細胞の文化細胞は、確立された技術を用いて成長させることができるが、画像の実験中に分離または移動から細胞を防止するために、細胞接着剤（ポリリジン、ポリオルニチンまたはラミニンのような）でコーティングされた第1ガラス製カバースリップ上に播種する必要があります。 ソリューションカルシウムイメージング実験は、細胞培養培地を含む生理学的な様々なソリューションを使用して実行できます。それは、ソリューションが大幅に蛍光バックグラウンドを増加させるフェノールレッド、のないことを確認するために、しかし、重要です。我々は簡単に作られ、脳脊髄液を模倣し、我々はアルブミン0.1％ウシ血清でそれを補完さTyrodesのソリューションを、使用してください。私たちは、店舗運営CRACチャネルをアクティブにするには電位依存性カルシウムチャネルと1μMタプシガルギン（DMSO中の1mMストック）または2μmのイオノマイシン（DMSO中の1mMストック）を有効にするには60〜90 mMの塩化カリウムを脱分極を使用してください。それはカルシウムの上昇がカルシウムの流入が原因であることを示すため、細胞外液からカルシウムを除去すると便利です。カルシウムを除去する際には、二価陽イオンの総濃度は、（Mg 2 +及びCa 2 +）の定数を維持するために必要です。ナトリウムに対してカリウムを置換する場合には、浸透圧の平衡を維持するために必要です。 Tyrodesソリューション： <table border="1"><tbody><tr><td></td><td>低カリウム2mMのCa 2 +のTyrodes（MM） </td><td>低カリウム0のCa 2 + Tyrodes（MM） </td><td>高カリウム2mMのCa 2 +のTyrodes（MM） </td><td>高カリウム0のCa 2 + Tyrodes（MM） </td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 129 </td><td> 129 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 129 </td><td> 129 </td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> MgCl2を</td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td></tr></tbody></table> NaOHで7.4にpHを調整するフラ-2カルシウム色素のロード我々は、細胞膜を横切って拡散し、フラ-2遊離酸を得るために、細胞エステラーゼにより脱エステル化されているアセトキシ-メチル-エステルフラ-2（フラ-2 AM）、細胞をロードする。フラ-2荷重の正確なパラメータは、細胞の種類によって大きく異なります。 15分から2時間まで時間の様々なローディング溶液中で4μM、インキュベート細胞を、室温で負荷をテストし、 - 私達は1から荒れ狂うフラ-2の複数の濃度を含むいくつかのローディング溶液を調製することにより、様々な条件をテストすることをお勧めします37℃で。皮質ニューロンの簡略化したプロトコルを以下に示します。 <ol><li>最初に、Invitrogen社から入手可能な50μgバイアルにDMSO50μlのを追加することによって、フラ-2は在庫午前1 mMのを準備。それは、窒素下でパックされた乾燥DMSOを使用することが重要であり、それはDMSOの水和を防ぐため、隔壁に穴を開けることによって針でDMSOを除去する必要がある。フラ-2 AM溶液を調製した後、暗い乾燥した場所に保管してください。フラ-2は、DMSOで午前24時間室温で安定であり、で安定している - 数ヶ月間乾燥した容器に20度。 </li><li> 37℃の暖かい15 mlコニカルチューブ、内培養液のアリコートを2 MLS。とフラ-2の2μlのを追加するには、フラ-2は、ソリューションの午前1μMを生成するために株式思います。 1分間激しくボルテックスするソリューション。 </li><li> 35mmの組織培養皿にローディング溶液を移し、皿に細胞をカバースリップを転送する。 </li><li>暗いインキュベーター内で30分間37℃で神経細胞をインキュベートする。正確に時間インキュベーションを。 </li><li>フラ-2午前なく、組織培養培地の2 MLSを含む、35 mmディッシュを準備します。新しい料理のロードソリューションと位置からカバーを取り外します。 </li><li>イメージングチャンバー上にカバースリップをマウントします。 35mmの皿からカバーを取り外して、急速に細胞の乾燥を防ぐために、確実にチャンバーに取り付けます。我々は、底とサンドイッチを形成する上にマウントされる2番目のカバースリップ上にマウントされる細胞を含む10ミリメートルカバースリップを許可するワーナーインスツルメンツ製イメージングチャンバーを使用してください。 twoカバースリップは、チャンバを介してソリューションの灌流を可能にするチャンバーの両端に真空チャンバーへのグリースと2つのチューブで固定されています。入力行は、注射器に接続され、出力ラインは、真空トラップに接続されている吸引ラインで空にウェルに接続されている。 </li></ol>顕微鏡我々は、キセノンアークランプ（サッタインスツルメンツ）、自動化された段階（Ludl）、励起フィルターホイール（Ludl）、および冷却電荷結合素子（CCD）カメラ（浜松Orkaを装備した倒立ニコンエクリプスTE2000 - U顕微鏡を使用してII）。顕微鏡は、MacintoshのCOMによって制御されます。オープンラボのソフトウェア（即興）を実行しているコンピューター。いくつかの他のソフトウェアパッケージは、レシオメトリックイメージング可能です。イメージングのために我々は1.2を超えるNAで40、60または100倍ニコンフルーアの油浸の目標を使用してください。 イメージングプロトコル<ol><li>顕微鏡ステージのキャリブレーションを行います。 </li><li>気泡の形成を防ぐために注意して入力ラインにTyrodesソリューションを読み込みます。 </li><li>チャンバー内の気泡の形成を防ぐために注意しながら、再びチャンバーを介して灌流ラインと浸み込ませるのTyrodesソリューションにチャンバーを接続する</li><li>客観的に油の滴を置き、顕微鏡のステージ上のチャンバーを配置し、透過光を用いて細胞に焦点を当てる。 </li><li> 340と接眼レンズを使用して380nmでの照明を用いて細胞の蛍光を調べる。休止細胞は380で340で薄暗いと明るいはずです。一般的に、細胞は10以上または15秒間UV光を照射してはならないと励起光の強度は、光毒性を防止するためのフィルタ中立密度を減らす必要があります。 </li><li>カメラを用いて細胞を調べますし、340nmで照射したときに380nmで、よく飽和の下に照射したときに（ただし飽和ではない）飽和状態に近い画像を生成するためにカメラのゲインと露出を設定します。可能であれば200msの下に露出してください。また、背景を変更する予定がない限り一度設定、カメラのゲインや露出を変更しない、RMINとrmaxは（下記参照）。 </li><li>各波長での画像を収集し、各波長の画像にさまざまな場所でバックグラウンドの強度を測定するために関心領域（ROIの）ツールを使用してください。 </li><li>平均バックグラウンド値を、イメージングプログラムの適切な場所にバックグラウンドの値を入力します。バックグラウンドの値は、フィールド内の各画素から減算されます。 </li><li>練習の比率の画像を収集し、細胞のみではなく、background、それがセルの端に近い領域でノイズはないが含まれている比率の画像を生成するために、各波長のしきい値を調整します。 </li><li>フィールド内の任意のセルの最小の比より10％程度と最小の比の値（RMIN）を設定します。 </li><li>約12倍RMINにRmaxを設定します。あなたはそれが比較が困難になるように比較することを計画している実験の間にRMINまたはRmaxを変更しないでください。我々はほとんど私たちのイメージングリグ上RMINとRmaxの値を変更しません。 </li><li>あなたがイメージする予定のフィールドを見つけるために、自動ステージを使用して、ソフトウェアを使用して各フィールドの位置を記録。我々は一般的に実験時のビューの5つのフィールドを収集する。フィールドへの自動ステージの移動は、比率の画像を収集し、次のフィールドに移ります。 </li><li>離れてあなたが見ることを期待している信号の種類に応じて0.1〜10秒間画像を収集するためにタイムラプス間隔を設定します。 </li><li>実験を開始します。 </li><li>カルシウムイメージングシステムをテストする際にはなります（EGTAとBAPTAのようなカルシウムのバッファを含む細胞内カルシウムの上昇とカルシウム遊離細胞外溶液の原因となる高カリウムtyrodesのような刺激（65 mMの塩化カリウム）またはイオノマイシン（約2μm）を使用すると便利です。 ）それは、カルシウム濃度が低下します。 </li></ol>分析一度の実験では、細胞内の個々のセルまたは関心の領域に対しては、時間経過のカルシウムの測定に比イメージのセットを変換したいと完了です。これを行うには： <ol><li>あなたがカルシウムを測定したい画像の領域を定義するために興味ツール（ROI）の領域を使用します。それは細胞の細胞体をカバーする少なくとも一つのROIを持つことが一般的に便利です。 ROIを定義するとき、それは細胞が実験の過程で移動していないことを確認するために画像のムービーを再生するのに便利です。 </li><li>各画像の各ROIのためタイムラプス比の測定値を収集するソフトウェアを使用してください。 </li><li>解析プログラムに比測定をインポートします。あなたは、特定の細胞やROIを、平均的な複数のセルまたはROIのためのカルシウムのトレースを表示し、カルシウム値を細胞内に比測定を変換する必要があります。あまり便利でも使用できるけれどもWeは、私たちはすべてのこれらの一般的な分析作業が、Excelなどの他のプログラムを実行できるようイゴールプロで記述されたマクロのセットを使用します。 </li><li>方程式は、[CA] =（RR 分 ）/（R MAX - R）SF * Kdはカルシウム濃度を細胞内にフラ-2比の値を変換するために使用することができます。 [カルシウム]カルシウム濃度は、Rは、フラ-2 380分の340の比であり、RMINと面粗さはそれぞれ、カルシウムの存在下でまたはカルシウムの飽和濃度の存在下で380分の340の比率であり、そしてSfは* Kdはですフラ-2のKd（室温で約120 nM）およびスケーリング値の積。 R 最小 、R マックスとSF * Kdを測定するためには、in vitroでのキャリブレーションのin vivoまたはいずれかで行う必要がある。 in vivoでのキャリブレーションに必要です。複雑なことができますが、パッチクランプやカルシウムイメージング、の組み合わせも非常に正確です。 in vitroでのキャリブレーションではキャリブレーションを実行するためのソリューションの薄層を生成するために薄いカバーガラスのスペーサーで区切られた二つのカバーガラスで構成される自家製のキャリブレーションチャンバーを使用して行うことができます。カルシウム濃度の関数としてフラ-2の比の値を測定するのが最も便利な方法は、複数のバッファカルシウムソリューションとフラ-2遊離酸が含まれている校正キットを使用することです。これらは、Invitrogen（Molecular Probes社）から入手し、使用のための的確な指示を含めることができます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Grynkiewicz, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Lewis, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2++and+transmembrane+Ca2++current+in+human+leukemic+T+cells.">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li><li>Dolmetsch, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+intracellular+Ca2++stores+and+depletion-activated+Ca2++channels+generates+[Ca2+]i+oscillations+in+T+lymphocytes.">Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).</li></ol>

