Determinazione della stabilità sierica dell'enzima adenosina deaminasi 1 umana

In questo articolo, descriviamo in dettaglio i metodi per caratterizzare la capacità di un enzima di mantenere la funzione quando incubato a 37 °C nel siero umano, una proprietà farmacologica indicata come stabilità del siero. Questa capacità può essere un fattore chiave nel prevedere il profilo farmacocinetico di un enzima e la sua idoneità per l'uso terapeutico.

Il concetto di stabilità enzimatica è tipicamente usato per riferirsi alla termostabilità di un enzima, la sua capacità di mantenere la struttura e l'attività all'aumentare della temperatura. Per un enzima terapeutico, possono essere fondamentali anche altre misure di stabilità, in particolare la sua capacità di mantenere la funzione nel siero umano a 37 °C, che chiamiamo stabilità del siero. Qui, descriviamo un test in vitro per valutare la stabilità sierica dell'enzima wildtype Homo sapiens adenosina deaminasi I (HsADA1) utilizzando una procedura di micropiastra basata sull'assorbanza. In particolare, questo manoscritto descrive la preparazione di tamponi e reagenti, un metodo che organizza la coincubazione di HsADA1 nel siero, un metodo per analizzare i campioni di prova utilizzando un lettore di micropiastre e un'analisi di accompagnamento per determinare la frazione di attività che un enzima HsADA1 mantiene nel siero in funzione del tempo. Discutiamo inoltre le considerazioni per adattare questo protocollo ad altri enzimi, utilizzando un esempio di un enzima chinurenina Homo sapiens , per aiutare l'adattamento del protocollo ad altri enzimi in cui la stabilità sierica è di interesse.

Il seguente metodo consente a un utente di valutare quantitativamente la capacità di un enzima di mantenere la sua attività quando esposto a condizioni che imitano ciò che incontrerà dopo l'iniezione endovenosa. Il metodo in vitro imita tali condizioni in vivo e consiste nell'incubazione dell'enzima in un pool di siero umano a 37 °C e nell'analisi a tempo determinato della ritenzione dell'attività enzimatica. Ci riferiamo alla capacità di un enzima di mantenere l'attività in queste condizioni come stabilità del suo siero e il metodo di analisi per l'attività enzimatica sfrutta le differenze di assorbanza tra il substrato di un enzima e il prodotto risultante. Il concetto di stabilità del siero non è solo enzimatico specifico ed è stato applicato anche a diverse altre modalità di trattamento. Ad esempio, la stabilità sierica degli aptameri dell'RNA che hanno come bersaglio le proteine spike del COVID è stata precedentemente valutata monitorando la loro degradazione post-incubazione con siero fetale di vitello¹. I peptidi antibatterici sono stati anche valutati per la loro capacità di sopprimere la crescita batterica dopo l'incubazione con siero umano aggregato².

HsADA1 è un enzima appartenente alla classe delle transferiche di adenosina o 2-deossiadenosina in inosina o 2-deossiinosina, rispettivamente³. L'adenosina ha un picco di assorbimento di 260 nm, mentre l'inosina assorbe più forte a 250 nm⁴. Questo cambiamento nei picchi di assorbimento può essere rilevato su un lettore di micropiastre da una diminuzione dell'intensità di assorbimento a 260 nm quando HsADA1 viene aggiunto all'adenosina. L'enzima HsADA1 ha importanti implicazioni nel corpo umano e la sua carenza provoca una grave immunodeficienza combinata (ADA-SCID)⁵. L'omologo bovino di HsADA1, BtADA1, può essere utilizzato come terapia enzimatica sostitutiva per il trattamento di ADA-SCID, e abbiamo precedentemente dimostrato che HsADA1 wildtype perde la sua attività quando incubato con siero umano in pool, ostacolando potenzialmente il suo uso come terapeutico⁶. Pertanto, abbiamo selezionato l'enzima HsADA1 wildtype per dimostrare una procedura per determinare la stabilità sierica di un enzima. Un metodo di purificazione dettagliato per HsADA1 è stato descritto in precedenza⁶.

