Test per alimenti geneticamente modificati

Fonte: Laboratori di Margaret Workman e Kimberly Frye - Depaul University

La modificazione genetica degli alimenti è stata una questione controversa a causa delle preoccupazioni dibattuto sulla salute e la sicurezza ambientale. Questo esperimento dimostra la comprensione tecnica di come il DNA alimentare viene identificato geneticamente, consentendo un processo decisionale istruito sulla sicurezza e sui potenziali pericoli dell'uso di organismi geneticamente modificati (OGM) nelle forniture alimentari.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) viene utilizzata per amplificare il DNA alimentare per testare la presenza di DNA geneticamente modificato nei prodotti alimentari. La presenza di specifiche bande di DNA viene rilevata utilizzando l'elettroforesi su gel per estrarre il DNA alimentare estratto attraverso un gel di agarose al 3%, una concentrazione abbastanza densa da separare le bande di DNA contenenti il DNA geneticamente modificato. Diversi controlli sono utilizzati nella procedura di elettroforesi per garantire che il DNA venga estratto con successo dagli alimenti di prova (primer vegetale) e per fornire esempi noti di DNA geneticamente modificato (DNA geneticamente modificato acquistato) e DNA non geneticamente modificato (controllo alimentare non OGM certificato acquistato).

La reazione a catena della polimerasi (PCR) identifica sequenze di DNA che sono state inserite nella pianta GM. A differenza delle proteine, il DNA è una molecola relativamente stabile, quindi i frammenti di DNA possono essere isolati da beni altamente trasformati e sono sufficientemente intatti per essere amplificati dalla PCR. Gli ingegneri genetici usano solo un piccolo numero di sequenze regolatorie (sequenze promotore e terminatore) per controllare l'espressione dei geni inseriti, e quindi queste sequenze sono comuni alla maggior parte delle colture GM. Le due sequenze identificate in questa procedura sono due delle sequenze regolatorie più comuni, il gene promotore 35S dal virus del mosaico del cavolfiore (CaMV) e il gene terminatore della nopalina sintasi (NOS) da Agrobacterium tumefaciens.

La PCR comporta cicli ripetitivi, ciascuno costituito da denaturazione del modello, ricottura del primer ed estensione del primer ricotto da Taq DNA polimerasi. Una volta estratto il DNA dal cibo, un termociclatore viene utilizzato per manipolare rapidamente la temperatura, causando le fasi dei cicli PCR.

La fase di denaturazione si verifica quando i campioni vengono rapidamente riscaldati a 94 °C, causando la separazione dei filamenti di DNA. Il raffreddamento rapido a 59 °C consente ai primer di ricottura ai filamenti di DNA separati, quindi di riscaldarsi a 72 °C per la DNA polimerasi Taq per estendere i primer, facendo copie complete di ciascun filamento di DNA e completando un ciclo termico.

Il DNA amplificato può quindi essere fatto passare attraverso un gel di agarose con elettroforesi per separare il DNA in bande visibili per l'identificazione del gene promotore 35S e del terminatore NOS. Il DNA amplificato viene caricato in pozzeggi a un'estremità del gel, utilizzando un colorante di carico acquistato che aiuta ad appesantire il campione per prevenire la dissoluzione nel tampone circostante. Il colorante di carico fornisce anche una visuale, quindi il movimento del DNA può essere visto durante l'elettroforesi nel colorante "anteriore". Il processo di elettroforesi funziona utilizzando una corrente elettrica separata in estremità catodiche e anodiche. Il DNA viene caricato nel gel all'estremità più vicina al lato catodico della camera e la carica negativa del DNA viene attratta dall'estremità anodica della camera e viene tirata attraverso l'agarose. Le sequenze più grandi di DNA (aumento del numero di coppie di basi) non possono muoversi così facilmente attraverso l'agarose e si separeranno presto, mentre le sequenze più piccole sono in grado di viaggiare più in basso nel gel verso l'estremità dell'anodo.

Un processo di colorazione aiuta legandosi al DNA al fine di aggiungere contrasto tra il gel di fondo e le banche di DNA per una migliore visualizzazione dei risultati. Utilizzando le posizioni note fornite per le diverse dimensioni delle sequenze di DNA, ogni gel di prova può essere analizzato per la presenza o l'assenza dei geni del promotore 35S e del terminatore NOS.

