מניפולציה Tuina כדי להפחית דלקת ואובדן סחוס בחולדות osteoarthritis הברך

אנו מציגים פרוטוקול למניפולציה של Tuina המבוצעת על חולדות אוסטיאוארתריטיס ברך המושרה על ידי גבס. בהתבסס על התוצאות הראשוניות, הוא הציע כי יעילות השיטה מסתמכת על הפחתת דלקת ואובדן סחוס.

ניסויים קליניים מצביעים על כך שמניפולציה של Tuina יעילה בטיפול בדלקת מפרקים ניוונית של הברך (KOA), בעוד שנדרשים מחקרים נוספים כדי לגלות את המנגנון שלה. לכן, מניפולציה של מודלים בעלי חיים של osteoarthritis הברך הוא קריטי. פרוטוקול זה מספק תהליך סטנדרטי למניפולציה של Tuina על חולדות KOA וחקירה ראשונית של המנגנון של Tuina עבור KOA. שיטת מניפולציית הלחיצה והלישה (סוג של מניפולציה של טווינה המתייחסת ללחיצה ולישה של האזור הספציפי של משטח הגוף) מיושמת על 5 נקודות דיקור סביב מפרק הברך של חולדות. הכוח והתדירות של המניפולציה תוקנו על ידי רישומי לחץ אצבע, ומיקום החולדה במהלך המניפולציה מתואר בפירוט בפרוטוקול. השפעת המניפולציה ניתנת למדידה על ידי בדיקות התנהגות כאב וממצאים מיקרוסקופיים בסינוביאל ובסחוס. חולדות KOA הראו שיפור משמעותי בהתנהגות הכאב. ההסננה הדלקתית של הרקמה הסינוביאלית הופחתה בקבוצת טווינה, והביטוי של גורם נמק גידולי (TNF)-α היה נמוך משמעותית. בהשוואה לקבוצת הביקורת, אפופטוזיס כונדרוציטים היה פחות בקבוצת טווינה. מחקר זה מספק פרוטוקול סטנדרטי למניפולציה של Tuina על חולדות KOA והוכחה ראשונית לכך שההשפעות הטיפוליות של Tuina עשויות להיות קשורות להפחתת דלקת סינוביאלית ואפופטוזיס כונדרוציטים מאוחר.

דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA) היא מחלה ניוונית המתבטאת בעיקר בכאבי מפרקים. פיברוזיס, סדקים, כיבים ואובדן סחוס מפרקי הם הגורמים העיקריים למחלה זו¹. KOA יש שכיחות גבוהה עלולה לגרום השפעה עמוקה על חיי היומיום של החולים, גרימת נכות במקרים חמורים. בקרב אנשים בגילאי 45-84 שנים, שכיחות KOA עולה עם הגיל, והשכיחות בקרב אנשים בני 85 ומעלה היא 15%, עם דומיננטיות בקרב נשים ^2,3. בנוסף, KOA עלול להביא נטל כלכלי רציני הן על הפרט והן על החברה. סקר הראה כי עלויות הבריאות הישירות על KOA לנפש הגיעו עד 8,858 $ ± 5,120 $ בשנה⁴. עם הזדקנות החברה, KOA הפך לבעיית בריאות עולמית ולנושא חברתי מרכזי, כמו גם נושא אקטואלי למחקר מדעי.

מחקרים מבוססי ראיות הראו את היעילות של מניפולציה Tuina בטיפול KOA⁵. מניפולציה Tuina יכול להקל על הכאב ולשפר תפקוד לקוי בחולי KOA, המנגנון של אשר קשור השפעות אנטי דלקתיות ^6,7. חוקרים מצאו כי מניפולציה של Tuina עיכבה ביעילות את הביטוי של גורמים דלקתיים אינטרלוקין (IL)-β ו-5-hydroxytryptamine והאטה את התנוונות הסחוס המפרקי בארנב KOA מודל⁸. הוא הציע כי Tuina יכול לקדם את זרימת הדם ואת חילוף החומרים באתר הנגע, אשר עזר לנקות גורמים דלקתיים כגון IL-1, IL-6 וגורם נמק הגידול (TNF)-α, ובכך להקל על הסימפטומים הקליניים של KOA⁹. בנוסף, התנועה הפסיבית של המפרק באמצעות מניפולציה Tuina יכול לקדם את החדירה ואת הדיפוזיה של נוזל סינוביאלי לתוך הסחוס המפרקי ומשפר את חילוף החומרים המזינים רקמות¹⁰. מחקרים אחרים הצביעו על כך שמניפולציה של טווינה יכולה לשפר ביעילות את המדדים הביומכניים בחולי KOA¹¹. מניפולציות המופעלות על רקמות רכות יכולות לשפר את פיזור הלחץ על הגפיים ולשפר את תפקוד שיווי המשקל^12,13. יחד עם זאת, עם כמה מניפולציות התאמה משותפת, יישור הגפיים התחתונות יכול גם להיות מותאם לתקן הליכה חריגה^14,15.