Nel seguente protocollo (come dettagliato nella Figura 1), dimostriamo come co-incubare HsADA1 wildtype in siero umano aggregato a 37 °C. Durante questo periodo, i campioni di prova vengono prelevati in punti temporali definiti e congelati per analisi future. Una volta prelevati tutti i campioni, viene eseguito un saggio su micropiastra in cui ogni campione viene combinato con il substrato, con la diminuzione dell'assorbanza risultante che è una correlazione per l'attività mantenuta dell'enzima. Vengono mostrati risultati rappresentativi che illustrano la stabilità sierica di HsADA1 e, poiché questa metrica può essere rilevante per determinare il potenziale valore terapeutico di altri enzimi, discutiamo anche le considerazioni per adattare questo protocollo a un enzima chinureninasi ingegnerizzato di Homo sapiens (HsKYNase) e a qualsiasi enzima più in generale. La HsKYNasi è un enzima coinvolto nel metabolismo del triptofano ed è in grado di degradare i sottoprodotti del triptofano chinurenina e idrossi-chinurenina (OH-Kyn) in acido antranilico e acido idrossi-antranilico (OH-AA), rispettivamente. La modulazione enzimatica del metabolismo del triptofano può essere di rilevanza terapeutica⁷.

1. Incubazione del siero

1. Preparare una dose 10x di HsADA1 in 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) a una concentrazione finale di 10 μM. Scongelare un'aliquota di 15 mL di siero umano aggregato e preriscaldarla a 37 °C. Preriscaldare un'aliquota da 50 mL di 1x PBS a 37 °C.
2. Preparare le miscele di incubazione enzima-siero aggiungendo 100 μl del stock 10x HsADA1 a 900 μl di siero umano aggregato in una provetta da microcentrifuga a basso legame, denominata miscela enzima + siero. In una provetta da microcentrifuga separata a basso legame, aggiungere 100 μl del 10x HsADA1 stock a 900 μl di 1x PBS per il confronto con un controllo non sierico, indicato come miscela enzima + 1x PBS. La concentrazione finale di HsADA1 in ciascuna miscela sarà di 1 μM.
3. Preparare un controllo aggiuntivo in una provetta da microcentrifuga a basso legame composta da 100 μl di 1x PBS miscelato con 900 μl di siero umano aggregato. Questo servirà come controllo non enzimatico per la miscela enzima + siero. Inoltre, effettuare un controllo composto da 1 ml di 1x PBS. Questo servirà come controllo non enzimatico per la miscela enzimatica + 1x PBS.
4. Aliquotare 100 μl di ciascuna miscela dalla fase 1.2 in provette separate a basso legame e diluire 1:1 con 100 μl di glicerolo al 30% (v/v) in 1x PBS. Congelare con azoto liquido e conservare a -80 °C. Questi campioni saranno il punto temporale del Giorno 0 e la concentrazione di HsADA1 in essi sarà di 500 nM. Ripetere questo passaggio per le miscele di controllo non enzimatiche dal punto 1.3. Sigillare tutti gli enzimi e le miscele di controllo con una pellicola trasparente e metterle in un incubatore a 37 °C.
5. Dopo 24 ore, aliquotare 100 μL di ciascun campione incubato e diluire 1:1 con 100 μL di glicerolo al 30% (v/v) in 1x PBS. Congelare con azoto liquido e conservare a -80 °C. Questi campioni saranno il punto temporale del giorno 1. Riportare tutte le miscele enzimatiche e di controllo nell'incubatore a 37 °C. Ripetere questo passaggio a 72 ore e 120 ore.
   NOTA: I campioni quotati in aliquote non devono necessariamente essere congelati all'istante. In alternativa, l'utente può eseguire il test basato su micropiastra immediatamente dopo il prelievo di ciascun campione, anche se ogni volta che viene testato un campione devono essere preparate nuove curve standard e stock di substrato di adenosina.