このプレゼンテーションでは、AMフラ-2を使用してカルシウムのイメージングを行うためのすべてのステップを経てきました。我々はモデルとして皮質ニューロンを用い、カルシウムイメージングは​​、細胞の様々なリアルタイムで細胞内のカルシウムを測定するために使用することができます。この手順を行う際にはプラスチックが多くの場合、イメージングが困難に紫外波長、少なくとも蛍光灯なので、代わりにプラスチックのカバーガラスを使用することが重要です。また、それは切り離すことは、細胞を防止するために、ポリオルニチンとラミニンでプレコートカバースリップに重要です。最後に、画像処理チャンバーを通してソリューションを灌流するとき、気泡の発生を防ぐために、覚えておくことが重要です。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Fura-2 AM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F1221</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>DMSO</td>
<td>EM Science</td>
<td>MX1457-6</td>
<td>Keep in dry place to prevent hydration</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Albumin from bovine serum</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8022-100G</td>
<td>Store at 4&#176;</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Imaging Chamber</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>Model RC-20H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Potassium chloride</td>
<td>SIGMA</td>
<td>P9333-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Calibration Kit</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>F6774</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am

カルシウムイメージングでは、培養細胞でのカルシウム信号を測定するための有用な一般的な手法です。カルシウムイメージング技術は、Ca2 +イオンの結合に応答してそれらのスペクトル特性を変更するBAPTA系有機分子であるカルシウム指示薬染料、を活用する。カルシウム指示薬染料は、二つのカテゴリーにレシオメトリックフラ-2のような染料とインド- 1とみたFluo - 4のような単一波長の色素を落ちる。レシオメトリック色素は、細胞内カルシウムの濃度が異なる波長で蛍光発光または励起の比から決定できるように、カルシウムに反応して励起またはそれらの発光スペクトルのいずれかを変更する。単一波長のプローブを介してレシオメトリック染料を使用する主な利点は、比の信号が色素濃度、照度、および独立してこれらのアーティファクトの決定する細胞内カルシウムの濃度を可能にする光路長に依存しないということです。最も一般的なカルシウムの指標の一つは、結合カルシウムに反応して発光505 nmにピークと380nmへの変更は340 nmからの励起ピークを有するフラ-2、です。ここでは、ニューロンや他の興奮性細胞の細胞内カルシウムの上昇を測定するためのフラ-2の使用について説明します。

