Manipolazione del tuina per ridurre l'infiammazione e la perdita di cartilagine nei ratti affetti da osteoartrite del ginocchio

Presentiamo un protocollo per la manipolazione del Tuina eseguito su ratti affetti da osteoartrite del ginocchio indotta da gesso. Sulla base dei risultati preliminari, ha suggerito che l'efficacia del metodo si basava sulla riduzione dell'infiammazione e della perdita di cartilagine.

Gli studi clinici suggeriscono che la manipolazione del Tuina è efficace nel trattamento dell'osteoartrite del ginocchio (KOA), mentre sono necessari ulteriori studi per scoprirne il meccanismo. Pertanto, la manipolazione di modelli animali di osteoartrosi del ginocchio è fondamentale. Questo protocollo fornisce un processo standard per la manipolazione di Tuina su ratti KOA e un'esplorazione preliminare del meccanismo di Tuina per KOA. Il metodo di manipolazione della pressione e dell'impastamento (un tipo di manipolazione Tuina che si riferisce alla pressione e all'impastamento dell'area specifica della superficie corporea) viene applicato su 5 agopunti intorno all'articolazione del ginocchio dei ratti. La forza e la frequenza della manipolazione sono state standardizzate mediante registrazioni della pressione delle dita e la posizione del ratto durante la manipolazione è descritta in dettaglio nel protocollo. L'effetto della manipolazione può essere misurato mediante test di comportamento al dolore e reperti microscopici nella sinovia e nella cartilagine. I ratti KOA hanno mostrato un miglioramento significativo nel comportamento del dolore. L'infiltrazione infiammatoria del tessuto sinoviale è stata ridotta nel gruppo Tuina e l'espressione del fattore di necrosi tumorale (TNF)-α è risultata significativamente inferiore. Rispetto al gruppo di controllo, l'apoptosi dei condrociti era inferiore nel gruppo Tuina. Questo studio fornisce un protocollo standardizzato per la manipolazione di Tuina su ratti KOA e la prova preliminare che gli effetti terapeutici di Tuina possono essere correlati alla riduzione dell'infiammazione sinoviale e all'apoptosi ritardata dei condrociti.

L'artrosi del ginocchio (KOA) è una malattia degenerativa che si manifesta principalmente con dolori articolari. Fibrosi, screpolature, ulcerazioni e perdita di cartilagine articolare sono le cause principali di questa malattia¹. La KOA ha un'alta prevalenza e può avere un profondo impatto sulla vita quotidiana dei pazienti, causando disabilità nei casi più gravi. Tra le persone di età compresa tra 45 e 84 anni, la prevalenza di KOA aumenta con l'età e la prevalenza tra le persone di età pari o superiore a 85 anni è del 15%, con una predominanza nelle donne ^2,3. Inoltre, il KOA potrebbe comportare un grave onere economico sia per l'individuo che per la società. Un'indagine ha mostrato che i costi diretti dell'assistenza sanitaria su KOA pro capite hanno raggiunto fino a $ 8.858 ± $ 5.120 all'anno⁴. Con l'invecchiamento della società, il KOA è diventato un problema sanitario mondiale e un importante problema sociale, nonché un tema di attualità per la ricerca scientifica.

Studi basati sull'evidenza hanno dimostrato l'efficacia della manipolazione Tuina nel trattamento di KOA⁵. La manipolazione del tuina potrebbe alleviare il dolore e migliorare la disfunzione nei pazienti con KOA, il cui meccanismo è correlato agli effetti antinfiammatori ^6,7. Gli studiosi hanno scoperto che la manipolazione del Tuina ha inibito efficacemente l'espressione dei fattori infiammatori interleuchina (IL)-β e 5-idrossitriptamina e ha rallentato la degenerazione della cartilagine articolare in un modello^{KOA 8} di coniglio. Ha suggerito che Tuina potrebbe promuovere la circolazione sanguigna e il metabolismo nel sito della lesione, il che ha contribuito a eliminare i fattori infiammatori come IL-1, IL-6 e il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, alleviando così i sintomi clinici di KOA⁹. Inoltre, il movimento passivo dell'articolazione attraverso la manipolazione del Tuina può promuovere la penetrazione e la diffusione del liquido sinoviale nella cartilagine articolare e migliorare il metabolismo dei nutrienti tissutali¹⁰. Altri studi hanno suggerito che la manipolazione di Tuina può migliorare efficacemente gli indici biomeccanici nei pazienti con KOA¹¹. Le manipolazioni applicate sui tessuti molli possono migliorare la distribuzione dello stress sugli arti e migliorare la funzione di equilibrio^12,13. Allo stesso tempo, con alcune manipolazioni di regolazione articolare, anche l'allineamento degli arti inferiori può essere regolato per correggere andature anomale^14,15.

