Coniugazione: un metodo per trasferire la resistenza all'ampicillina dal donatore al ricevente E. coli

Fonte: Alexander S. Gold¹, Tonya M. Colpitts^1
1 Dipartimento di Microbiologia, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA

Scoperta per la prima volta da Lederberg e Tatum nel 1946, la coniugazione è una forma di trasferimento genico orizzontale tra batteri che si basa sul contatto fisico diretto tra due cellule batteriche (1). A differenza di altre forme di trasferimento genico, come la trasformazione o la trasduzione, la coniugazione è un processo naturale in cui il DNA viene secreto da una cellula donatrice a una cellula ricevente in modo unidirezionale. Questa direzionalità e la capacità di questo processo di aumentare la diversità genetica dei batteri ha dato alla coniugazione la reputazione di una forma di "accoppiamento" batterico, che si ritiene abbia contribuito notevolmente al recente aumento dei batteri resistenti agli antibiotici (2, 3). Utilizzando pressioni selettive, ad esempio l'uso di antibiotici, la coniugazione è stata manipolata per l'uso in laboratorio, rendendola un potente strumento per il trasferimento genico orizzontale tra batteri e, in alcuni casi, da batteri a lieviti, cellule vegetali e animali (4). Oltre alle applicazioni in laboratorio, il trasferimento genico batterio-eucariota mediante coniugazione è un'entusiasmante via di trasferimento del DNA con una moltitudine di possibili applicazioni biotecniche e implicazioni naturali (5).

Si pensa che la coniugazione funzioni con un "meccanismo a due fasi" (6). In primo luogo, prima che qualsiasi DNA possa essere trasferito, la cellula donatrice deve entrare in contatto diretto cellula a cellula con il ricevente. Questo processo è stato caratterizzato meglio nei batteri gram-negativi, il più studiato dei quali è Escherichia coli. Il contatto cellula-cellula è stabilito dalla presenza di una complessa rete di filamenti extracellulari sul donatore nota come sex pilus, un elemento coniugativo codificato dal gene trasferibile noto come fattore F (fertilità) (7, 8). Oltre a stabilire un contatto tra donatore e ricevente, diverse proteine vengono trasportate attraverso il pilus sessuale al citoplasma ricevente, formando un condotto del sistema di secrezione di tipo IV (T4SS) tra le due cellule, una struttura necessaria per la seconda fase di coniugazione, il trasferimento del DNA (6). Combinando questa funzione del pilus sessuale con la replicazione del cerchio rotolante del DNA, la cellula donatrice è in grado di trasferire il DNA sotto forma di un elemento trasponibile, come un plasmide o un trasposone, al ricevente mediante un modello "shoot and pump" (6). In questo caso, lo "shooting" è il trasporto della proteina pilota, con DNA collegato, da parte del T4SS nella cellula ricevente, e il "pumping" è il trasporto attivo del DNA al ricevente, un processo dipendente dal T4SS e catalizzato dall'accoppiamento delle proteine (6). Il macchinario utilizzato in questo processo è composto da un'origine di sequenza di trasferimento (oriT), che deve essere fornita dal DNA nei geni cis e trans, che codificano una relaxasi, un complesso di formazione di coppie di accoppiamenti e una proteina di accoppiamento di tipo IV, e possono essere presenti in cis o trans (9). Questa relaxasi fende il sito nic all'interno della sequenza oriT e si attacca covalentemente all'estremità 5' del filamento trasferito per produrre il relaxosoma, un complesso DNA-relaxasi a singolo filamento con altre proteine ausiliarie (9). Una volta formato, il relaxosoma si collega al complesso di formazione della coppia di accoppiamento, tramite la proteina di accoppiamento di tipo IV, che consente il trasferimento del complesso ssDNA-relaxasi nelle cellule riceventi da parte del T4SS (10). Una volta nel citoplasma del ricevente, il DNA può integrarsi nel genoma del ricevente o esistere separatamente sotto forma di plasmide, entrambi i quali consentono l'espressione dei suoi geni.

In questo esperimento, il ceppo di donatore di coniugazione ampiamente utilizzato E. coli WM3064 è stato utilizzato per trasferire il gene che codifica per la resistenza all'ampicillina al ceppo ricevente E. coli J53. Mentre entrambi i ceppi dei batteri gram-negativi erano resistenti alla tetraciclina, solo il ceppo donatore WM3064 aveva il gene per la resistenza all'ampicillina, codificato per nel vettore navetta pWD2-oriT, ed era auxotrofico all'acido diaminopimetico (DAP) (11-13). Questo esperimento consisteva in due fasi principali, la preparazione di ceppi donatore e ricevente, seguita dal trasferimento del gene di resistenza all'ampicillina dal donatore al ricevente mediante coniugazione (Figura 1).