2. Saggio basato su micropiastra

1. Preparare il lettore di micropiastre impostando un protocollo di lettura cinetica (Figura 2) per misurare l'assorbanza a 260 nm con l'intervallo di lettura più breve per 30 minuti e preriscaldare il lettore a un setpoint di 37 °C.
2. Scongelare tutti i campioni raccolti sul ghiaccio. Diluire ogni campione scongelato 1:10 utilizzando 1x PBS preriscaldato a 37 °C come diluente in provette per microcentrifuga a basso legame. La nuova concentrazione di HsADA1 in questi campioni sarà di 50 nM.
3. Effettuare una diluizione 10x in 1x PBS anche dal campione di controllo del siero non enzimatico. Inoltre, preparare un stock di adenosina da 5 mM aggiungendo 66,8 mg di adenosina a 50 mL di 1x PBS. Preparare una diluizione di 250 μM di adenosina aggiungendo 400 μL di adenosina stock a 7.600 μL di 1x PBS e preriscaldarla a 37 °C in un incubatore.
4. A una micropiastra a 96 pozzetti compatibile con i raggi UV, aggiungere 160 μl di diluizione di adenosina da 250 μM e 40 μl di ciascun campione proteico diluito in triplicato per un volume totale di 200 μl. Ciò produrrà una concentrazione finale di adenosina di 200 μM e una concentrazione enzimatica finale di 10 nM.
5. Ripetere la diluizione per i campioni di controllo aggiungendo 40 μl di siero diluito o 1x controlli PBS e 160 μl di diluizione di adenosina 250 μM in triplicato. Questo produrrà anche una concentrazione finale di adenosina di 200 μM ma senza enzima.
   NOTA: Può essere utile aggiungere prima tutti i campioni di enzima diluito e di controllo singolarmente alla micropiastra e poi aggiungere il substrato di adenosina con una micropipetta a 12 canali per ridurre il tempo di caricamento totale. Inoltre, in questa fase è necessario utilizzare piastre trasparenti ai raggi UV per evitare che la piastra stessa confonda il segnale di assorbanza misurato.
6. Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 260 nm per 30 minuti a 37 °C. Una volta terminato, esporta i dati in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.

3. Analisi dei dati del lettore di micropiastre

1. Determinare la pendenza della regione lineare dei dati di assorbanza in funzione del tempo per i primi minuti dei dati della micropiastra. Per i campioni diluiti con siero, questo corrispondeva ai primi ~120 s. Per i campioni diluiti con PBS 1x, questo corrispondeva ai primi ~270 s. Questa pendenza dei valori di assorbanza decrescenti avrà un valore numerico negativo e avrà unità di variazione in unità di assorbanza al secondo (ΔA260/s).
2. Sottrarre la pendenza del controllo negativo costituito da siero umano aggregato dalla pendenza dei dati enzima + siero. Eseguire la stessa operazione sulle miscele enzimatica + 1x PBS sottraendo la pendenza del controllo 1x PBS.
3. Normalizzare tutte le pendenze regolate alla pendenza originale a t=0 h per ottenere la frazione di attività rimanente utilizzando l'equazione 1.
   Equazione 1
4. Traccia la frazione di attività rimanente rispetto al tempo.

Le cifre mostrano i risultati dell'esecuzione del test quando condotto con HsADA1 wildtype. Le figure 3A, B illustrano le curve di declino dell'assorbanza a 260 nm dei campioni originati dalle miscele 1x PBS/siero-enzima per HsADA1 wildtype dopo l'aggiunta di adenosina. Questa diminuzione dell'assorbanza in funzione dei dati temporali è ciò che l'utente può aspettarsi dopo aver completato con successo il test basato su micropiastra ed è simile ai dati di assorbanza che si verificherebbero dopo l'aggiunta di quantità sufficienti di HsADA1 funzionale all'adenosina. La Figura 3C,D illustra le curve di assorbanza dei controlli negativi testati, che non contengono enzimi dopo l'aggiunta di adenosina. Rispetto ai campioni enzimatici effettivi, la variazione di assorbanza di questi controlli negativi è quasi trascurabile. Dalla Figura 3, si può vedere che le pendenze delle curve enzimatiche cambiano in funzione del tempo di incubazione. Ad esempio, la pendenza del punto temporale del giorno 0 è notevolmente più ripida rispetto al punto temporale del giorno 5.

La Figura 4 illustra la frazione di attività mantenuta da HsADA1 wildtype in funzione del tempo quando incubato in 1x PBS o in siero umano aggregato a 37 °C. In particolare, le pendenze di tutte le curve di declino dell'assorbanza nella Figura 3A, B sono normalizzate alle pendenze del giorno 0 dei rispettivi gruppi. Come si può vedere nella Figura 4, c'è una divergenza nell'attività mantenuta per HsADA1 wildtype in 1x PBS rispetto al siero umano aggregato. In particolare, l'enzima perde la sua attività più velocemente nel siero umano raggruppato, con l'enzima che mantiene circa il 10% della sua attività originale al giorno 5. Una perdita di attività è ancora rilevabile quando HsADA1 è incubato in 1x PBS, sebbene l'enzima mantenga circa il 75% della sua attività. Ciò è congruente con i risultati di Jennings et al., che riportano anche una diminuzione dell'attività dopo l'incubazione con siero a 37 °C di quasi il 40% dopo 48 ore⁶. Lu et al. hanno anche dimostrato che l'attività di HsADA1 diminuisce nei fluidi corporei pleurici, peritoneali e cerebrospinali a temperatura ambiente (25 °C)⁸.