מנגנון הפעולה של מניפולציה Tuina בטיפול KOA עדיין צריך להיחקר, ולכן, מחקר ניסיוני הוא הכרחי. המפתח ליישום של טווינה בחיות ניסוי הוא סטנדרטיזציה של דוגמנות, קיבוע בעלי חיים ושיטות התערבות¹⁶. שיטת המידול קובעת אם חיית הניסוי יכולה להציג את מאפייני המחלה. בינתיים, שיטות קיבוע מתאימות יכול להקל על התערבות של מניפולציה Tuina לשקף טוב יותר את ההשפעה של Tuina. הסטנדרטיזציה של שיטות התערבות היא החלק הקשה ביותר של מניפולציה Tuina. בשנת 2010, המערכת הבסיסית של תקני הדיקור הסיני הזכירה את תקני נקודת הדיקור לבעלי חיים ניסיוניים, המספקים אפשרות לדיקור סיני וניתוחי טווינה בניסויים בבעלי חיים¹⁷. עם זאת, עדיין קיימים קשיים בסטנדרטיזציה של מניפולציה של טווינה. ישנם מספר סוגים של מניפולציה Tuina¹⁸. הבחירה במניפולציה הספציפית תלויה בעיקר במחלה שיש לטפל בה ובתיאוריות הטיפוליות שהמבצע מעדיף. במחקר של Tuina for KOA, תשומת לב רבה יותר הוקדשה למניפולציה של לחיצה נקודתית (לחיצה על נקודות הדיקור הספציפיות עם האגודל או המרפק), מניפולציית דחיפת Yizhichan (מניפולציית דחיפה על ידי נענוע האגודל), ומניפולציית לחיצה ולישה (המתייחסת ללחיצה ולישה של האזור הספציפי של משטח הגוף באמצעות אצבע או כף יד)¹⁹. מניפולציה של לחיצה ולישה היא אחת המניפולציות הנפוצות ביותר של טווינה, המשלבת לחיצה ולישה כדי להזיז את הרקמה התת עורית²⁰. מניפולציה של לחיצה ולישה המיושמת על נקודות דיקור יכולה לקדם את זרימת הדם ולהקל על הכאב ומייצגת את ההשפעה הטיפולית של טווינה על KOA¹⁹.

בפרוטוקול זה יתוארו בפירוט פעולות המניפולציה של לחיצה ולישה על חולדות KOA, כולל נקודות דיקור נבחרות, עוצמת ותדירות המניפולציה ותנוחת הגוף של החולדה, כדי לספק התייחסות למחקר עתידי.

מחקר זה עבר את סקירת האתיקה של בעלי חיים שנערכה על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים ניסיוניים של בית החולים Yueyang של רפואה סינית מסורתית ומערבית משולבת המסונפת לאוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (YYLAC-2022-166).

1. הכנה וקיבוץ ניסיוניים של בעלי חיים

1. הכנת בעלי חיים
   1. מאחור סך של 10 חולדות בריאות SPF SD של 200-220 גרם בטמפרטורת החדר (18-21 מעלות צלזיוס), לחות 40%-50%, 12 שעות: 12 שעות חילופי שעון ביולוגי. לערוך ניסויים בבעלי חיים הקשורים לכאב תוך ציות קפדני להוראות הרלוונטיות של הנחיות והנחיות אתיות של בעלי חיים.
2. קיבוץ בעלי חיים
   1. חלקו את החולדות באופן אקראי לקבוצת טווינה ולקבוצת ביקורת. לטפל חולדות של קבוצת Tuina עם לחץ ולישה מניפולציה במשך 21 ימים לאחר דוגמנות. שימו חולדות מקבוצת הביקורת באותו חדר טווינה והניחו אותן בשקית בד שחורה בו זמנית בזמן שקבוצת טואינה עוברת טיפול.