Figura 1: Schema di coniugazione. Questo schema mostra il successo del trasferimento di un plasmide, solo un esempio di elemento di DNA trasponibile, da una cellula donatrice a una cellula ricevente usando la coniugazione. Al contatto con la cellula ricevente da parte della cellula donatrice attraverso il pilus sessuale, il plasmide si replica mediante replicazione del cerchio rotolante, si muove attraverso il complesso multiproteico unendo le due cellule e forma un nuovo plasmide a lunghezza intera nella cellula ricevente.

Incubando una miscela di cellule donatrici e riceventi, quindi placcando successivamente queste cellule in presenza di tetraciclina e DAP, ciò ha permesso il trasferimento riuscito del gene di resistenza all'ampicillina. Successivamente, le cellule placcate cresciute da questa miscela in presenza di tetraciclina e ampicillina, hanno rimosso tutte le cellule donatrici a causa della mancanza di DAP e di eventuali cellule riceventi che potrebbero non aver acquisito il gene di resistenza all'ampicillina, producendo batteri del ceppo J53 strettamente riceventi che hanno acquisito resistenza all'ampicillina (Figura 2). Una volta effettuato, il successo del trasferimento del gene di resistenza all'ampicillina è stato confermato dalla PCR. Poiché la coniugazione ha avuto successo, il ceppo J53 di E. coli conteneva pWD2-oriT ed era resistente all'ampicillina, e il gene che codifica per questa resistenza è rilevabile dalla PCR. Tuttavia, in caso di insuccestamento non ci sarebbe stato alcun rilevamento del gene di resistenza all'ampicillina e l'ampicillina avrebbe comunque funzionato come un antibiotico efficace contro il ceppo J53.

Figura 2: Schema del protocollo. Questo schema mostra una panoramica del protocollo presentato.

Figura 3A: La conferma del successo della coniugazione mediante PCR. A) Le scorte congelatrici dei campioni di controllo coniugati e negativi sono state strisciate su piastre di agar e una colonia è stata selezionata (rossa) per l'isolamento del DNA.

1. Configurazione

1. Autoclave circa 1L di Luria-Bertani medium (LB). Questo LB sterile sarà utilizzato per produrre circa 5 ml di LB contenente 0,3 mM di acido diaminopimetico (DAP).
2. Raccogliere le seguenti piastre: piastre di agar LB con 1X Tet e 0,3 mM DAP, piastre lb agar con 1X Tet solo e piastre LB agar con solo 1X Amp/Tet.
3. Assicurarsi che un po 'di glicerolo e una scatola di punte di pipette di plastica pre-sterilizzate siano a portata di mano.
4. Prima di iniziare qualsiasi lavoro che coinvolga i microbi, sterilizzare lo spazio di lavoro con il 70% di etanolo. Indossare sempre i dispositivi di protezione individuale necessari, tra cui un camice da laboratorio e guanti.
5. Una volta terminato, sterilizzare tutte le superfici e i guanti con etanolo al 70% e lavarsi le mani.

2. Preparazione del ceppo del donatore e del ricevente

1. Preparare colture batteriche da 5 ml dei ceppi donatori e riceventi e coltivarle durante la notte a 37 °C con aerazione e agitazione a 220 giri/min. Il ceppo donatore deve essere coltivato in LB con 0,3 mM DAP.
2. Girare verso il basso 1 mL di entrambe le colture (~ 3000 rpm per 5 minuti) e lavare le celle con PBS.
3. Spese di sodio delle cellule in 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).

3. Coniugazione

1. Combinare 50 μL di cellule riceventi con 50 μL di cellule donatrici in un tubo di microcentrifuga e mescolare mediante pipettaggio.
2. Incubare la miscela cellulare per 1 ora a 37 °C. Ciò migliorerà l'efficienza della coniugazione prima e durante la fase successiva della placcatura.
3. Pipettare 100 μL della miscela cellulare su una piastra di agar con 1X Tet e 0,3 mM DAP. Non stendere sul piatto.
4. Pipettare 100 μL di coltura cellulare ricevente su una piastra di agar con 1X Tet e 0,3 mM DAP. Non stendere sul piatto.
5. Incubare entrambe le piastre durante la notte a 37 °C.
6. Raschiare la miscela cellulare di coniugazione e la coltura cellulare ricevente con un raschietto cellulare sterile. Trasferire le cellule in un tubo microcentrifuga sterile e risospentare le cellule in 1 mL di PBS.
7. Ruotare le celle e ruotarle delicatamente verso il basso (~ 3000 giri / min per 5 minuti).
8. Risuspendare le cellule in 1 mL di PBS.
9. Placcare la miscela di cellule di reazione di coniugazione su una piastra di agar LB con solo 1X Amp/Tet. Su questa piastra, solo i batteri riceventi che hanno ottenuto con successo il gene di resistenza Amp tramite coniugazione dovrebbero crescere.
10. Placcare le cellule riceventi su una piastra di agar LB con solo 1X Tet. Su questa piastra, solo i batteri riceventi non coniugati, che non hanno il gene di resistenza Amp, dovrebbero crescere.
11. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
12. Prelevare singole colonie da entrambe le piastre e utilizzarle per coltivare colture notturne in 5 ml di mezzi (37 °C con aerazione a 220 giri/min).

