תא תרבות ניתן לגדל תאים באמצעות טכניקות הוקמה אבל חייב להיות מצופה על # 1 coverslips זכוכית מצופה דבק סלולרית (כמו polylysine, polyornithine או laminin) כדי למנוע את התאים מפני ניתוק או העברת במהלך הניסויים הדמיה. פתרונות הדמיה ניסויים סידן יכול להתבצע באמצעות מגוון של פתרונות מדיה הפיזיולוגי כולל תרבית תאים. חשוב, עם זאת, על מנת לוודא כי הפתרונות הם חינם של פנול אדום, אשר מגדיל מאוד את הרקע ניאון. אנו משתמשים Tyrodes פתרון, אשר מורכב בקלות מחקה הנוזל השדרתי, ואנחנו משלימים את זה בסרום שור 0.1% אלבומין. אנו משתמשים עם שלילת קוטביות mM אשלגן כלוריד 60-90 להפעיל מתח ערוצי סידן מגודרת ו Thapsigargin 1μM (1 מניות מ&quot;מ DMSO) או 2μM Ionomycin (1 מניות מ&quot;מ DMSO) כדי להפעיל את החנות פעלה ערוצי CRAC. לעיתים קרובות נוח להסיר סידן מן הפתרון תאיים להראות כי הגבהים סידן הן בשל זרם סידן. בעת הסרת הסידן הכרחי כדי לשמור על ריכוז כולל של קטיונים divalent (Mg 2 + ו - Ca 2 +) קבוע. כאשר מחליפים עבור אשלגן נתרן יש צורך לשמור על איזון אוסמוטי. Tyrodes פתרונות: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> אשלגן נמוכה 2mm Ca 2 + Tyrodes (מ&quot;מ) </td><td> נמוכה אשלגן 0 Ca 2 + Tyrodes (מ&quot;מ) </td><td> אשלגן גבוהה 2mm Ca 2 + Tyrodes (מ&quot;מ) </td><td> אשלגן גבוהה 0 Ca 2 + Tyrodes (מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 129 </td><td> 129 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 129 </td><td> 129 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td></tr></tbody></table> התאם ל-pH 7.4 עם NaOH טוען של צבע Fura-2 סידן אנו לטעון תאים עם acetoxy-methyl-אסתר Fura-2 (Fura, 02:00), אשר מפזרת על פני קרום התא הוא דה esterified ידי esterases הסלולר להניב Fura-2 חומצה חופשית. הפרמטרים המדויקים לטעינת Fura-2 משתנים במידה רבה על פני סוגי תאים. אנו ממליצים על בדיקות בתנאים שונים על ידי הכנת מספר פתרונות טעינה המכילים ריכוזים שונים של Fura-2 משתוללת 1-4 מיקרומטר, דוגרים תאים פתרון הטעינה עבור מגוון רחב של פעמים מ 15 דקות עד 2 שעות בדיקת טעינה בטמפרטורת החדר ב 37 מעלות. פרוטוקול פשוטה עבור נוירונים בקליפת המוח היא כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להכין את mM 1 Fura-2:00 המניות על ידי הוספת 50μl של DMSO על בקבוקון 50μg זמינים Invitrogen. חשוב להשתמש DMSO יבש ארוז תחת חנקן יש צורך להסיר את DMSO עם מחט על ידי ניקוב מחצה למנוע הידרציה של DMSO. לאחר הכנת הפתרון Fura, 02:00 לשמור אותו במקום חשוך ויבש. Fura 02:00 ב-DMSO הוא יציב RT במשך 24 שעות והוא יציב ב - 20 מעלות במיכל יבש במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 Aliquot MLS של התקשורת בתרבות לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל חרוטי, חם 37 מעלות. ולהוסיף 2μl של Fura, 02:00 המניה כדי ליצור 1μM Fura, 02:00 פתרון. הפתרון וורטקס במרץ למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון טעינת אל צלחת 35 מ&quot;מ רקמת התרבות ולהעביר את coverslip עם תאים לתוך המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הנוירונים ב 37 מעלות למשך 30 דקות חממה כהה. זמן הדגירה בדיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת 35 מ&quot;מ המכיל 2 MLS של התקשורת בתרבות רקמה ללא Fura, 02:00. הסר את coverslip מפתרון העמסה מקום בצלחת החדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslip על החדר הדמיה. הסר את coverslip מצלחת 35 מ&quot;מ במהירות לעלות על החדר ולוודא כדי למנוע התייבשות של התאים. אנו משתמשים תא הדמיה שיוצרו על ידי וורנר מכשירים המאפשר coverslip 10mm המכיל את התאים להיות מותקן על הקרקעית coverslip השנייה להיות מותקן על החלק העליון ויוצרים כריך. שני coverslips מובטחות עם גריז ואקום לחדר ושני צינורות בכל צד של החדר לאפשר זלוף של פתרונות דרך החדר. שורת הקלט מחובר מזרק ואת קו פלט מחובר היטב כי הוא רוקן על ידי קו יניקה מחובר מלכודת ואקום. </li></ol> המיקרוסקופ אנו משתמשים הפוכה Nikon Eclipse TE2000-U מיקרוסקופ המצויד קשת קסנון מנורה (סאטר מכשירים), שלב אוטומטית (Ludl), גלגל עירור לסנן (Ludl), וכן מכשיר מקורר תשלום הזוג (CCD) המצלמה (Hamamatsu Orka II). המיקרוסקופ נשלטת על ידי com מקינטושputer מפעיל תוכנה מעבדת פתוח (אימפרוביזציה). מספר חבילות תוכנה אחרים זמינים הדמיה ratiometric. עבור הדמיה נשתמש 40, 60 או 100x Nikon טבילה פלואוריד שמן עם מטרות NA העולה על 1.2. הדמיה פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען Tyrodes פתרון לתוך שורת הקלט לטפל כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את תא לקווי זלוף ו Tyrodes פתרון perfuse דרך חדר שוב, מקפיד למנוע היווצרות של בועות בתא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפת שמן על המטרה, במקום חדר על הבמה מיקרוסקופ ולהתמקד התאים באמצעות האור המועבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הקרינה של תאים באמצעות הארה על 340 ועל 380 ננומטר באמצעות מהעיניות. תאים מנוחה צריך להיות עמום ב 340 ובהיר ב 380. באופן כללי, התאים לא צריך להיות מואר באור UV במשך יותר מ -10 או 15 שניות את עוצמת האור עירור יש לצמצם את צפיפות ניטרלי מסנן כדי למנוע phototoxicity. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחנו את התאים באמצעות המצלמה ולהגדיר את רווח החשיפה של המצלמה כדי לייצר דימוי קרוב רוויה (אך לא רווי) כאשר מואר ב 380 ננומטר הרבה מתחת הרוויה כאשר מואר ב 340 ננומטר. שמור את החשיפה מתחת 200ms אם זה אפשרי. לאחר ההגדרה, אינם משנים את לזכות במצלמה או חשיפה אלא אם כן אתה מתכוון גם לשנות את הרקע, RMin ו RMax (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תמונה באורך גל אחד ולהשתמש באזור של כלי עניין (ROI) כדי למדוד את העוצמה של הרקע במגוון רחב של מקומות את התמונות עבור כל אורך גל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע הערכים רקע הזן את הערכים לתוך הרקע במיקומים המתאימים בתוכנית הדמיה. ערך הרקע יהיה מופחת כל פיקסל בתחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תמונה יחס בפועל ולהתאים את ערכי הסף עבור אורך גל אחד כדי ליצור תמונה היחס הכולל רק את התאים ולא את הרקע וזה לא רועש באזור לסגור את הקצוות של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ערך יחס מינימלי (RMin) יהיה כ -10% מתחת להון הנמוכה ביותר של תא כלשהו בתחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את RMax להיות כ 12 פעמים RMin. אל תשנה את RMin או RMax בין ניסויים שבכוונתך להשוות כמו זה יגרום ההשוואה קשה. לעתים רחוקות אנחנו השינוי RMin וערכים Rmax על אסדת ההדמיה שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שלב אוטומטית כדי למצוא את שדות שבכוונתך תמונה, ולהקליט את המיקום של כל שדה באמצעות התוכנה. בדרך כלל אנחנו אוספים חמישה שדות של נוף במהלך ניסוי. עובר שלב אוטומטית לשדה, אוספת תמונה יחס ועובר על לשדה הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מרווח זמן לשגות לאסוף תמונות בין 0.1 ו - 10 שניות זה מזה בהתאם לסוג של האותות שאתה מצפה לראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר בודקים את מערכת הדמיה סידן לעיתים קרובות כדאי להשתמש גירויים כמו tyrodes אשלגן גבוהה (65 mM KCl) או ionomycin (2μM) אשר יגרום לעלייה סידן תוך תאי פתרון חופשי סידן תאיים אשר (המכיל את מאגרי הסידן כמו EGTA ו BAPTA ) כי תפחית את ריכוז הסידן. </li></ol> אנליזה לאחר השלמת הניסוי אתה רוצה להמיר את ערכה של תמונות יחס לתוך זמן לשגות מדידות סידן עבור תאים בודדים או אזורים של עניין בתוך התאים. כדי לעשות זאת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזור של כלי עניין (ROI) כדי להגדיר את האזורים של התמונה שבה אתה רוצה למדוד סידן. זה בדרך כלל מועיל אחד לפחות ROI המכסה את גוף התא של התא. כאשר הגדרת ROIs, כדאי להפעיל את הסרט של התמונות כדי לוודא שהתאים לא זז במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה כדי לאסוף את זמן לשגות מדידות יחס ההחזר על ההשקעה עבור כל אחת מהתמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבוא ​​מדידות יחס לתוכנית ניתוח. יהיה עליך להציג את עקבות סידן עבור תאים ספציפיים או ROIs, מספר תאים הממוצע או ROIs להמיר את המדידות היחס אל תאיים ערכי הסידן. אנו משתמשים סדרה של פקודות מאקרו כתוב איגור Pro אשר מאפשרים לנו לעשות את כל המשימות הללו ניתוח שכיח אך תוכניות אחרות כמו Excel, אם כי פחות נוח יכול לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשוואה [Ca] = (RR דקות) / (R max-R) SF * Kd ניתן להשתמש כדי להמיר את Fura-2 ערכים יחס אל תאיים ריכוזי הסידן. [Ca] הוא ריכוז הסידן, R הוא Fura-2 340/380 יחס, RMin ו RMax הם 340/380 יחס בהיעדר סידן או בנוכחות ריכוז להרוות של סידן בהתאמה, SF * Kd הוא המוצר של Kd של Fura-2 (כ 120 nM ב RT) וערך דרוג. כדי למדוד R מינימום, R מקס SF Kd * יש צורך לבצע גם in vivo או כיול חוץ גופית. בשנת vivo דורש כיולשילוב של תיקון clamping הדמיה סידן, אשר יכול להיות מסובך, אבל הוא גם מאוד מדויק. ב כיול במבחנה ניתן לעשות זאת באמצעות תוצרת בית קאמרית כיול זה מורכב משני coverslips מופרדות spacer coverslip דק ליצור שכבה דקה של פתרון שבו לבצע את הכיול. הדרך הנוחה ביותר למדידת Fura-2 ערכים יחס כפונקציה של ריכוז סידן היא להשתמש בערכת כיול המכילים מספר רב של פתרונות סידן שנאגרו ו Fura-2 חומצה חופשית. אלו ניתן להשיג Invitrogen (בדיקות מולקולריות) ומכילים הנחיות מדויקות לשימוש. </li></ol>