Il meccanismo d'azione della manipolazione Tuina nel trattamento della KOA rimane da esplorare, e quindi è necessario uno studio sperimentale. La chiave per l'applicazione del Tuina negli animali da esperimento è la standardizzazione della modellizzazione, della fissazione animale e dei metodi di intervento¹⁶. Il metodo di modellazione determina se l'animale da esperimento può presentare le caratteristiche della malattia. Nel frattempo, metodi di fissazione appropriati possono facilitare l'intervento della manipolazione del Tuina e riflettere meglio l'effetto del Tuina. La standardizzazione dei metodi di intervento è la parte più difficile della manipolazione Tuina. Nel 2010, il sistema di base degli standard cinesi di agopuntura ha menzionato gli standard dei punti di agopuntura per gli animali da esperimento, fornendo la possibilità di operazioni di agopuntura e Tuina negli esperimenti sugli animali¹⁷. Tuttavia, ci sono ancora difficoltà nella standardizzazione della manipolazione Tuina. Esistono diversi tipi di manipolazione Tuina¹⁸. La scelta della manipolazione specifica dipende principalmente dalla malattia da trattare e dalle teorie terapeutiche che l'esecutore preferisce. Nello studio di Tuina per KOA, è stata prestata maggiore attenzione alla manipolazione della pressione dei punti (premendo i punti di agopuntura specifici con il pollice o il gomito), alla manipolazione della spinta Yizhichan (una manipolazione della spinta muovendo il pollice) e alla manipolazione della pressione e dell'impastamento (che si riferisce alla pressione e all'impastamento dell'area specifica della superficie corporea con il dito o il palmo)¹⁹. La manipolazione della pressa e dell'impastamento è una delle manipolazioni Tuina più utilizzate, che combina la pressatura e l'impastamento per spostare il tessuto sottocutaneo²⁰. La manipolazione della pressa e dell'impastamento applicata sui punti di agopuntura può favorire la circolazione sanguigna e alleviare il dolore e rappresenta l'effetto terapeutico di Tuina su KOA¹⁹.

In questo protocollo, il funzionamento della manipolazione della pressa e dell'impastamento sui ratti KOA sarà descritto in dettaglio, compresi i punti di agopuntura selezionati, l'intensità e la frequenza della manipolazione e la posizione del corpo del ratto, in modo da fornire un riferimento per la ricerca futura.

Questo studio ha superato la revisione dell'etica animale condotta dal comitato etico degli animali sperimentali dell'ospedale Yueyang di medicina tradizionale cinese e occidentale integrata affiliato all'Università di medicina tradizionale cinese di Shanghai (YYLAC-2022-166).

1. Preparazione e raggruppamento di animali da esperimento

1. Preparazione degli animali
   1. Allevare un totale di 10 ratti femmine sani SPF SD di 200-220 g a temperatura ambiente (18-21 °C), umidità 40%-50%, 12 h: 12 h alternanze del ritmo circadiano. Condurre esperimenti sugli animali legati al dolore nel rigoroso rispetto delle disposizioni pertinenti delle linee guida e delle linee guida etiche sugli animali.
2. Raggruppamento di animali
   1. Dividi in modo casuale i ratti nel gruppo Tuina e nel gruppo di controllo. Trattare i ratti del gruppo Tuina con la pressione e la manipolazione dell'impasto per 21 giorni dopo la modellazione. Mettere i ratti del gruppo di controllo nella stessa stanza Tuina e metterli in un sacchetto di stoffa nera contemporaneamente mentre il gruppo Tuina è sottoposto a trattamento.