Per dimostrare la flessibilità di questo protocollo, lo abbiamo utilizzato per testare la stabilità sierica di un altro enzima di origine umana, una variante ingegnerizzata della chinurenina umana precedentemente soprannominata HsKYNase66-W102H-T333N⁷. HsKYNase66_W102H-T333N catalizza efficacemente la conversione di OH-Kyn in OH-AA, in modo simile all'enzima HsKYNase wildtype, sebbene sia in realtà un mutante di reversione di due aminoacidi di una variante ingegnerizzata della chinurenina umana con alterata specificità del substrato, cioè che degrada efficacemente la chinurenina in acido antranilico⁷. OH-Kyn assorbe fortemente a 379 nm, mentre OH-AA no, con conseguente calo dell'assorbanza misurabile dopo l'aggiunta della nostra variante ingegnerizzata HsKYNasi a OH-kyn ^9,10. La Figura 5A,B illustra le curve di declino dell'assorbanza a 379 nm dei campioni originati dalle miscele 1x PBS/siero-enzima per HsKYNasi dopo l'aggiunta di OH-Kyn. La Figura 5C,D illustra le curve di assorbanza dei controlli testati che non contengono enzimi. Come si è visto con HsADA1, c'è una chiara differenza nelle pendenze delle curve di assorbanza tra i campioni. Ciò è particolarmente evidente nella Figura 5A, poiché la pendenza del punto temporale 0 ore è molto più ripida rispetto ai punti temporali 3 ore e 24 ore. La Figura 6 illustra la corrispondente frazione di attività mantenuta per la HsKYNasi testata in funzione del tempo. Come HsADA1, HsKYNase66-W102H-T333N perde attività nel siero più rapidamente che nella PBS (~85% di attività persa rispetto a ~40% nel corso di 24 ore). Sebbene la stabilità sierica di questa variante enzimatica non sia stata precedentemente testata, segue la tendenza generale di altre varianti di HsKYNase, che hanno perso la maggior parte della loro attività entro 24 ore nel siero a 37 °C⁷.

In generale, gli enzimi potrebbero perdere attività nel tempo a causa di una serie di fattori, tra cui il pH, la concentrazione di sale, la temperatura e altro^{ancora 11}. Pertanto, un risultato che non segue questo andamento potrebbe essere considerato anormale. Ad esempio, se l'attività enzimatica aumenta drasticamente nel tempo, ciò potrebbe indicare che i risultati non sono validi. Questo supponendo che le condizioni enzimatiche non vengano modificate, e stiamo parlando strettamente in senso temporale.