2. דוגמנות של בעלי חיים

1. הרדמת בעל החיים
   1. השתמש isoflurane להרדמה גז. הכניסו את החולדה לקופסת האינדוקציה עם ריכוז אינדוקציה של 3%. נדנדו את הקופסה לאחר הנחת החולדה ואשרו את ההרדמה כאשר החולדה מתהפכת ללא ניסיון לחזור למצב נוטה.
   2. הוציאו את החולדה מקופסת האינדוקציה וקיבעו את אפה במסכת ההרדמה. התאם את ריכוז האיזופלורן ל -2% כדי לשמור על הרדמה. אשרו את ההרדמה כאשר החולדה אינה מגיבה בעת צביטת כפותיה. מרחו משחת עיניים על החולדות כדי למנוע יובש כאשר חולדות מורדמות, מכיוון שלא ניתן לסגור את העפעפיים.
2. שיטת מידול²¹
   1. השתמש במכונת גילוח כדי להסיר את שיער הגפה האחורית הימנית. הניחו כרית צמר גפן רפואית בין קרסול ימין למפרק הירך של החולדה. תקן את מפרק ברך ימין בהארכה של 180 מעלות עם 5-6 שכבות של תחבושת גבס רטובה באופן שווה. ספירלה עוטפת את תחבושת הגבס החל מהקרסול ומכסה 1/3 מקודמתה. השתמשו במייבש שיער כדי לייבש ולהקשיח את הטיח.
   2. עוטפים את הטיח בחומר בסיס תותבות לאחר שתחבושת הטיח מתייבשת ומתקשה כדי לקבע את הטיח ולמנוע ממנו לכרסם.
   3. ערבבו את חומרי הבסיס של התותבות כדי להפוך אותה לדביקה והדביקו את התערובת לחלק החיצוני של הטיח (התערובת לא תעלה על קצה התחבושת, איור 1). לאחר שהתערובת הופכת קשה, כבו את מכונת ההרדמה והמתינו עד שבעל החיים יתעורר באופן טבעי. השגיחו על החולדות כדי למנוע תאונות הרדמה לפני שהחולדות מתעוררות.
   4. קבע את הגבס כראוי על הגפה האחורית הימנית של החולדה, שכן קיבוע הדוק מגביל את זרימת הדם, בעוד קיבוע רופף נוטה ליפול. שימו לב למחזור הדם באיבר הטרמינלי. אם מתגלה נפיחות בגפיים הסופיות או בגוון עור סגול, יש לחתוך מיד חלק מהטיח כדי לסייע בשחזור זרימת הדם. צור מחדש את הטיח אם הוא שבור ולא מצליח לשמור על הארכת הגפה התחתונה.
   5. הסר את הטיח לאחר 3 שבועות של אימוביליזציה מתמשכת. השתמש מספריים כירורגיים כדי לחתוך את חומר הבסיס תותבת בחוץ תחבושת גבס. שוטפים את הגפה התחתונה של החולדה במי מלח ומייבשים אותה בגזה. אם יש נגעים מקומיים בעור, לעקר עם יודופור.
3. אימות דגם²²
   1. אימות מבוסס רנטגן
      1. בצע בדיקת רנטגן של ברך ימין 1 יום לאחר סיום הדוגמנות. בצע צילומי רנטגן אנטרופוסטריוריים במצב שכיבה עם כיפוף מפרק הירך ב-30°, הארכת ברך ב-0°, וחטיפת מפרק הירך ב-15°. שמור את הפטלה ישירות מול הברך ושים את צינור הרדיאטור 110 מ"מ ממפרק הברך.
      2. קח צילומי רנטגן לטרליים במצב דקוביטוס לטרלי ימני עם כיפוף ירך ימין ב-30° והארכת ברך ימין ב-0°. בצע את כיפוף ירך הגפה השמאלית ב- 70°, וכיפוף הברך ב- 45°, והרחיקו את צינור הרדיאטור 110 מ"מ ממפרק הברך. הגדר את פרמטרי הזיהוי כמתח חשיפה 50 kV, זרם 250 mA, מינון חשיפה 32 mAs, וזמן חשיפה 128 ms.
      3. השוו עם צילום רנטגן רגיל של חולדות, בדקו שצילום הברך המעוצב מראה חלל מפרק צר יותר עם היפרפלזיה אוסטאופיטית בקצה.
   2. Osteoarthritis Research Society International (OARSI) ציון²³
      1. הכניסו את החולדה לקופסת המתת חסד ונתלו_CO2 בקצב של 30%-70% נפח כלוב לדקה. הפסיקו לבלבל_CO2 לאחר שהבחינו שהחולדה אינה ניידת, אינה נושמת, ושהאישון מורחב. שימו לב עוד 2 דקות כדי לאשר את המוות.
         הערה: נקע צוואר הרחם יכול להתבצע לאחר המתת חסד מבוססת CO₂ כצורה משנית כדי לאשר את המוות. תקנו את החולדה על השולחן ואחזו בזנבה ביד אחת. לחץ כלפי מטה על ראשה של החולדה עם האגודל והאצבע המורה של היד השנייה. אשר את המוות בעת שמיעת צליל של סדק, והחולדה מאבדת תנועה ופעימות לב בו זמנית.
      2. תקן את החולדה במצב שכיבה עם מחט מזרק על לוח קצף עם הגפה האחורית הימנית מכופפת בחטיפה ובסיבוב חיצוני. צבטו את העור סביב מפרק הברך במספריים כירורגיים. חשוף את השרירים סביב מפרק הברך על ידי חיתוך העור ולאחר מכן חיתוך הפאשיה התת עורית.
      3. חותכים את עצם הירך ואת diaphysis השוקה עם מספריים עצם להסיר את מפרק הברך הימנית. הסר בעדינות את הרקמות הרכות הנוספות, כגון שרירים ורצועות, מחוץ למפרק.
      4. תקן את המפרק ב 4% paraformaldehyde במשך 24-48 שעות ב 4 ° C. decalcize את המפרק בתמיסת 10% חומצה פורמית במשך 3 ימים עד רקמת העצם ניתן לדקור בקלות עם מחט.
      5. מניחים וחותכים את הרקמה המסוידת במכסה האדים ומעבירים אותה לקופסת התייבשות במכונת ההתייבשות. הוסף 75% אתנול במשך 4 שעות, ואז 90% אתנול במשך 2 שעות, ואחריו 95% אתנול במשך 1 שעות, אתנול מוחלט במשך 30 דקות, סיבוב נוסף של אתנול מוחלט טרי במשך 30 דקות, בנזן אלכוהול במשך 5-10 דקות, קסילן במשך 5-10 דקות, סיבוב נוסף של קסילן טרי במשך 5-10 דקות, שעווה במשך 1 שעות, סיבוב נוסף של שעווה טרייה במשך 1 שעות, וסבב אחרון של שעווה טרייה למשך שעה להתייבשות וטבילת שעווה שקופה.
      6. לאחר מכן, הניחו את הרקמה במכונה להטמעה. חותכים את גוש השעווה לפרוסות שעווה של 4 מיקרומטר לאחר שהפרפין התייצב ומשטחים את הפרוסה במים חמים. מניחים את הפרוסה על מגלשת זכוכית ומייבשים. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      7. התבונן בדגימת הסחוס ותן לה ציון בהתאם להערכת ציון היסטופתולוגיה של סחוס OA (טבלה 1)²³. אם ציון החולדות לאחר הדוגמנות גבוה משמעותית מזה של החולדות הרגילות, הדוגמנות הייתה מוצלחת.