2. Modellazione di animali

1. Anestetizzare l'animale
   1. Utilizzare l'isoflurano per l'anestesia gassosa. Metti il ratto nella scatola di induzione con una concentrazione di induzione del 3%. Far oscillare la scatola dopo aver adagiato il ratto e confermare l'anestesia quando il ratto si ribalta senza alcun tentativo di tornare in posizione prona.
   2. Rimuovere il ratto dalla scatola di induzione e fissare il naso nella maschera anestetica. Regolare la concentrazione di isoflurano al 2% per mantenere l'anestesia. Confermare l'anestesia quando il ratto non risponde quando si pizzica le zampe. Applicare un unguento per gli occhi sui ratti per prevenire la secchezza quando i ratti vengono anestetizzati poiché le palpebre non possono essere chiuse.
2. Metodo di modellazione²¹
   1. Utilizzare la macchina da barba per rimuovere i peli dell'arto posteriore destro. Posiziona un batuffolo di cotone medico tra la caviglia destra e l'articolazione dell'anca del ratto. Fissare l'articolazione del ginocchio destro all'estensione di 180° con 5-6 strati di bendaggio in gesso bagnato in modo uniforme. Avvolgere a spirale la benda in gesso partendo dalla caviglia e coprendo 1/3 della precedente. Usa un asciugacapelli per asciugare e indurire l'intonaco.
   2. Avvolgere esternamente il cerotto con il materiale di base della protesi dopo che la benda in gesso si è asciugata e indurita per fissare il gesso ed evitare che rosicchia.
   3. Mescolare i materiali di base della protesi per renderla appiccicosa e far aderire la miscela all'esterno del cerotto (la miscela non deve superare il bordo della benda, Figura 1). Dopo che la miscela diventa dura, spegnere la macchina per anestesia e attendere che l'animale si svegli naturalmente. Sorvegliare i ratti per prevenire incidenti di anestesia prima che i ratti si sveglino.
   4. Fissare il cerotto in modo appropriato sull'arto posteriore destro del ratto, poiché una fissazione stretta limita la circolazione sanguigna, mentre una fissazione allentata tende a cadere. Osservare la circolazione sanguigna nell'arto terminale. Se viene rilevato gonfiore dell'estremità terminale o una carnagione violacea, tagliare prontamente parte del cerotto per aiutare a ripristinare la circolazione. Rifare il cerotto se è rotto e non riesce a mantenere l'estensione dell'arto inferiore.
   5. Rimuovere il cerotto dopo 3 settimane di immobilizzazione continua. Utilizzare le forbici chirurgiche per tagliare il materiale di base della protesi all'esterno e la benda in gesso. Sciacquare l'arto inferiore del ratto con soluzione fisiologica e asciugarlo con una garza. Se ci sono lesioni cutanee locali, sterilizzare con iodoforo.
3. Verifica del modello²²
   1. Verifica basata sui raggi X
      1. Eseguire un esame radiografico del ginocchio destro 1 giorno dopo la fine della modellazione. Eseguire radiografie anteroposteriori in posizione supina con flessione dell'anca a 30°, estensione del ginocchio a 0° e abduzione dell'anca a 15°. Tenere la rotula direttamente davanti al ginocchio e posizionare il tubo del radiatore a 110 mm dall'articolazione del ginocchio.
      2. Eseguire radiografie laterali in posizione di decubito laterale destro con flessione dell'anca destra a 30° ed estensione del ginocchio destro a 0°. Eseguire la flessione dell'anca dell'arto sinistro a 70° e la flessione del ginocchio a 45° e posizionare il tubo del radiatore a 110 mm di distanza dall'articolazione del ginocchio. Impostare i parametri di rilevamento come tensione di esposizione 50 kV, corrente 250 mA, dose di esposizione 32 mAs e tempo di esposizione 128 ms.
      3. Confrontando con la radiografia dei ratti normali, verificare che la radiografia del ginocchio modellata mostri uno spazio articolare più stretto con iperplasia osteofita sul bordo.
   2. Osteoarthritis Research Society International (OARSI) con punteggio^{di 23}
      1. Metti il ratto nella scatola per l'eutanasia e perfuse CO₂ al ritmo del 30%-70% del volume della gabbia al minuto. Interrompere la perfusione di CO₂ dopo aver rilevato che il ratto è immobile, non respira e che la pupilla è dilatata. Osservare per altri 2 minuti per confermare la morte.
         NOTA: La lussazione cervicale può essere eseguita dopo l'eutanasia basata su CO₂ come forma secondaria per confermare la morte. Fissa il topo sul tavolo e afferra la sua coda con una mano. Premere sulla testa del ratto con il pollice e l'indice dell'altra mano. Conferma la morte quando senti il suono di uno schiocco e il ratto perde il movimento e il battito cardiaco allo stesso tempo.
      2. Fissare il ratto in posizione supina con l'ago di una siringa su una tavola di gommapiuma con l'arto posteriore destro flesso in abduzione e rotazione esterna. Pizzica la pelle intorno all'articolazione del ginocchio con le forbici chirurgiche. Esporre i muscoli intorno all'articolazione del ginocchio tagliando la pelle e poi tagliando la fascia sottocutanea.
      3. Tagliare la diafisi del femore e della tibia con le forbici ossee e rimuovere l'articolazione del ginocchio destro. Rimuovere delicatamente i tessuti molli in eccesso, come muscoli e legamenti, al di fuori dell'articolazione.
      4. Fissare il giunto in paraformaldeide al 4% per 24-48 h a 4 °C. Decalcificare l'articolazione in una soluzione di acido formico al 10% per 3 giorni fino a quando il tessuto osseo può essere facilmente punzecchiato con un ago.
      5. Posizionare e tagliare il tessuto decalcificato nella cappa aspirante e trasferirlo in una scatola di disidratazione nella macchina di disidratazione. Aggiungere etanolo al 75% per 4 ore, poi etanolo al 90% per 2 ore, seguito da etanolo al 95% per 1 ora, etanolo assoluto per 30 min, un altro giro di etanolo assoluto fresco per 30 min, alcol benzene per 5-10 min, xilene per 5-10 min, un altro giro di xilene fresco per 5-10 min, cera per 1 h, un altro giro di cera fresca per 1 h, e giro finale di cera fresca per 1 h per la disidratazione e l'immersione in cera trasparente.
      6. Quindi, posizionare il tessuto nella macchina per l'inclusione. Tagliare il blocco di cera in fette di cera di 4 μm dopo che la paraffina si è solidificata e appiattire la fetta in acqua tiepida. Mettere la fetta su un vetrino e asciugarla. Conservare a temperatura ambiente.
      7. Osservare il campione di cartilagine e assegnargli un punteggio in base alla valutazione del grado di istopatologia della cartilagine OA (Tabella 1)²³. Se il punteggio dei ratti dopo la modellazione è significativamente più alto di quello dei ratti normali, la modellazione ha avuto successo.

Tabella 1. Valutazione del grado istopatologico della cartilagine OA. Il grado è la progressione in profondità nella cartilagine. Punteggio totale = Grado x Messa in scena. 0 per le articolazioni normali, 24 per l'artrite grave. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura 1. Ratti immobilizzati nel gesso. Dopo che i ratti sono stati anestetizzati i loro arti inferiori destri sono stati avvolti con bende di gesso, fissati in posizione iperestesa e coperti con uno strato di materiali di base per protesi all'esterno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Manipolazione Tuina