Figura 1: Diagramma di flusso che descrive in dettaglio i passaggi del protocollo per HsADA1. La figura mostra i passaggi seguiti in questo protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Impostazioni di lettura cinetica del lettore di micropiastre. È stato creato un protocollo di lettura cinetica per misurare l'assorbanza a 260 nm per 30 minuti a 37 °C con l'intervallo minimo. La figura illustra le impostazioni scelte per impostare questo protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Curve di assorbanza rispetto al tempo per HsADA1 dopo l'aggiunta di 200 μM di adenosina. (A) Curve di assorbanza rispetto al tempo per HsADA1 incubato nel siero dopo l'aggiunta di 200 μM di adenosina. (B) 1x HsADA1 incubato con PBS. (C) Controllo sierico negativo. (D) 1x controllo negativo PBS (n =3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Ritenzione dell'attività di HsADA1. L'attività è valutata in 1x PBS rispetto al siero umano aggregato a 37 °C. È stata determinata la frazione di attività originale mantenuta per HsADA1 incubato in 1x PBS rispetto al siero umano aggregato nel corso di 5 giorni (barre = media ± SD, n=3). È stato utilizzato un test t non accoppiato a due code *p<0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Curve di assorbanza rispetto al tempo per HsKYNase66-W102H-T333N dopo l'aggiunta di 400 μM di OH-Kyn. (A) Curve di assorbanza rispetto al tempo per HsKYNasi incubata nel siero dopo l'aggiunta di 400 μM di OH-Kyn. (B) 1x HsKYNasi incubata con PBS. (C) Controllo sierico negativo. (D) 1x controllo negativo PBS (n=3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Ritenzione dell'attività di HsKYNase66-W102H-T333N. L'attività è valutata in 1x PBS rispetto al siero umano aggregato a 37 °C. È stata determinata la frazione di attività originale mantenuta per HsKYNase66-W102H-T333N incubata in 1x PBS rispetto al siero umano aggregato nel corso di 24 ore (barre = media ± SD, n=3). È stato utilizzato un t-test non accoppiato a due code; p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Curva standard di adenosina e inosina. Il grafico è stato disegnato per 0-200 μM. L'adenosina o l'inosina sono state aggiunte a 1x PBS alle concentrazioni indicate, quindi è stata misurata l'assorbanza a 260 nm. (n=3). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Curva standard di OH-Kyn. Il grafico è stato disegnato per 0-400 μM. OH-Kyn è stato aggiunto a 1x PBS alle concentrazioni indicate, quindi è stata misurata l'assorbanza a 379 nm. (n=3). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 3 supplementare: Curve di assorbanza rispetto al tempo a 260 nm con concentrazioni crescenti di HsADA1 dopo l'aggiunta di 200 μM di adenosina. (A) Curve di reazione per concentrazioni variabili di HsADA1. (B) Variazione di piegatura della pendenza della regione lineare delle curve di assorbanza in relazione a un controllo PBS 1x (barre = media ± SD, n=3). È stato utilizzato un test t non accoppiato a due code **p < 0,01 e ****p < 0,0001. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 4 supplementare: Curve di assorbanza rispetto al tempo a 379 nm con concentrazioni crescenti di HsKYNasi ingegnerizzata dopo l'aggiunta di 400 μM di OH-Kyn. (A) Curve di reazione per concentrazioni variabili di HsKYNasi ingegnerizzata. (B) Variazione di piegatura della pendenza della regione lineare delle curve di assorbanza in relazione a un controllo PBS 1x (barre = media ± SD, n=3). È stato utilizzato il t-test non accoppiato a due code ****p < 0,0001. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 5 supplementare: Curve di assorbanza rispetto al tempo a 379 nm utilizzando l'enzima disattivato termicamente in 400 μM di OH-Kyn. L'enzima HsKYNasi deattivato a caldo è stato aggiunto a 400 μM di OH-Kyn in 1x PBS, quindi è stata misurata l'assorbanza a 379 nm. (n=3). Clicca qui per scaricare questo file.

Questo protocollo utilizza la variazione dell'assorbanza quando il substrato viene convertito nel prodotto per misurare l'attività di un enzima. Pertanto, il substrato e il prodotto devono avere profili spettrali distinti. Questo è il caso dell'adenosina e dell'inosina, entrambe con profili spettrali distinti e coefficienti di estinzione compresi tra 260-265 nm 6,8,12,13. Questo saggio si ispira a diversi lavori precedenti. Kalackar, ad esempio, ha utilizzato la variazione dell'assorbanza a 265 nm come correlata diretta per l'attività dell'adenosina deaminasi¹⁴. Gracia et al. e Lu et al. hanno impiegato un approccio radicato nella legge di Beer-Lambert, che mette in relazione la velocità iniziale con la differenza nei coefficienti di estinzione tra adenosina e inosina ^8,13. Allo stesso modo, OH-Kyn e OH-AA hanno anche profili spettrali distinti in quanto OH-Kyn assorbe fortemente a 379 nm mentre OH-AA non lo fa ^9,10. Lo spettro di assorbanza dei metaboliti può essere facilmente controllato utilizzando una scansione a spettro completo su molti lettori di micropiastre, che, a sua volta, informerebbe l'utente se è possibile monitorare l'andamento di una reazione enzimatica. Come affermato in precedenza, Lu et al. hanno precedentemente analizzato la stabilità nativa di HsADA1 in diversi fluidi corporei, e Jennings et al. hanno impiegato un metodo molto simile per misurare la stabilità sierica di HsADA1 ricombinante e di un enzima mutante ^6,8. Questo metodo, come quello di Jennings et al., è unico in quanto possiamo utilizzare enzimi espressi in modo ricombinante rispetto a quelli derivati in modo nativo. In tal modo, questo metodo può essere estrapolato a proteine mutanti che non si trovano nativamente all'interno degli organismi viventi.