טבלה 1. הערכת ציון היסטופתולוגיה סחוס OA. דרגה היא התקדמות עומק לסחוס. ציון כולל = ציון x בימוי. 0 למפרקים תקינים, 24 לדלקת פרקים חמורה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איור 1. חולדות משותקות בגבס. לאחר שהחולדות הורדמו, גפיהן התחתונות הימניות נעטפו בתחבושות גבס, קובעו במצב היפר-מורחב וכוסו בשכבה של חומרי בסיס תותבות בחוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. מניפולציה Tuina

1. אזור יישום
   1. בחרו בסך הכל 5 נקודות דיקור בגפה האחורית הימנית של חולדות, כולל ST34, ST35, SP10, EX-LE4 ו-BL40 (איור 2). אתר את נקודות הדיקור על פי עקרונות מיקום הדיקור ב ²⁴.
2. עמדה ליישום
   1. חותכים מטלית שחורה לשקית בגודל 9X15 ס"מ עם פתח צד אחד ומהדקים את הפתח בחבל. לפני המניפולציה של טווינה, משכו בעדינות את זנבה של החולדה כדי לגרום לה להתחפר בשקית ולחשוף את איבריה האחוריים מחוץ לתיק.
   2. השתמשו ביד אחת כדי להחזיק את החולדה במצב נוטה, להחזיק את הזנב ואת הרגל האחורית שלה, בעוד היד השנייה מפעילה מניפולציה של לחיצה ולישה על נקודת דיקור מסוימת (איור 3).
3. מניפולציה של טווינה
   1. הפעל מניפולציה של לחיצה ולישה על 5 נקודות הדיקור בגפה האחורית הימנית למשך 2 דקות כל אחת. הניחו את האגודל של המבצעים על נקודת הדיקור שנבחרה כדי לבצע לחיצה ולישה קצובה, תוך הנעת העור והרקמה התת עורית יחד בתנועה מעגלית.
   2. השתמש בהקלטות לחץ אצבע (יחידות בניוטון) כדי להבטיח עוצמה ותדירות עקביות של המניפולציה. שמרו על העוצמה שבין 3-5 N והתדר על 2 הרץ (איור 4). החל את המניפולציה פעם ביום במשך 21 יום.