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Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

カルシウムの信号は、遺伝子発現、生存と分化を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。ここでは、フラ-2回答を使用して、カルシウムのイメージングを実行する方法を示します。カルシウムイメージングでは、リアルタイムとシグナル伝達カスケードの調節における細胞内カルシウムの調節を研究する貴重なツールです。

AMフラ-2を用いて皮質ニューロンのカルシウムイメージング

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

calcium-imaging-of-cortical-neurons-using-fura-2-am

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

60.7K ビュー.  Stanford University. カルシウムの信号は、遺伝子発現、生存と分化を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。ここでは、フラ-2回答を使用して、カルシウムのイメージングを実行する方法を示します。カルシウムイメージングでは、リアルタイムとシグナル伝達カスケードの調節における細胞内カルシウムの調節を研究する貴重なツールです。

ビデオ: Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのE18脳ラットのニューロンの準備

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

生物学

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

マイクロプリズムを使ってDeep皮質層のin vivoイメージング

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

ターゲット-エステラーゼ誘起染料の読み込み（TED）とERカルシウムの直接イメージング

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

カルシウムイメージング、細胞傷害測定、およびアデノウイルス感染の目的のための膵臓腺房細胞の調製

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視<em&gt;ガウ</em&gt;ルシフェラーゼSERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Concurrent EEG and Functional MRI Recording and Integration Analysis for Dynamic Cortical Activity Imaging

Electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI) are two of the fundamental noninvasive methods for identifying brain activity. Multimodal methods have sought to combine the high temporal resolution of EEG with the spatial precision of fMRI, but the complexity of this approach is currently in need of improvement. The protocol presented here describes the recently developed spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, which seeks to rectify source biases and improve EEG-fMRI source localization through the dynamic recruitment of fMRI sub-regions. The process begins with the collection of multimodal data from concurrent EEG and fMRI scans, the generation of 3D cortical models, and independent EEG and fMRI processing. The processed fMRI activation maps are then split into multiple priors, according to their location and surrounding area. These are taken as priors in a two-level hierarchical Bayesian algorithm for EEG source localization. For each window of interest (defined by the operator), specific segments of the fMRI activation map will be identified as active to optimize a parameter known as model evidence. These will be used as soft constraints on the identified cortical activity, increasing the specificity of the multimodal imaging method by reducing cross-talk and avoiding erroneous activity in other conditionally active fMRI regions. The method generates cortical maps of activity and time-courses, which may be taken as final results, or used as a basis for further analyses (analyses of correlation, causation, etc.) While the method is somewhat limited by its modalities (it will not find EEG-invisible sources), it is broadly compatible with most major processing software, and is suitable for most neuroimaging studies.

An EEG-fMRI multimodal imaging method, known as the spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, is described here. The presented method employs conditionally-active fMRI sub-maps, or priors, to guide EEG source localization in a manner that improves spatial specificity and limits erroneous results.