Per le combinazioni prodotto/substrato che non possono essere misurate utilizzando un saggio di assorbanza basato su piastra, questo protocollo può essere modificato per incorporare diversi altri metodi analitici alternativi che tracciano la degradazione del substrato o la formazione del prodotto per i saggi cinetici, come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), che ad esempio è stata precedentemente utilizzata per valutare la cinetica sia dell'adenosina deaminasi che della chinurenina^{15, 16,17}. Solo il metodo per determinare il substrato rimanente o il prodotto creato dopo un certo tempo (se non determinato continuamente) dovrebbe variare. La scelta del test dipenderà, ovviamente, dalla reazione catalizzata dall'enzima di interesse, e una considerazione chiave in questa scelta sarà anche la compatibilità di un determinato metodo analitico con il siero umano diluito. Di uguale importanza può essere anche il tempo totale necessario per analizzare tutti i campioni di interesse, e un vantaggio chiave dell'utilizzo del test su micropiastra è la capacità di analizzare facilmente i tassi di degradazione in un massimo di 96 campioni alla volta.

I parametri del saggio, come l'enzima su piastra e le concentrazioni del substrato, dovranno essere regolati per i singoli enzimi di interesse. Per tutti i saggi qui condotti, è stata scelta una concentrazione di substrato superiore a K_m di un ordine di grandezza maggiore (1,15-1,26 OOM). Wildtype HsADA1 ha un K_m di ~14 μM per l'adenosina e la concentrazione finale di adenosina su piastra utilizzata è stata di 200 μM³. Allo stesso modo, la variante ingegnerizzata di HsKYNase testata ha un K_m ~ 22 μM per OH-Kyn e la concentrazione finale di OH-Kyn su piastra utilizzata è stata di 400 μM⁷. Un requisito importante per le concentrazioni del substrato di interesse per il saggio su micropiastra è che il substrato obbedisca alla legge di Beer-Lambert entro l'intervallo dato, in modo tale che una diminuzione dell'assorbanza possa essere correlata linearmente con la degradazione del substrato (Figura 1 e Figura 2 supplementare). Questa correlazione lineare elimina la necessità di convertire la variazione dell'assorbanza in concentrazione del substrato, poiché l'esecuzione di questa conversione non modificherebbe la frazione di attività rimanente.

Per quanto riguarda la concentrazione dell'enzima, il criterio principale da considerare è che ci sia una sufficiente degradazione del substrato rispetto al fondo. Sia per HsADA1 che per HsKYNase ingegnerizzata, abbiamo utilizzato valori di letteratura precedentemente pubblicati per generare risultati rappresentativi ^6,7. Come abbiamo dimostrato qui, l'utilizzo di tempi più brevi con concentrazioni enzimatiche più elevate può essere fattibile, così come l'utilizzo di tempi più lunghi e concentrazioni enzimatiche più basse. In generale, un periodo di tempo più lungo/una concentrazione enzimatica più bassa possono dare risultati più riproducibili a meno che il substrato stesso non sia soggetto a degradazione. In questo senso, sia la chinurenina che i suoi derivati, incluso l'OH-Kyn, si degradano in modo relativamente rapido a temperatura ambiente, provocando un notevole ingiallimento della miscela di substrato¹⁸. Per altri enzimi, è possibile condurre un semplice esperimento di escalation della concentrazione per identificare le concentrazioni con le curve di reazione e la separazione di fondo più ottimali. L'esecuzione di questa escalation di concentrazione su HsADA1 mostra che entro un intervallo da 1 a 10 nM, si ottiene la massima separazione di fondo (Figura 3 supplementare). L'esecuzione dello stesso esperimento di escalation della concentrazione con HsKYNasi ingegnerizzata mostra una tendenza simile con la massima separazione di fondo a 2 μM (Figura 4 supplementare). Tuttavia, entrambi i test (HsADA1 contro HsKYNasi) non possiedono la stessa sensibilità. Per HsADA1, una concentrazione enzimatica su piastra pari a un decimo di quella utilizzata nel protocollo è ancora distinguibile dal fondo a livelli statisticamente significativi (Figura 3 supplementare). Lo stesso non vale per la HsKYNasi, il che significa che potrebbe essere più difficile valutare quantitativamente quanta attività la HsKYNasi mantiene una volta che ha perso più del 90% della sua attività. Ciò rappresenta una potenziale limitazione del metodo di lettura delle micropiastre.