איור 2. מיקום נקודות דיקור. SP10 ממוקם 5 מ"מ מעל מפרק הברך הפנימי בחולדות. ST34 ממוקם 5 מ"מ מעל מפרק הברך החיצוני בחולדות. EX-LE4 ממוקם בצד המדיאלי של רצועת הברך בחולדות. ST35 ממוקם בצד הצדדי של רצועת הברך בחולדות. BL40 ממוקם בנקודת האמצע של הפס הפופליטלי הרוחבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3. מניפולציה Tuina מוחל על חולדות. החולדות הוחזקו בשקית שחורה כשגפיהן האחוריות חשופות. המבצע החזיק את זנב החולדה ביד שמאל בעוד יד ימין ביצעה את המניפולציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4. הקלטות לחץ אצבע. מכשיר המתעד את הכוח והתדירות של לחץ האצבע משמש למשוב בזמן אמת על העוצמה והתדירות בתהליך מניפולציית טווינה. (A) חיישן לחץ וציוד שידור. (B) רישומי לחץ אצבע. (ג) הכוח שנרשם במהלך מניפולציה של טווינא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. מבחני התנהגות כאב

1. בדיקת התנהגות כאב לפני ואחרי מידול, ויום אחד אחרי (D1), 7 ימים אחרי (D7), 14 יום אחרי (D14) ו-21 יום אחרי (D21) מניפולציית טווינה, כולל סף נסיגה מכני ובדיקות חביון משיכה כפות.
2. סף משיכה מכני (MWT)
   1. הניחו את החולדות בחדרון זכוכית מחוסמת שקוף בגודל 20 ס"מ על 10 ס"מ על 20 ס"מ הממוקם על במה בגובה 40 ס"מ המורכבת מסריג תיל בגודל 10 מ"מ על 10 מ"מ צמצם. שמור על טמפרטורת החדר ב 23 °C ± 2 °C (75 °F).
   2. יישבו את החולדות במעבדה ההתנהגותית לפחות שעתיים ביום במהלך שלב הבדיקה ההתנהגותית כדי למנוע הפרעה לתוצאות הבדיקה עקב חוסר הסתגלות של בעלי החיים לסביבה בתחילת הבדיקה הרשמית. הכניסו את החולדות למעבדה התנהגותית למשך 30 דקות לפני תחילת הבדיקה הרשמית כדי להקל על הסתגלותן לסביבה ולהפחית גורמים מסיחי דעת.
   3. השתמש בסיבי Von Frey אלקטרוניים כדי למדוד את MWT. לגרות את החולדה עם הסיב במרכז כף הרגל שלה ולמשוך את הסיב כאשר החולדה מראה תנועות ברורות כגון הרמת הרגל והימנעות. המכשיר יכול להקליט באופן אוטומטי את ערך הלחץ המרבי (N) ברגע זה.
   4. התחל את הגירוי הבא באותה חולדה לפחות 15 שניות לאחר הגירוי הנוכחי. אין לחרוג מ-5 שניות במהלך כל גירוי כדי למנוע רגישות לגירויי מישוש בכפותיהן של חולדות. חזור על הבדיקה 5x עד שההפרש בין שלוש המדידות העוקבות אינו משמעותי (בטווח של 10 N).
   5. מחק את הערכים עם הבדלים גדולים (ערכי המקסימום והמינימום) וקח את הממוצע של שלושת הערכים הנותרים כסף משיכה מכני.
3. חביון משיכת כפות (PWL)
   1. הניחו את החולדות בתא קטן של זכוכית מחוסמת שקופה בגודל של 20 ס"מ x 10 ס"מ x 20 ס"מ. מכסים את החלק העליון של התא בכיסוי זכוכית שקוף עם חורי אוורור. שמור על הטמפרטורה של צלחת זכוכית שקופה על 28-30 ° C, שבו התא ממוקם.
   2. יישבו את החולדות בסביבה זו לפחות 30 דקות כדי להתאקלם לפני תחילת כל מבחן רשמי. אם חולדות משתינות או עושות את צרכיהן בתא, נקו אותו עם נייר סופג בזמן כדי למנוע השפעה על מעבר החום של קרינת האור לאחר מכן.
   3. מקדו את הזרקור במרכז כף הרגל של החולדה ולחצו על לחצן התחל . לחצו על כפתור העצירה כאשר החולדה מראה התנהגויות ברורות כמו נסיגת כף הרגל או ליקוק כפות ותיעדו את השעה בשלב זה. זמן הקרנת הזרקור לא יעלה על 20 שניות כדי למנוע נזק לעור החולדה.
   4. בצעו את ההקרנה הבאה על אותה חולדה לאחר 10 דקות לפחות כדי למנוע רגישות. מדדו פי 5 על כל חולדה.
   5. הסר את הערכים עם הבדלים גדולים (הערך המרבי והערך המינימלי). קח את הממוצע של הערכים הנותרים כ- PWL.