I controlli vengono utilizzati per garantire che il DNA sia estratto correttamente e per fornire un confronto con i campioni di alimenti in esame. Il primer vegetale acquistato viene aggiunto a ciascun campione per fornire acidi nucleici comuni a tutte le piante. Ciò consente un controllo di qualità sul processo di estrazione del DNA, perché qualsiasi DNA vegetale estratto dovrebbe essere esteso con questo primer durante la PCR e dovrebbe anche essere visto sul gel dopo che l'elettroforesi è completa. Il primer acquistato per i geni 35S e NOS viene utilizzato come controllo positivo per fornire bande di DNA sul gel per la modificazione genetica. Se il controllo del modello OGM-positivo non si amplifica, c'è un problema con la reazione PCR e non ci si può fidare di un risultato NEGATIVO AGLI OGM dal cibo in esame. Un prodotto alimentare non OGM certificato viene anche acquistato e utilizzato come controllo negativo per mostrare come appare la separazione del DNA quando non è presente materiale geneticamente modificato.

1. Estrazione del DNA da campioni di cibo

1. Aggiungere 500 μL di matrice di miscelazione PCR acquistata a ciascuno dei 2 tubi a vite utilizzando un pipetto di trasferimento o una micropipetta a volume regolabile da 200-1.000 μL. Pipettare su e giù con il pipetto tra ogni aliquota per mescolare uniformemente la matrice PCR.
2. Etichettare un tubo con tappo a vite "non-OGM" e l'altro "test".
3. Pesare 0,5 g di cibo certificato non OGM e metterlo nella malta.
4. Aggiungere 2,5 ml di acqua distillata e macinare con pestello per 2 minuti per formare un impasto.
5. Aggiungere altri 2,5 ml di acqua distillata e continuare a macinare con pestello fino a quando il liquame diventa abbastanza liscio da pipettare.
6. Pipetta 50 μL di liquame macinato al tubo a vite contenente 500 μL di premiscela PCR etichettato "non OGM" utilizzando il marchio 50 μL su un pipetto graduato. Tubo di riepilogo.
7. Ripetere i passaggi 1.3–1.6 per preparare il campione alimentare di prova.
8. Pipettare 50 μL di liquame alimentare di prova a terra al tubo a vite etichettato "test". Tubo di riepilogo.
9. Vortice il cibo non OGM e testare i tubi PCR degli alimenti per 1 minuto e posizionare i tubi a bagnomaria a 95 ° C per 5 minuti. Se non è disponibile alcun vortice, scorrere il tubo più volte per mescolare prima di metterlo a bagnomaria.
10. Mettere i tubi in una centrifuga per 5 minuti. Un pellet solido dovrebbe formarsi sul fondo del tubo. Se il pellet non si forma dopo 5 minuti, centrifugare di nuovo per intervalli di 2 minuti fino alla formazione del pellet.
11. I tubi possono essere utilizzati immediatamente per la PCR o conservati in frigorifero per un massimo di 1 settimana.

2. Impostazione delle reazioni PCR

1. Numero di tubi PCR 1-6 e iniziali. I numeri devono corrispondere al seguente contenuto del tubo elencato nella tabella 1.
2. Posizionare ogni tubo PCR etichettato in un supporto per microtubi con i tappi aperti.
3. Utilizzando una nuova punta per ogni aggiunta, aggiungere 20 μL del primer indicato nella Tabella 1 a ciascun tubo PCR. Tubi del cappuccio.
4. Utilizzando una punta fresca per ogni tubo, aggiungere 20 μL del campione di DNA indicato nella Tabella 1 a ciascun tubo PCR, assicurandosi di pipettare solo dal surnatante ed evitando il pellet solido sul fondo dei tubi.
5. Dopo che ogni campione di DNA è stato pipettato nel tubo PCR corrispondente, utilizzare la pipetta per mescolare DNA e primer pipettando delicatamente su e giù; tubi di riepilogo.
6. Posizionare i tubi PCR nel termocicclatore e programmare il cycler per:
   Denaturazione iniziale: 1 ciclo a 94 °C per 2 min.
   Amplificazione: 40 cicli a 94 °C per 1 min (denaturazione), 59 °C per 1 min (ricottura) e 72 °C per 2 min (estensione).
   Estensione finale: 1 ciclo a 72 °C per 10 min.
   Tenere: 4 °C a tempo indeterminato.

3. 3% di preparazione del gel di acarosio

1. Usando nastro da laboratorio o da mascheratura, togliere saldamente il nastro dalle estremità aperte del vassoio del gel. Assicurarsi che il nastro sia sigillato ai bordi del vassoio per evitare che l'agarose fuso fuoriesca.
2. Pesare 3 g di agarose in un matraccio Erlenmeyer da 250 ml o superiore.
3. Aggiungere 100 ml di 1x tampone TAE (acquistato o preparato dal concentrato).
4. Utilizzando una piastra calda magnetica con una barra di agitazione, riscaldare il becher fino a quando l'agarose è completamente sciolto nel tampone e la soluzione bolle e diventa limpida. In alternativa, un forno a microonde può essere utilizzato mettendo il becher nel forno e riscaldando per intervalli di 30 s, usando un'asta di agitazione per mescolare ogni 10 s, ripetendo fino a quando la miscela è bollente e diventa chiara.
5. Invertire un matraccio Erlenmeyer da 50 mL nell'apertura del matraccio da 250 mL per agire come reflusso, impedendo l'evaporazione della soluzione di agarose.
6. Lasciare raffreddare la soluzione di agarose a 60 °C e versare 30-50 ml in ogni vassoio di gel nastrato.
7. Metti un pettine di gel nel primo paio di tacche per creare pozzette di gel.
8. Lasciare raffreddare completamente il gel prima di rimuovere il nastro e pettinare. Il gel si solidificherà e si trasformerà da limpido a torbido quando sarà pronto, circa 10-20 minuti.