1. Campo di applicazione
   1. Selezionare un totale di 5 agopunti sull'arto posteriore destro dei ratti, tra cui ST34, ST35, SP10, EX-LE4 e BL40 (Figura 2). Individuare i punti di agopuntura secondo i principi del posizionamento dei punti di agopuntura in ²⁴.
2. Posizione per l'applicazione
   1. Tagliare un panno nero in un sacchetto di 9 cm x 15 cm con un'apertura laterale e serrare l'apertura con una corda. Prima della manipolazione del Tuina, tira delicatamente la coda del ratto per farlo scavare nel sacco ed esporre gli arti posteriori al di fuori del sacco.
   2. Usa una mano per mantenere il ratto in posizione prona, tenendogli la coda e la zampa posteriore, mentre l'altra mano applica la pressione e la manipolazione dell'impasto su un punto di agopuntura specifico (Figura 3).
3. Manipolazione Tuina
   1. Azionare la pressione e la manipolazione dell'impasto sui 5 agopunti dell'arto posteriore destro per 2 minuti ciascuno. Posizionare il pollice dell'esecutore sul punto di agopuntura selezionato per eseguire la pressione ritmica e l'impastamento, guidando la pelle e il tessuto sottocutaneo insieme in un movimento circolare.
   2. Utilizzare le registrazioni della pressione delle dita (unità in Newton) per garantire un'intensità e una frequenza costanti della manipolazione. Mantenere l'intensità tra 3-5 N e la frequenza a 2 Hz (Figura 4). Applicare la manipolazione una volta al giorno per 21 giorni.

Figura 2. Posizione dei punti di agopuntura. SP10 si trova 5 mm sopra l'articolazione interna del ginocchio nei ratti. ST34 si trova 5 mm sopra l'articolazione esterna del ginocchio nei ratti. EX-LE4 si trova nella parte mediale del legamento del ginocchio nei ratti. ST35 si trova nella parte laterale del legamento del ginocchio nei ratti. BL40 si trova nel punto medio della striscia poplitea trasversale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Manipolazione Tuina applicata sui ratti. I ratti erano tenuti in un sacco nero con gli arti posteriori scoperti. L'esecutore teneva la coda del topo con la mano sinistra mentre la mano destra eseguiva la manipolazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Registrazioni della pressione delle dita. Un dispositivo che registra la forza e la frequenza della pressione delle dita viene utilizzato per un feedback in tempo reale sull'intensità e la frequenza nel processo di manipolazione del Tuina. (A) Sensore di pressione e apparecchiature di trasmissione. (B) Registrazioni della pressione delle dita. (C) La forza registrata durante la manipolazione Tuina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Test di comportamento al dolore

1. Testare il comportamento del dolore prima e dopo la modellazione, e a 1 giorno dopo (D1), 7 giorni dopo (D7), 14 giorni dopo (D14) e 21 giorni dopo (D21) la manipolazione Tuina, inclusi i test di soglia di ritiro meccanico e di latenza di ritiro della zampa.
2. Soglia di prelievo meccanico (MWT)
   1. Posiziona i ratti in un cubicolo di vetro temperato trasparente di 20 cm x 10 cm x 20 cm situato su un palco alto 40 cm costituito da un reticolo di filo con una dimensione di 10 mm x 10 mm di apertura. Mantenere la temperatura ambiente a 23 °C ± 2 °C.
   2. Sistemare i ratti nel laboratorio comportamentale per almeno 2 ore al giorno durante la fase di test comportamentale per evitare interferenze con i risultati del test a causa della mancanza di adattamento degli animali all'ambiente all'inizio del test formale. Posizionare i ratti nel laboratorio comportamentale per 30 minuti prima dell'inizio del test formale per facilitare il loro adattamento all'ambiente e ridurre i fattori di distrazione.
   3. Utilizzare fibre elettroniche di Von Frey per misurare l'MWT. Stimola il ratto con la fibra al centro del piede e ritira la fibra quando il ratto mostra movimenti evidenti come alzare la zampa ed evitare. La macchina può registrare automaticamente il valore di pressione massima (N) in questo momento.
   4. Iniziare la stimolazione successiva nello stesso ratto almeno 15 s dopo la stimolazione in corso. Non superare i 5 s durante ogni stimolazione per prevenire la sensibilizzazione agli stimoli tattili nelle zampe dei ratti. Ripetere il test 5 volte fino a quando la differenza tra le tre misurazioni consecutive è insignificante (entro 10 N).
   5. Cancellare i valori con grandi differenze (il massimo e il minimo) e prendere la media dei restanti tre valori come soglia di prelievo meccanico.
3. Latenza di prelievo della zampa (PWL)
   1. Metti i ratti in un piccolo scomparto di vetro temperato trasparente delle dimensioni di 20 cm x 10 cm x 20 cm. Coprire la parte superiore dello scomparto con un coperchio in vetro trasparente con fori di ventilazione. Mantenere la temperatura della lastra di vetro trasparente a 28-30 °C, su cui è posto il vano.
   2. Sistemare i ratti in questo ambiente per almeno 30 minuti per acclimatarsi prima dell'inizio di ogni test formale. Se i ratti urinano o defecano nello scomparto, pulirlo con carta assorbente in tempo per evitare di compromettere il successivo trasferimento di calore della radiazione luminosa.
   3. Puntare il riflettore sul centro della zampa del topo e premere il pulsante Start . Premi il pulsante Stop quando il ratto mostra comportamenti evidenti come la retrazione del piede o il leccamento delle zampe e registra l'ora a questo punto. Il tempo di irradiazione del riflettore non deve superare i 20 s per evitare danni alla pelle del ratto.
   4. Eseguire l'irradiazione successiva sullo stesso ratto dopo almeno 10 minuti per prevenire la sensibilizzazione. Misura 5 volte su ogni ratto.
   5. Rimuovere i valori con grandi differenze (il valore massimo e il valore minimo). Prendi la media dei valori rimanenti come PWL.