5. הכנת מדגם

1. בצע המתת חסד על העכבר כמתואר ב- 2.3.2.1.
2. הכנת קרום סינוביאלי
   1. תקן את החולדה במצב שכיבה עם מחט מזרק על לוח קצף עם הגפה האחורית הימנית מכופפת בחטיפה ובסיבוב החיצוני. צבטו את העור סביב מפרק הברך עם מספריים כירורגיים וחשפו את השרירים סביב מפרק הברך של חולדות על ידי חיתוך העור ולאחר מכן חיתוך הפאשיה התת עורית.
   2. קח את הרצועה הפטלרית כציון דרך כדי להפשיט את קבוצות השרירים מעל הרצועה הפטלרית. חותכים בזהירות את קצה הרצועה הפטלרית (בטוברוזיות הטיביאלית) ומוצאים את הקרום הסינוביאלי כאשר הרצועה נצבטת כלפי מעלה מלמטה.
   3. בזהירות לחתוך את הרקמה הסינוביאלית עם מספריים אופתלמיים ולשטוף את הדם ואת הנוזל הסינוביאלי עם מלוחים מקורר מראש. תקן את הממברנה הסינוביאלית ב 4% paraformaldehyde לפחות 48 שעות לאחר ספיגת מים מפני הרקמה עם גזה נקייה.
   4. הכן את הדגימה כמו בשלבים 2.3.2.5- 2.3.2.6. בצע ניקוד כמו בשלב 2.3.2.7.
3. ביצוע המטוקסילין וצביעת אאוזין
   1. יש להוריד למים עם קסילן למשך 20 דקות, להחליף בסיבוב נוסף של קסילן טרי למשך 20 דקות, ולאחר מכן לטפל באתנול נטול מים למשך 5 דקות, להחליף בסיבוב נוסף של אתנול נטול מים טרי למשך 5 דקות, ואז להוסיף 90% אתנול בנפח למשך 5 דקות, 80% אתנול בנפח למשך 5 דקות, 70% אתנול בנפח למשך 5 דקות, ולבסוף מים מזוקקים במשך 5 דקות.
   2. טבלו את המגלשה בתמיסת צביעת המטוקסילין למשך 3-8 דקות. הסירו את המגלשה ושטפו את הכתם במים מזוקקים. העבר אותו לנוזל ההתמיינות (1% חומצה הידרוכלורית אלכוהול) במשך כמעט 30 שניות, כך שהשקופית תדעך לכחול בהיר. שטפו אותו במים מזוקקים, והכניסו לתמיסת צביעת אאוזין למשך 1-3 דקות.
   3. יש לייבש את המגלשה עם חלק נפח אתנול 95% למשך 5 דקות, להחליף בסיבוב נוסף של אתנול טרי 95% למשך 5 דקות, ולאחר מכן אתנול נטול מים למשך 5 דקות, להחליף בסיבוב נוסף של אתנול נטול מים טרי למשך 5 דקות.
   4. הפוך את השקופית לשקופה על ידי הוספת קסילן למשך 5 דקות, החלף אותה בסיבוב נוסף של קסילן טרי למשך 5 דקות, ולאחר מכן אטם אותה עם שרף ניטרלי.
4. Terminal-deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling (TUNEL) על סחוס
   1. יש לייבש את דגימת הסחוס באתנול נטול מים, 90% אתנול, 85% אתנול ו-75% אתנול עד להשלמת ההידרציה. משרים ב-PBS למשך 5 דקות. יש להוסיף 3% H2 O₂ טיפות למשך 10 דקות.
   2. יש להוסיף את תמיסת העבודה proteinase K בטיפה ולעכל בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות. הוסיפו 20 מיקרוליטר של חיץ תיוג לכל פרוסה כדי לשמור על לחותה ונערו את עודפי הנוזלים לאחר הכנת תמיסת העבודה. הוסף 20 μL של פתרון עבודה לכל שקופית ודגר במשך שעתיים ב 37 ° C בקופסה רטובה.
   3. מוסיפים 50 μL של תמיסת הסגירה, טיפה אחר טיפה וסוגרים למשך 30 דקות. לאחר מכן יש להוסיף 50 μL של נוגדן אנטי-דיגוקסין מדולל ביוטינילציה (דילול 1:100) ולדגור ב-37°C למשך שעתיים בקופסה רטובה. יש להוסיף 10 μL של דילול נוגדני SABC (דילול 1:100) ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים בקופסה רטובה.
   4. הוסף תמיסת פיתוח צבע DAB (50 μL כל אחד מגיבים A, B ו- C ב- 1000 μL של מים מזוקקים) טיפה למשך 10-15 דקות. התפתחות הצבע משלימה כאשר הוא גרגירי חום-צהוב.
   5. מכתים מחדש עם hematoxylin במשך 3 שניות. לאחר התייבשות הדרגתית וטיפול שקוף, יש לייבש בטמפרטורת החדר ולאטום את המגלשה בזהירות עם חניכיים ניטרליות. שימו לב כדי להימנע מהשארת בועות ודבק עולה על גדותיו.
5. אנליזה אימונוהיסטוכימית של IL-1β ו-TNF-α
   1. טווקס את המגלשות באופן שגרתי בקסילן ולחות אותן באלכוהול הדרגתי. להשבית את peroxidase אנדוגני בקטעים עם 3% H 2 O₂. הניחו את מחזיק המגלשה במאגר ציטראט בטמפרטורה של 95°C (pH 6.0) ודגרו באמבט מים מעל 95°C למשך יותר מ-20 דקות. הוציאו את קופסת הדגירה והשאירו אותה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לפחות.
   2. יש לדגור על סרום עיזים 5% רגיל עם PBS למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37°C ולנער את עודפי הנוזלים. להוסיף 150 μL של נוגדן אני טיפה אחר טיפה ולתת לעמוד על 37 ° C במשך 1 שעה, ולאחר מכן לאחסן לילה ב 4 ° C. למחרת, התחממו מחדש ב 37 °C (77 °F) במשך 45 דקות.
   3. שטפו 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד. כסו את הרקמה במגלשה ב-3% BSA ואטמו אותה ב-37°C למשך 30 דקות. הוסף 150 μL של נוגדן II טיפה אחר טיפה ולתת לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד ולהוסיף 150 pL של נוזל לפיתוח צבע DAB טיפתית. שימו לב למידת הכתמים מתחת למיקרוסקופ עד שהדגימה הופכת חומה-צהובה אפילו לעין בלתי.
   4. יש לשטוף מיד עם PBS במשך 10 דקות. מכתימים שוב בהמטוקסילין, מייבשים באלכוהול הדרגתי, הופכים את השקופיות לשקופות בקסילן ואוטמים במסטיק ניטרלי.
6. ניתוח סטטיסטי
   1. חלקים מוכתמים אימונוהיסטוכימית עם ביטוי חיובי של החלבון הקשור הם צהובים או חומים-צהובים. ציון עוצמת הביטוי החיובי על ידי תוכנת Image J עבור כל קבוצה של חתכים אימונוהיסטוכימיים והשתמש בקריטריוני ההערכה של צפיפות אופטית ממוצעת (AOD), המחושבים על ידי IOD חלקי שטח.
   2. השתמש בתוכנת ניתוח לניתוח סטטיסטי. השתמש במבחן t אם הנתונים תאמו להתפלגות נורמלית וריבוע חי, והשתמש במבחן לא פרמטרי אם הם לא התאימו להתפלגות נורמלית. נתח נתוני מדידה חוזרים על ידי משוואות אומדן כלליות.