Inoltre, un'osservazione che abbiamo fatto per la HsKYNasi è stata che al momento del caricamento della piastra, c'era un divario immediato tra le letture dell'assorbanza tra l'enzima + 1x campioni PBS e il controllo 1x PBS (Figura 5B, D). Questo divario era presente per tutti i punti temporali. Poiché abbiamo osservato questo fenomeno anche durante il test dell'enzima disattivato termicamente (riscaldato a 95 °C per 10 minuti), abbiamo concluso che non era il risultato della degradazione del substrato mediata dall'enzima (Figura 5 supplementare). Mentre abbiamo proceduto con i valori di assorbanza di controllo originali, studi futuri potrebbero utilizzare controlli enzimatici disattivati per eliminare questa discrepanza. Tuttavia, è necessario tenere conto del costo di acquisto o di produzione dell'enzima di interesse. Sia per la HsKYNasi che per la HsADA1, c'era una certa variabilità nei valori di assorbanza iniziale dei campioni di prova, con alcuni che partivano da un valore di assorbanza inferiore rispetto ai controlli associati (Figura 3 e Figura 5). Ciò potrebbe essere in parte attribuito al ritardo nell'aggiunta del substrato a tutti i campioni proteici, seguito dal caricamento nel lettore di piastre. Tuttavia, poiché la concentrazione del substrato utilizzato è molto più alta dei valori K_m degli enzimi utilizzati, non ci si aspetta che ciò porti a effetti dipendenti dalla concentrazione del substrato sulle pendenze osservate.

Nella sezione del protocollo e dei risultati rappresentativi, i campioni vengono aliquotati nei punti temporali indicati, con il tempo di campionamento che varia in base al profilo di attività di un enzima. Questo programma di campionamento dipenderà dal profilo di attività di un enzima di interesse nel siero. Se un enzima perde rapidamente attività, si desidera un intervallo di campionamento più breve, come nel caso del mutante HsKYNase_66-W102H-T333N testato, e il contrario è vero per gli enzimi con una maggiore stabilità sierica. Pertanto, è probabilmente utile eseguire una prova di questo protocollo in cui le aliquote vengono campionate sia a piccoli intervalli (1 ora, 2 ore, ecc.) che a grandi intervalli (24 ore, 48 ore, ecc.) per esaminare l'aspetto del profilo di stabilità sierica per un nuovo enzima di interesse. Naturalmente, man mano che diventa più robusto, la stabilità sierica diventerà meno rilevante rispetto alla clearance renale o ad altri meccanismi di clearance proteica in vivo .

Poiché le chinureninasi differiscono da HsADA1, abbiamo modificato diversi parametri del test, vale a dire la concentrazione dell'enzima durante l'incubazione nel siero o in 1x PBS, l'intervallo di campionamento, la concentrazione dell'enzima del saggio su micropiastra, la concentrazione del substrato del test su micropiastra e, naturalmente, il substrato stesso. Le modifiche sono: lo stock enzimatico 10x era a una concentrazione di 100 μM, che, dopo la diluizione con siero/1x PBS, ha portato a una concentrazione di 10 μM. L'intervallo di campionamento nel metodo di incubazione del siero è stato aggiustato perché la HsKYNasi perde attività più velocemente nel siero che nella HsADA1. Pertanto, il metodo includeva il campionamento a punti temporali di 0,5 ore, 3 ore e 24 ore. Inoltre, i campioni di HsKYNasi non sono stati congelati flash, ma sono stati immediatamente analizzati utilizzando il test su micropiastra. Il lettore di piastre è stato configurato per leggere a 379 nm per monitorare l'andamento della reazione enzimatica. Un'altra importante differenza nel saggio basato su micropiastra quando si studia l'enzima HsKYNasi è la preparazione del substrato. Una riserva da 2 mM di OH-Kyn è stata prodotta sciogliendo 4,5 mg di OH-Kyn in 10 mL di 1x PBS. Allo stesso tempo, 6 mg di piridossale fosfato (PLP), il cofattore HsKYNasi, sono stati disciolti in 1 mL di 1x PBS per ottenere una riserva 100x di PLP. È stata preparata una diluizione di 500 μM di OH-Kyn aggiungendo 2,5 mL di stock OH-Kyn a 7,5 mL di 1x PBS e 100 μL di stock 100x PLP. Per eseguire il saggio su micropiastra, 80 μL della diluizione OH-Kyn da 500 μM e 20 μL dei campioni proteici aliquotati o dei controlli negativi sono stati aggiunti in triplicato a una micropiastra compatibile con i raggi UV a 96 pozzetti. Ciò ha prodotto una concentrazione finale di OH-Kyn di 400 μM e una concentrazione enzimatica finale di 2 μM, dopodiché l'assorbanza a 379 nm è stata misurata per 30 minuti a 37 °C. A differenza di HsADA1, che è stato diluito prima di essere analizzato sul lettore di piastre, HsKYNase non è stato diluito.

