onda diverse. Il principale vantaggio di utilizzare il rapporto-metrico coloranti oltre sonde singola lunghezza d&#39;onda è che il segnale rapporto è indipendente dalla concentrazione di colorante, l&#39;intensità di illuminazione, e la lunghezza del percorso ottico che permette la concentrazione di calcio intracellulare da determinare in modo indipendente di questi manufatti. Uno degli indicatori di calcio più comune è Fura-2, che ha un picco di emissione a 505 nm e cambia il suo picco di eccitazione da 340 nm a 380 nm in risposta al calcio vincolanti. Qui si descrive l&#39;uso di Fura-2 per misurare altezze calcio intracellulare nei neuroni e altre cellule eccitabili.

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Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Segnali di calcio giocano un ruolo chiave in molti processi cellulari tra cui l&#39;espressione genica, la sopravvivenza e la differenziazione. Qui mostriamo come eseguire l&#39;imaging di calcio con Fura-2 AM. Immagini di calcio è uno strumento prezioso per studiare la regolazione del calcio intracellulare in tempo reale e la sua regolamentazione delle cascate di segnalazione.

Imaging di calcio di neuroni corticali usando Fura-02:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

calcium-imaging-of-cortical-neurons-using-fura-2-am

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

60.7K Views.  Stanford University. Segnali di calcio giocano un ruolo chiave in molti processi cellulari tra cui l'espressione genica, la sopravvivenza e la differenziazione. Qui mostriamo come eseguire l'imaging di calcio con Fura-2 AM. Immagini di calcio è uno strumento prezioso per studiare la regolazione del calcio intracellulare in tempo reale e la sua regolamentazione delle cascate di segnalazione.

Video: Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Preparazione E18 neuroni corticali di ratto per compartimentazione in un dispositivo a microfluidi

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Ricerca

Biologia

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Preparazione delle cellule acinose pancreatiche per lo Scopo di Imaging di calcio, cellulari lesioni Misure e Infezione Adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Concurrent EEG and Functional MRI Recording and Integration Analysis for Dynamic Cortical Activity Imaging

Electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI) are two of the fundamental noninvasive methods for identifying brain activity. Multimodal methods have sought to combine the high temporal resolution of EEG with the spatial precision of fMRI, but the complexity of this approach is currently in need of improvement. The protocol presented here describes the recently developed spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, which seeks to rectify source biases and improve EEG-fMRI source localization through the dynamic recruitment of fMRI sub-regions. The process begins with the collection of multimodal data from concurrent EEG and fMRI scans, the generation of 3D cortical models, and independent EEG and fMRI processing. The processed fMRI activation maps are then split into multiple priors, according to their location and surrounding area. These are taken as priors in a two-level hierarchical Bayesian algorithm for EEG source localization. For each window of interest (defined by the operator), specific segments of the fMRI activation map will be identified as active to optimize a parameter known as model evidence. These will be used as soft constraints on the identified cortical activity, increasing the specificity of the multimodal imaging method by reducing cross-talk and avoiding erroneous activity in other conditionally active fMRI regions. The method generates cortical maps of activity and time-courses, which may be taken as final results, or used as a basis for further analyses (analyses of correlation, causation, etc.) While the method is somewhat limited by its modalities (it will not find EEG-invisible sources), it is broadly compatible with most major processing software, and is suitable for most neuroimaging studies.

An EEG-fMRI multimodal imaging method, known as the spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, is described here. The presented method employs conditionally-active fMRI sub-maps, or priors, to guide EEG source localization in a manner that improves spatial specificity and limits erroneous results.