מבחני התנהגות כאב
תוצאות MWT הראו כי MWT של הגפה האחורית הימנית לאחר הדוגמנות היה נמוך משמעותית מבעבר (עמ '<0.05). בהשוואה לקבוצת הביקורת, MWT של חולדות היה גבוה באופן משמעותי לאחר Tuina (p<0.05; איור 5 וטבלה 2).

איור 5. תוצאות מבחן סף נסיגה מכני (ניוטון). היו 5 חולדות כל אחת בקבוצת טווינה ובקבוצת הביקורת. ה-MWT של החולדות בנקודות זמן שונות מוצג באיור. לאחר הדוגמנות, ה- MWT של החולדות ירד באופן משמעותי, מה שמרמז על כך שהכאב של החולדות החמיר, ומודל KOA הוכן בהצלחה. לאחר מכן, MWT השתפר בהדרגה, מה שמרמז על הקלה בכאב. משוואת האמידה הכללית שימשה לחישוב סטטיסטי. ההבדל ב-MWT בין קבוצת טווינה לקבוצת הביקורת היה מובהק סטטיסטית ביום ה-21 בהשוואה לזה שלאחר הדוגמנות. ההשוואה בין שתי הקבוצות הייתה מובהקת סטטיסטית ב-D7, D14 ו-D21, *p<0.05. יתר על כן, לחולדות בקבוצת Tuina יש MWT גבוה יותר מזה שבקבוצת הביקורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 2. סף משיכה מכני ( , N). השוואה לפני ואחרי דוגמנות, ^#p<0.05. השוואה בין קבוצת טווינא לקבוצת ביקורת, *p<0.05. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

תוצאות PWL הראו כי PWL של הגפה האחורית הימנית לאחר הדוגמנות היה קצר משמעותית מבעבר (p<0.05). בהשוואה לקבוצת הביקורת, MWT של חולדות התארך באופן משמעותי לאחר Tuina (p<0.001; איור 6 וטבלה 3).