5. Preparazione del campione

1. Eseguire l'eutanasia sul topo come descritto in 2.3.2.1.
2. Preparazione della membrana sinoviale
   1. Fissare il ratto in posizione supina con l'ago di una siringa su una tavola di gommapiuma con l'arto posteriore destro flesso nell'abduzione e nella rotazione esterna. Pizzica la pelle intorno all'articolazione del ginocchio con le forbici chirurgiche ed esponi i muscoli intorno all'articolazione del ginocchio dei ratti tagliando la pelle e poi tagliando la fascia sottocutanea.
   2. Prendi il legamento rotuleo come punto di riferimento per rimuovere i gruppi muscolari sopra il legamento rotuleo. Incidere con cura l'estremità del legamento rotuleo (in corrispondenza della tuberosità tibiale) e trovare la membrana sinoviale quando il legamento viene pizzicato verso l'alto dal basso.
   3. Tagliare con cura il tessuto sinoviale con forbici oftalmiche e lavare via il sangue e il liquido sinoviale con soluzione fisiologica preraffreddata. Fissare la membrana sinoviale in paraformaldeide al 4% per almeno 48 ore dopo aver assorbito l'acqua dalla superficie del tessuto con una garza pulita.
   4. Preparare il campione come indicato nei punti da 2.3.2.5 a 2.3.2.6. Eseguire l'assegnazione dei punteggi come nel passaggio 2.3.2.7.
3. Esecuzione della colorazione con ematossilina ed eosina
   1. Decerare in acqua con xilene per 20 minuti, sostituire con un altro giro di xilene fresco per 20 minuti, quindi trattare con etanolo anidro per 5 minuti, sostituire con un altro giro di etanolo anidro fresco per 5 minuti, quindi aggiungere etanolo al 90% in volume per 5 minuti, etanolo all'80% in volume per 5 minuti, etanolo al 70% in volume per 5 minuti, etanolo al 70% in volume per 5 minuti, e infine acqua distillata per 5 min.
   2. Immergere il vetrino in una soluzione colorante con ematossilina per 3-8 minuti. Rimuovere il vetrino e risciacquare la macchia con acqua distillata. Spostarlo nel fluido di differenziazione (alcol acido cloridrico all'1%) per quasi 30 s, in modo che il vetrino sbiadisca in blu pallido. Sciacquare con acqua distillata e immergerlo in una soluzione colorante di eosina per 1-3 minuti.
   3. Disidratare il vetrino con una frazione volumetrica di etanolo al 95% per 5 minuti, sostituirlo con un altro ciclo di etanolo fresco al 95% per 5 minuti, seguito da etanolo anidro per 5 minuti, sostituire con un altro ciclo di etanolo anidro fresco per 5 minuti.
   4. Rendi trasparente il vetrino aggiungendo xilene per 5 minuti, sostituiscilo con un altro giro di xilene fresco per 5 minuti, quindi sigillalo con resina neutra.
4. Marcatura terminale-deossinucleotidiltransferasi-mediata da nick end (TUNEL) sulla cartilagine
   1. Disidratare il campione di cartilagine in etanolo anidro, etanolo al 90%, etanolo all'85% ed etanolo al 75% fino al completamento dell'idratazione della deparaffinazione. Immergere in PBS per 5 min. Aggiungere il 3%di H 2 O₂ goccia a goccia per 10 min.
   2. Aggiungere la soluzione di lavoro della proteinasi K goccia a goccia e digerire a 37 °C per 10 min. Aggiungere 20 μL di tampone di etichettatura per fetta per mantenerla umida e scuotere il liquido in eccesso dopo aver preparato la soluzione di lavoro. Aggiungere 20 μL di soluzione di lavoro a ciascun vetrino e incubare per 2 ore a 37 °C in una scatola umida.
   3. Aggiungere 50 μL della soluzione di chiusura goccia a goccia e chiudere per 30 min. Aggiungere quindi 50 μL di anticorpo anti-digossina biotinilato diluito (diluizione 1:100) goccia a goccia e incubare a 37 °C per 2 ore in una scatola umida. Aggiungere 10 μL di diluente per anticorpi SABC (diluizione 1:100) goccia a goccia e incubare a 37 °C per 2 ore in una scatola umida.
   4. Aggiungere la soluzione di sviluppo del colore DAB (50 μL ciascuno dei reagenti A, B e C in 1000 μL di acqua distillata) goccia a goccia per 10-15 minuti. Lo sviluppo del colore si completa quando è granulare giallo-brunastro.
   5. Ripetere la colorazione con ematossilina per 3 s. Dopo la disidratazione a gradiente e il trattamento trasparente, asciugare a temperatura ambiente e sigillare accuratamente il vetrino con gomma neutra. Prestare attenzione per evitare di lasciare bolle e colla traboccante.
5. Analisi immunoistochimica di IL-1β e TNF-α
   1. Decerare regolarmente i vetrini in xilene e idratarli in alcool a gradiente. Inattivare la perossidasi endogena nelle sezioni con il 3% di H2 O₂ . Porre il portavetrini in un tampone citrato a 95 °C (pH 6,0) e incubare a bagnomaria a una temperatura superiore a 95 °C per oltre 20 minuti. Estrarre la scatola di incubazione e lasciarla a temperatura ambiente per almeno 20 min.
   2. Incubare il siero di capra normale al 5% con PBS per 10 minuti a 37 °C e scuotere il liquido in eccesso. Aggiungere 150 μL di anticorpo I goccia a goccia e lasciare riposare a 37 °C per 1 ora, quindi conservare per una notte a 4 °C. Il giorno successivo, riscaldare a 37 °C per 45 min.
   3. Lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuna. Coprire il tessuto sul vetrino con BSA al 3% e sigillarlo a 37 °C per 30 min. Aggiungere 150 μL di anticorpo II goccia a goccia e lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno e aggiungere 150 pL di liquido di sviluppo del colore DAB goccia a goccia. Osservare il grado di colorazione al microscopio fino a quando il campione diventa giallo-brunastro anche ad occhio nudo.
   4. Risciacquare immediatamente con PBS per 10 min. Colorare nuovamente con ematossilina, disidratare in alcool gradiente, rendere trasparenti i vetrini in xilene e sigillare con gomma neutra.
6. Analisi statistica
   1. Le sezioni colorate immunoistochimicamente con espressione positiva della proteina associata sono gialle o giallo-brunastre. Assegnare un punteggio all'intensità dell'espressione positiva mediante il software Image J per ciascun gruppo di sezioni immunoistochimiche e utilizzare i criteri di valutazione della densità ottica media (AOD), calcolata per IOD divisa per area.
   2. Utilizzare un software di analisi per l'analisi statistica. Utilizzare il test t se i dati sono conformi alla distribuzione normale e al chi-quadrato e utilizzare il test non parametrico se non sono conformi alla distribuzione normale. Analizza i dati di misurazione ripetuti mediante equazioni di stima generalizzate.