<ol>
	<li>Grynkiewicz, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Lewis, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2++and+transmembrane+Ca2++current+in+human+leukemic+T+cells.">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li><li>Dolmetsch, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+intracellular+Ca2++stores+and+depletion-activated+Ca2++channels+generates+[Ca2+]i+oscillations+in+T+lymphocytes.">Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).</li></ol>

במצגת זו שעברנו את כל השלבים לביצוע הדמיה סידן באמצעות Fura, 02:00. השתמשנו נוירונים בקליפת המוח כמודל אבל הדמיה סידן ניתן להשתמש כדי למדוד סידן תוך תאי בזמן אמת במגוון רחב של תאים. כאשר עושים את זה הליך חשוב להשתמש coverslips זכוכית במקום פלסטיק, שכן הפלסטיק הוא לעתים קרובות פלורסנט באורכי גל אולטרה סגול, מה שהופך הדמיה קשה. כמו כן, חשוב מעיל טרום coverslips עם polyornithine ו laminin כדי למנוע מתאי ניתוק. לבסוף, חשוב לזכור, כדי למנוע יצירת בועות אוויר כאשר המרוססת פתרונות דרך חדר הדמיה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Fura-2 AM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F1221</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>DMSO</td>
<td>EM Science</td>
<td>MX1457-6</td>
<td>Keep in dry place to prevent hydration</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Albumin from bovine serum</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8022-100G</td>
<td>Store at 4&#176;</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Imaging Chamber</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>Model RC-20H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Potassium chloride</td>
<td>SIGMA</td>
<td>P9333-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Calibration Kit</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>F6774</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am