4. Elettroforesi dei prodotti PCR

1. Posizionare un gel di acarosio al 3% precondito su un vassoio di gel o utilizzare un vassoio di gel che è stato utilizzato per lanciare un gel di agarose al 3% versato.
2. Far scorrere il vassoio in gel nella camera di elettroforesi con i pozzeli più vicini all'estremità del catodo (nero).
3. Versare 1x tampone TAE nella camera, sufficiente per avere 2 mm di tampone sopra la parte superiore del vassoio del gel.
4. Ottenere tubi PCR dal termociclatore e posizionarli nel supporto per microtubi.
5. Utilizzando ogni volta una punta di pipetta fresca, aggiungere 10 μL di colorante di caricamento Orange G (LD) acquistato a ciascun campione e mescolare bene.
6. Caricare 20 μl del righello del peso molecolare e 20 μL di ciascun campione nel gel nell'ordine indicato (Tabella 2).
7. Eseguire l'elettroforesi su gel per 30 minuti a 100 V.
8. Rimuovere il vassoio di gel dalla camera e far scorrere il gel per rimuovere dal vassoio. Mettere il gel in un vassoio di colorazione.
9. Immergere il gel nella macchia di gel DNA acquistata per 5 minuti, scuotendo accuratamente il vassoio per aiutare a distribuire la macchia in tutto il gel.
10. Trasferire il gel in un contenitore di lavaggio e risciacquare con acqua di rubinetto (40-55 °C) per circa 10 s.
11. Destain lavando 3 volte in acqua calda del rubinetto per 6 minuti ciascuno con un leggero scuotimento per ottenere i migliori risultati. Se necessario, continuare a destaining in acqua tiepida fino a raggiungere il contrasto desiderato.

Tabella 1. Elenco dei numeri di tubo appropriati, primer e campioni di DNA.

Tabella 2. L'ordine appropriato per caricare 20 μL del righello del peso molecolare e 20 μL di ciascun campione nel gel.

Dopo la dessazione, i gel possono essere analizzati osservando le corsie alimentari di prova (Tabella 3) per determinare se le bande di DNA per il promotore 35S e i geni terminatore NOS sono presenti nelle posizioni note sul gel. Posizionare il gel su una scatola di luce UV può aiutare a fornire un maggiore contrasto (Figura 1). In alternativa, i gel possono essere posizionati su carta bianca o gialla per fornire uno sfondo contrastante per evidenziare le bande del DNA (Figura 2).

Figura 1. Un gel contaminato che mostra bande separate di DNA. Gel di agarose a seguito di elettroforesi su gel di agarose su scatola di luce UV.

Figura 2. Diagramma delle posizioni note per il promotore 35S e il DNA del terminatore NOS. La presenza o l'assenza di una banda di 200 bp nella corsia 5 indica se l'alimento in esame contiene o meno OGM.

Tabella 3. Dimensioni della banda del campione PCR (coppie di basi (bp)).

La reazione a catena della polimerasi (PCR) viene utilizzata per amplificare il DNA, consentendo una vasta gamma di test di laboratorio del DNA. Un'area di test ora possibile con la PCR è identificare gli OGM testando la presenza o l'assenza delle sequenze di DNA utilizzate nella modificazione genetica delle colture alimentari. Tipicamente, una coltura è geneticamente modificata per conferire un vantaggio contro i deterrenti naturali alle rese ideali, ad esempio parassiti (Figura 3), malattie, condizioni di siccità (Figura 4), ecc. Poiché il vantaggio si ottiene inserendo materiale genetico di una specie diversa nel DNA della pianta vegetale, i potenziali rischi per la salute umana e l'ambiente sono stati identificati con l'uso di OGM. Una preoccupazione ambientale è la capacità del DNA geneticamente modificato di essere scambiato involontariamente attraverso processi di impollinazione, il che potrebbe portare a DNA geneticamente modificato che entra nei genomi di colture destinate ad essere vendute come non OGM.

Figura 3. Larve di coleottero del Colorado, divorando foglie di una patata.

Figura 4. Mais distrutto dalla siccità.