Test di comportamento al dolore
I risultati dell'MWT hanno mostrato che l'MWT dell'arto posteriore destro dopo la modellazione era significativamente inferiore rispetto a prima (p<0,05). Rispetto al gruppo di controllo, il MWT dei ratti è stato significativamente elevato dopo Tuina (p<0,05; Figura 5 e Tabella 2).

Figura 5. Risultati della prova meccanica della soglia di prelievo (, Newton). C'erano 5 ratti ciascuno nel gruppo Tuina e nel gruppo di controllo. Il MWT dei ratti in diversi punti temporali è mostrato nella figura. Dopo la modellazione, il MWT dei ratti è diminuito in modo significativo, suggerendo che il dolore dei ratti è stato aggravato e il modello KOA è stato preparato con successo. Successivamente, l'MWT è gradualmente migliorato, suggerendo sollievo dal dolore. L'equazione di stima generalizzata è stata utilizzata per il calcolo statistico. La differenza di MWT tra il gruppo Tuina e il gruppo di controllo è risultata statisticamente significativa al giorno 21 rispetto a quella dopo la modellazione. Il confronto tra i due gruppi è stato statisticamente significativo a D7, D14 e D21, *p<0,05. Inoltre, i ratti del gruppo Tuina hanno un MWT più elevato rispetto a quello del gruppo di controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 2. Soglia di prelievo meccanico ( , N). Confronto prima e dopo la modellazione, ^#p<0.05. Confronto tra il gruppo Tuina e il gruppo di controllo, *p<0.05. Clicca qui per scaricare questa tabella.

I risultati del PWL hanno mostrato che il PWL dell'arto posteriore destro dopo la modellazione era significativamente più corto di prima (p<0,05). Rispetto al gruppo di controllo, l'MWT dei ratti è stato significativamente prolungato dopo Tuina (p<0,001; Figura 6 e Tabella 3).

Figura 6. Risultati del test di latenza di astinenza della zampa (, secondo). C'erano 5 ratti ciascuno nel gruppo Tuina e nel gruppo di controllo. Il PWL dei ratti in diversi punti temporali è mostrato nella figura. Dopo la modellazione, il PWL dei ratti è diminuito in modo significativo, suggerendo che il dolore dei ratti è stato aggravato e il modello KOA è stato preparato con successo. All'inizio, il miglioramento della PWT nel gruppo Tuina è stato più lento di quello nel gruppo di controllo. Dopo D7, i ratti del gruppo Tuina sono migliorati rapidamente e hanno superato il gruppo di controllo a D21. L'equazione di stima generalizzata è stata utilizzata per il calcolo statistico. La differenza di MWT tra il gruppo Tuina e il gruppo di controllo è risultata statisticamente significativa al giorno 21 rispetto a quella dopo la modellazione. Il confronto tra i due gruppi è stato statisticamente significativo a D7, D14 e D21, ***p<0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 3. Latenza di prelievo della zampa (, s). Confronto prima e dopo la modellazione, ^#p<0.05. Confronto tra il gruppo Tuina e il gruppo di controllo, ***p<0,001. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Test istomorfologico
Dopo aver analizzato la membrana sinoviale nel gruppo di controllo, sono state osservate infiltrazione di cellule infiammatorie e iperplasia del tessuto fibroso nel tessuto sinoviale. Le cellule sinoviali erano disorganizzate e una piccola quantità di iperplasia capillare è stata osservata intorno al tessuto sinoviale (Figura 7).

Figura 7. Osservazione microscopica del tessuto sinoviale. (A) Tessuto sinoviale nel gruppo di controllo. La disposizione disorganizzata delle cellule sinoviali è visibile nella figura. I vasi proliferanti sono contrassegnati da frecce rosse e le cellule infiammatorie sono contrassegnate da frecce nere. (B) Tessuto sinoviale nel gruppo Tuina. Le cellule sinoviali erano disposte in modo più ordinato. Le cellule infiammatorie sono distribuite principalmente ai bordi piuttosto che infiltrarsi verso l'interno. I vasi proliferanti sono contrassegnati da frecce rosse e le cellule infiammatorie sono contrassegnate da frecce nere. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nel gruppo Tuina, le cellule sinoviali erano disposte in modo ordinato, con una piccola quantità di infiltrazione di cellule infiammatorie, iperplasia del tessuto fibroso e una piccola quantità di iperplasia capillare visibile ai margini del tessuto.