Sebbene questo protocollo sia relativamente semplice, una potenziale sfida potrebbe risiedere nella preparazione degli stock enzimatici originali. Tutti gli enzimi utilizzati nella sezione dei risultati rappresentativi sono stati espressi in E. coli e purificati mediante cromatografia di affinità a base di nichel seguita da cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC). Diverse altre fonti hanno sapientemente descritto alternative al nostro metodo di purificazione, che abbracciano gli organismi ospiti e il trattamento a valle^19,20. Questo test cerca fondamentalmente di determinare la capacità di un enzima di mantenere la sua attività nel siero umano aggregato. Un presupposto della nostra metodologia è che la perdita di attività di un enzima sia permanente, cioè la rimozione di un enzima disattivato dal siero non ripristinerà la sua attività. Questo è significativo perché, in questo protocollo, diluiamo ulteriormente le miscele enzimatiche con glicerolo e 1x PBS prima del congelamento rapido e dopo lo scongelamento. Se questa perdita di attività è reversibile dopo la rimozione del siero, queste diluizioni aggiuntive impediranno al test di catturare questo fenomeno. Se questo è un problema per l'utente, allora 1.) il siero umano aggregato può essere utilizzato come diluente al posto di 1x PBS nella preparazione di tutte le soluzioni di substrato e campioni di prova e 2.) Il congelamento rapido e l'aggiunta di glicerolo possono essere saltati e i campioni possono essere immediatamente elaborati per mantenere l'enzima nel suo ambiente originale. Infine, mentre questo test può essere utilizzato per sondare gli effetti specifici del siero sull'attività enzimatica, non è possibile trarre conclusioni in merito al meccanismo specifico alla base di tali effetti. Se questa perdita di attività sia causata dal dispiegamento dell'enzima, dall'aggregazione, dalla perdita di cofattore o dalla scissione da parte delle proteasi sieriche richiederebbe ulteriori indagini. Qualifiche simili si possono dire dell'enzima incubato 1x PBS in quanto da questo test non possono essere derivate conclusioni meccanicistiche.

Nel contesto dello sviluppo di farmaci biologici proteici come terapie, la capacità di mantenere l'attività nel siero è una metrica importante²¹. Un enzima terapeutico che perde la sua attività molto rapidamente dovrebbe essere dosato ripetutamente per ottenere un beneficio clinico. Questo lavoro fornisce agli utenti un test in vitro per lo screening quantitativo degli enzimi per una maggiore stabilità del siero. Se abbinati a sforzi di evoluzione diretta, gli enzimi con una stabilità sierica superiore potrebbero essere selezionati e selezionati, offrendo un maggiore potenziale di traducibilità. Inoltre, prevediamo che questo protocollo possa funzionare anche con sistemi più avanzati, ad esempio per misurare la stabilità del siero dove l'enzima è incapsulato. Das et al. hanno applicato un test per diversi enzimi confezionati in particelle simili a virus e hanno testato la loro stabilità in diverse condizioni di denaturazione, come i solventi organici²².

JB e MRJ sono inventori di brevetti o domande di brevetto relative agli enzimi adenosina deaminasi e/o chinureninasi. Tutti gli altri autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health [1DP2CA280622-01] e finanziato da Biolocity. Ringraziamo la Dott.ssa Maria Jennings e Andrea Fox per aver fornito i vettori di espressione di HsADA1 e HsKYNase.