הדמיה סידן היא טכניקה נפוצה שימושי למדידת אותות סידן בתאים בתרבית. טכניקות ההדמיה סידן לנצל אינדיקטור צבעים סידן, שהם BAPTA מבוססי מולקולות אורגניות, כי לשנות את מאפייני הספקטרום שלהם בתגובה לקשירה של יוני Ca2 +. אינדיקטור צבעים סידן מתחלקים לשתי קטגוריות, יחס מטרי צבעים כמו Fura-2 ו ההודו-1 ו יחיד הגל צבעים כמו Fluo-4. יחס-מטרי לשנות צבעים או עירור שלהם או ספקטרום הפליטה שלהם בתגובה סידן, המאפשר ריכוז סידן תוך תאי שייקבע על פי היחס של פליטת הקרינה או עירור באורכי גל שונים. היתרון העיקרי של שימוש יחס מטרי צבעים על בדיקות אורך גל יחיד היא אות יחס אינו תלוי בריכוז צבע, עוצמת תאורה, אורך מסלול אופטי המאפשר ריכוז סידן תוך תאי שייקבע בנפרד ממצאים אלה. אחד המדדים הסידן הנפוץ ביותר הוא Fura-2, אשר יש שיא פליטה ב 505 ננומטר שינויים שיא עירור שלה ננומטר 340-380 ננומטר בתגובה סידן מחייב. כאן אנו מתארים את השימוש Fura-2 כדי למדוד את הגבהים של סידן תוך תאי נוירונים ותאי להתרגש אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM at JoVE.com

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

אותות סידן משחקת תפקיד חשוב בתהליכים תאיים רבים, כולל הישרדות ביטוי גנים בידול. כאן אנו מדגימים כיצד לבצע הדמיה סידן באמצעות Fura, 02:00. הדמיה סידן הוא כלי רב ערך כדי ללמוד את ויסות סידן תוך תאי בזמן אמת ורגולציה של מפלי איתות.

סידן הדמיה של נוירונים קליפתיים באמצעות Fura, 02:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

calcium-imaging-of-cortical-neurons-using-fura-2-am

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

60.7K Views.  Stanford University. אותות סידן משחקת תפקיד חשוב בתהליכים תאיים רבים, כולל הישרדות ביטוי גנים בידול. כאן אנו מדגימים כיצד לבצע הדמיה סידן באמצעות Fura, 02:00. הדמיה סידן הוא כלי רב ערך כדי ללמוד את ויסות סידן תוך תאי בזמן אמת ורגולציה של מפלי איתות.

Video: Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

הכנת E18 נוירונים עכברוש קליפתיים עבור מידור בתוך המכשיר microfluidic

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

בתחום ההדמיה vivo של שכבות קליפתיים עמוק באמצעות Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

הכנת תאי לבלב acinar לצורך סידן ההדמיה, פגיעה בתא המדידות, וזיהום adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em&gt; Gaussia</em&gt; לוציפראז SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Concurrent EEG and Functional MRI Recording and Integration Analysis for Dynamic Cortical Activity Imaging

Electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI) are two of the fundamental noninvasive methods for identifying brain activity. Multimodal methods have sought to combine the high temporal resolution of EEG with the spatial precision of fMRI, but the complexity of this approach is currently in need of improvement. The protocol presented here describes the recently developed spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, which seeks to rectify source biases and improve EEG-fMRI source localization through the dynamic recruitment of fMRI sub-regions. The process begins with the collection of multimodal data from concurrent EEG and fMRI scans, the generation of 3D cortical models, and independent EEG and fMRI processing. The processed fMRI activation maps are then split into multiple priors, according to their location and surrounding area. These are taken as priors in a two-level hierarchical Bayesian algorithm for EEG source localization. For each window of interest (defined by the operator), specific segments of the fMRI activation map will be identified as active to optimize a parameter known as model evidence. These will be used as soft constraints on the identified cortical activity, increasing the specificity of the multimodal imaging method by reducing cross-talk and avoiding erroneous activity in other conditionally active fMRI regions. The method generates cortical maps of activity and time-courses, which may be taken as final results, or used as a basis for further analyses (analyses of correlation, causation, etc.) While the method is somewhat limited by its modalities (it will not find EEG-invisible sources), it is broadly compatible with most major processing software, and is suitable for most neuroimaging studies.

An EEG-fMRI multimodal imaging method, known as the spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, is described here. The presented method employs conditionally-active fMRI sub-maps, or priors, to guide EEG source localization in a manner that improves spatial specificity and limits erroneous results.