Dopo aver analizzato la cartilagine, si è visto che l'area positiva alla colorazione TUNEL nel gruppo Tuina era significativamente più piccola di quella nel gruppo di controllo, indicando che c'erano meno condrociti apoptotici nel gruppo Tuina (Figura 8).

Figura 8. Colorazione TUNEL della cartilagine. (A) Cartilagine nel gruppo di controllo. La parte rossa della figura è l'area positiva della colorazione TUNEL. (B) Cartilagine nel gruppo Tuina. La parte rossa della figura è l'area positiva della colorazione TUNEL. L'area positiva nel gruppo Tuina è significativamente più piccola di quella nel gruppo di controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Immunoistochimica
Per il TNF-α, c'era una differenza significativa nell'espressione sinoviale di TNF-α tra i due gruppi e l'espressione nel gruppo Tuina era significativamente inferiore a quella nel gruppo di controllo (Tabella 4).

Tabella 4. Espressione di TNF-α in sinovia (, *^10-2). Per l'analisi statistica sono stati utilizzati due t-test a campione indipendenti, *p<0.05. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Per IL-1β, non c'è stata alcuna differenza significativa nella quantità di espressione sinoviale di IL-1β tra i due gruppi, come misurato dalle statistiche dell'immagine J. Tuttavia, il valore medio del gruppo Tuina era leggermente inferiore, indicando una minore espressione (Tabella 5).

Tabella 5. Espressione di IL-β in sinovia (, *^10-2). Per l'analisi statistica sono stati utilizzati due t-test a campione indipendenti. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Questo studio fornisce un protocollo per la manipolazione Tuina sui ratti KOA. Attraverso test di comportamento al dolore e risultati istomorfologici, ha suggerito che una tale serie di manipolazioni Tuina applicate ai ratti KOA potrebbe ridurre l'infiammazione sinoviale e l'apoptosi cartilaginea, che potrebbe essere un riferimento della manipolazione Tuina su modelli animali di KOA.

Ci sono diverse procedure critiche durante il protocollo. Innanzitutto, è importante scegliere un metodo appropriato per indurre il modello KOA. Esistono vari metodi per indurre il modello KOA, tra cui l'iniezione della cavità articolare²⁵, la chirurgia intra-articolare 26,27, il metodo di frenatura articolare^28,29, ecc. Poiché i modelli di KOA indotti da metodi invasivi lascerebbero ferite vicino alle articolazioni, che possono interferire con l'effetto della manipolazione Tuina, abbiamo scelto il metodo non invasivo di immobilizzazione articolare. Il metodo di immobilizzazione articolare può essere suddiviso in fissazione per iper-estensione e iper-flessione. Shang et al. hanno confrontato gli effetti di questi due metodi di fissazione e hanno scoperto che c'era poca differenza nell'effetto dell'apoptosi della cartilagine²³. Tuttavia, i loro soggetti sperimentali erano conigli, che sono di dimensioni maggiori e relativamente facili da riparare rispetto ai ratti. L'intonaco fisso in posizione di flessione ha maggiori probabilità di cadere sotto il rosicchiamento dei ratti. Pertanto, abbiamo scelto il metodo di immobilizzazione della fissazione dell'iperestensione per indurre KOA. Abbiamo fatto riferimento a He et al. e abbiamo usato la benda in gesso con un abbassalingua come dispositivo di fissazione³⁰. Tuttavia, la capacità di rosicchiare dei ratti era più forte del previsto e il dispositivo non poteva fungere da fissazione. Più tardi abbiamo trovato una sorta di materiale di base per protesi, che può formare un guscio modellabile ma duro all'esterno del gesso e ridurre efficacemente l'usura del dispositivo di fissaggio da parte dei ratti. Una fissazione stretta influenzerebbe la circolazione sanguigna degli arti inferiori, mentre una fissazione troppo allentata sarebbe facile da staccare. Pertanto, la circolazione degli arti inferiori dei ratti deve essere osservata quotidianamente durante le 3 settimane di modellazione. La fissazione deve essere rilasciata quando gli arti inferiori diventano gonfi e violacei. Reinstallare il fissaggio quando è allentato e i ratti possono flettere le ginocchia. Durante questo studio, i ratti non sono stati limitati dalla socializzazione durante la modellazione, ma si è scoperto che avrebbero masticato la fissazione l'uno dell'altro per aiutarsi a vicenda a liberarsi. Forse isolare i ratti avrebbe portato a una migliore modellazione. Tuttavia, l'isolamento potrebbe contribuire alla depressione e al comportamento stereotipato dei ratti.