4. Isolamento del DNA

1. Isolare il DNA dalle colture precedentemente preparate utilizzando 4,5 ml del volume totale di coltura mediante DNA miniprep.
2. Per fare questo, eluire il DNA usando 35 μL di acqua priva di nucleasi.
3. Il DNA puro genererà un rapporto di assorbanza (A_260/280)di circa 1,8.
4. Utilizzare i restanti 0,5 ml di ciascuna coltura per preparare le scorte di glicerolo facendo una miscela 1: 1 di coltura batterica e glicerolo al 100%.
5. Conservare le scorte congelatrici a -80 °C.

5. Conferma della coniugazione del trasferimento plasmidiale mediante PCR

1. Preparare due master mix PCR, ciascuno con un diverso set di primer avanti e indietro, uno mirato a un segmento di 500 coppie di basi all'interno del gene di resistenza all'ampicillina e l'altro mirato a un segmento all'interno di un gene di pulizia.
   1. I primer genetici di housekeeping sono stati progettati per amplificare un segmento di DNA all'interno del gene batterico che codifica per la DNA girasi B (14).
   2. I seguenti volumi di reagenti sono stati utilizzati per preparare 90 μL di ciascuna miscela master:
      7,5 μL di primer avanti da 10 μM
      7,5 μL di primer inverso da 10 μM
      75 μL di 2X PCR Master Mix
2. Preparare le seguenti sei reazioni PCR utilizzando una miscela master da 15 μL, 10 ng di DNA modello e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 25 μL.
   Reazione coniugante DNA e ampicillina primer
   DNA di reazione coniugale e primer per la pulizia
   Primer di controllo negativo del DNA e dell'ampicillina
   DNA di controllo negativo e primer per le pulizie
   Senza primer dna e ampicillina
   Nessun DNA e primer per le pulizie
3. Trasferire queste reazioni a una macchina PCR con il blocco preriscaldato a 98 C e iniziare il termociclico nelle seguenti condizioni:
   98 °C per 30 secondi
   25-35 cicli di 98 °C per 5-10 secondi, 45-72 °C per 10-30 secondi e 72 °C per 15-30 secondi per kb
   72 °C per 5-10 minuti
   Tenere a 4 °C
4. Caricare tutte e sei le reazioni PCR su un gel di acarosio all'1% ed eseguire a ~ 150V per circa 20 minuti.
5. Visualizza il prodotto PC utilizzando un illuminatore UV.

Se la coniugazione ha avuto successo, un prodotto PCR a banda di 500 coppie di basi sarà osservato nel pozzo in cui è stata caricata la reazione PCR 1 (Ben #2 in Figura 3B), mentre non si osserveranno bande nel pozzo in cui è stata caricata la reazione PCR 3 (Ben #4 in Figura 3B). La presenza di questa banda conferma il successo del trasferimento del gene di resistenza all'ampicillina, conferendo così resistenza all'ampicillina al ceppo J53 di E. coli.

Figura 3B: La conferma del successo della coniugazione mediante PCR. B) L'analisi PCR è stata effettuata utilizzando DNA isolato dalla colonia selezionata. Il contenuto di ciascun pozzo è il seguente: 1) Scala del DNA, 2) DNA di coniugazione e primer di ampicillina, 3) DNA di coniugazione e primer di pulizia, 4) Primer di DNA e ampicillina di controllo negativo, 5) DNA di controllo negativo e primer di pulizia, 6) Nessun primer di DNA e ampicillina e 7) Nessun primer di controllo del DNA e negativo. La presenza di un prodotto PCR a banda base ~500 dalla reazione PCR 1 (ben 2) e la mancanza di questo prodotto dalla reazione PCR 3 (bene 4), conferma il successo della coniugazione.

La coniugazione è un processo naturale di trasferimento genico orizzontale che si basa sul contatto diretto cellula-cellula di una cellula donatrice e di una cellula ricevente. Questo processo è condiviso tra tutti i tipi di batteri ed è stato determinante nell'evoluzione batterica, in particolare la resistenza agli antibiotici. In laboratorio, la coniugazione può essere utilizzata come metodo efficace di trasferimento genico che è molto meno dirompente rispetto ad altre tecniche. Al di fuori del laboratorio, la capacità di trasferire il DNA dai batteri agli eucarioti attraverso la coniugazione offre una nuova entusiasmante strada di terapia genica e la comprensione delle implicazioni di questi trasferimenti genici naturali, ad esempio la relazione tra infezione batterica e cancro, è un'area di ricerca in rapida amerlica.

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