Riteniamo che il punto chiave della manipolazione Tuina sia quello di mantenere la coerenza dell'intensità e della frequenza. Ricerche precedenti hanno concluso che l'intensità ottimale per il Tuina animale dovrebbe essere l'80% della sua intensità massima tollerabile³¹. A questo punto, i ratti dovrebbero mostrare segni di ricevere stimolazione meccanica, ma senza segni di dolore o retrazione della zampa. Abbiamo testato l'intensità massima tollerabile dei ratti, che è di circa 5-8 N. Quindi, impostiamo l'intensità di spinta a 3-5 N, il che può portare a una migliore efficacia. La frequenza della manipolazione è di 2 Hz, secondo il libro di testo di Tuina. Studi precedenti non hanno stabilito una standardizzazione per la manipolazione Tuina e l'intensità e la frequenza potrebbero variare dopo aver operato diversi punti di agopuntura e alterato la mano sinistra e destra durante l'esperimento, il che può influenzare l'accuratezza dei risultati. Le registrazioni della pressione delle dita utilizzate in questo esperimento forniscono un'osservazione in tempo reale dell'intensità e della frequenza della manipolazione durante l'esperimento, che può mantenere la coerenza della manipolazione. Alcuni studiosi usano le macchine per simulare la manipolazione Tuina e applicarla sugli animali, il che ha il vantaggio di standardizzare la manipolazione³².

Per la selezione dei punti di agopuntura, abbiamo fatto riferimento allo studio di Wang e Liu e abbiamo scelto cinque punti di agopuntura intorno all'articolazione del ginocchio per facilitare la manipolazione^33,34. Abbiamo scelto il metodo immobilizzato con gesso per indurre la KOA, che per lo più si conclude con atrofia muscolare e rigidità articolare³⁵. ST34 e ST35 appartengono al meridiano dello stomaco di Yangming del piede, che è fondamentale nel trattamento dell'atrofia (per lo più manifestata come debolezza e atrofia muscolare) nella teoria della medicina tradizionale cinese e ha una buona adattabilità per il KOA indotto dal metodo immobilizzato con gesso. EX-LE4 è un agopunto comune per il trattamento clinico della KOA, utilizzato principalmente insieme a ST35. Tan et al. hanno scoperto che l'agopuntura e la moxibustione su ST35, ST36 e EX-LE4 potrebbero ridurre l'espressione del fattore infiammatorio nella membrana sinoviale³⁶. SP10 e BL40 sono i punti di agopuntura principali del trattamento clinico di Tuina per KOA ^37,38 e SP10 è più frequentemente utilizzato nelle prescrizioni di Tuina per KOA³⁹.

Una parte difficile della manipolazione Tuina è la fissazione dei ratti. I ratti possono lottare o evitare la manipolazione, il che aumenta la difficoltà di eseguire l'esperimento. Sebbene gli immobilizzatori per ratti possano immobilizzare i ratti ed esporre i loro arti posteriori, lo sviluppo di KOA limita la flessione e l'estensione degli arti posteriori. Pertanto, l'assestamento dei ratti con immobilizzatori può portare a dolore e all'esposizione incompleta degli arti posteriori, che possono influenzare la manipolazione Tuina. Abbiamo progettato una sacca di stoffa a uscita singola in base alla preferenza del ratto per gli ambienti bui e alla sua tendenza a scavare. Chiudi il sacchetto di stoffa quando il topo entra, cioè la testa e gli arti anteriori si trovano nel sacchetto e i suoi arti posteriori sono esposti all'esterno. Questo metodo può ridurre efficacemente la lotta dei ratti e tenerli tranquilli durante il Tuina.

I risultati del pre-esperimento suggeriscono che la manipolazione di Tuina può ridurre la risposta infiammatoria del tessuto sinoviale e diminuire l'apoptosi dei condrociti, agendo così come trattamento per KOA. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per verificarlo.

Ci sono diverse lacune di questo protocollo. In primo luogo, le piccole dimensioni dei ratti rendono difficile localizzare con precisione i punti di agopuntura. Le dita dell'operatore sono troppo grandi rispetto ai punti di agopuntura dei ratti, il che può influenzare l'effetto della manipolazione Tuina. Avevamo preso in considerazione l'aggiunta di una particella di gomma di circa 2 mm di diametro sulla punta del dito per aumentare la precisione della stimolazione dei punti di agopuntura. Ma le particelle potrebbero portare a una maggiore intensità di pressione e aumentare la difficoltà nel controllare la consistenza. Inoltre, era più probabile che danneggiasse le registrazioni della pressione delle dita, quindi non abbiamo scelto questo metodo. In secondo luogo, il nostro studio ha ignorato il cambiamento dei fattori infiammatori nel liquido sinoviale e l'apoptosi dei condrociti, che potrebbe indebolire la credibilità dello studio. In futuro intensificheremo la ricerca in questo settore. In terzo luogo, la manipolazione della pressa e dell'impastamento è una delle manipolazioni Tuina e non può comprendere gli effetti del Tuina nel trattamento del KOA. Altre manipolazioni Tuina implementate negli animali devono essere ulteriormente esplorate, comprese le manipolazioni dei movimenti articolari e la manipolazione dello sfregamento. Inoltre, il controllo positivo mostrerebbe meglio l'efficacia della manipolazione, ma non è stato progettato in questo studio e lo aggiungeremo in uno studio di follow-up.

Nel complesso, questo studio fornisce un protocollo standardizzato per la manipolazione del Tuina sui ratti KOA e l'efficacia della manipolazione è stata verificata da test di comportamento al dolore e risultati microscopici. Il protocollo dimostra preliminarmente che gli effetti terapeutici di Tuina possono essere correlati alla riduzione dell'infiammazione sinoviale e all'apoptosi ritardata dei condrociti. Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare il meccanismo di Tuina per KOA.

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto di costruzione delle specialità cliniche critiche di Shanghai (numero di sovvenzione: Shslczdzk04001); il programma di vela della Commissione per la scienza e la tecnologia di Shanghai (numero di sovvenzione: 22YF1444300); Progetti all'interno del budget dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai (numero di sovvenzione: 2021LK091).