איור 6. תוצאות בדיקת חביון משיכת כפות (, שנייה). היו 5 חולדות כל אחת בקבוצת טווינה ובקבוצת הביקורת. PWL של החולדות בנקודות זמן שונות מוצג באיור. לאחר הדוגמנות, PWL של החולדות ירד באופן משמעותי, מה שמרמז על כך שהכאב של החולדות הוחמר, ומודל KOA הוכן בהצלחה. בתחילה, השיפור של PWT בקבוצת טווינה היה איטי יותר מזה שבקבוצת הביקורת. לאחר D7, החולדות בקבוצת Tuina השתפרו במהירות ועקפו את קבוצת הביקורת ב-D21. משוואת האמידה הכללית שימשה לחישוב סטטיסטי. ההבדל ב-MWT בין קבוצת טווינה לקבוצת הביקורת היה מובהק סטטיסטית ביום ה-21 בהשוואה לזה שלאחר הדוגמנות. ההשוואה בין שתי הקבוצות הייתה מובהקת סטטיסטית ב-D7, D14 ו-D21, ***p<0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 3. חביון משיכת כפות (, s). השוואה לפני ואחרי דוגמנות, ^#p<0.05. השוואה בין קבוצת טווינא לקבוצת הביקורת, ***p<0.001. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

בדיקה היסטומורפולוגית
לאחר ניתוח הממברנה הסינוביאלית בקבוצת הביקורת, נראו חדירת תאים דלקתיים והיפרפלזיה של רקמות סיביות ברקמה סינוביאלית. התאים הסינוביאליים לא היו מאורגנים, וכמות קטנה של היפרפלזיה נימית נראתה סביב הרקמה הסינוביאלית (איור 7).

איור 7. תצפית מיקרוסקופית של הרקמה הסינוביאלית. (A) רקמה סינוביאלית בקבוצת הביקורת. הסדר הלא מאורגן של תאים סינוביאליים נראה באיור. כלי הדם המתרבים מסומנים בחצים אדומים, ותאים דלקתיים מסומנים בחצים שחורים. (B) רקמה סינוביאלית בקבוצת טווינא. תאים סינוביאליים היו מסודרים בצורה מסודרת יותר. תאים דלקתיים מפוזרים בעיקר בקצוות ולא מסתננים פנימה. כלי הדם המתרבים מסומנים בחצים אדומים, ותאים דלקתיים מסומנים בחצים שחורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בקבוצת טווינה, תאים סינוביאליים היו מסודרים בצורה מסודרת, עם כמות קטנה של חדירת תאים דלקתיים, היפרפלזיה של רקמות סיביות, וכמות קטנה של היפרפלזיה נימית נראית בשולי הרקמה.

לאחר ניתוח הסחוס, נראה שהאזור החיובי של צביעת טונל בקבוצת טווינה היה קטן משמעותית מזה שבקבוצת הביקורת, מה שמצביע על כך שהיו פחות כונדרוציטים אפופטוטיים בקבוצת טווינה (איור 8).

איור 8. צביעת טונל של הסחוס. (A) סחוס בקבוצת הביקורת. החלק האדום של האיור הוא האזור החיובי של צביעת טונל. (B) סחוס בקבוצת טווינא. החלק האדום של האיור הוא האזור החיובי של צביעת טונל. האזור החיובי בקבוצת טווינה קטן משמעותית מזה שבקבוצת הביקורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אימונוהיסטוכימיה
עבור TNF-α היה הבדל משמעותי בביטוי TNF-α סינוביאלי בין שתי הקבוצות, והביטוי בקבוצת Tuina היה נמוך משמעותית מזה שבקבוצת הביקורת (טבלה 4).

טבלה 4. ביטוי TNF-α בסינביום (, *^10-2). שני מדגם t בלתי תלוי שימש לניתוח סטטיסטי, *p<0.05. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

עבור IL-1β, לא היה הבדל משמעותי בכמות הביטוי הסינוביאלי IL-1β בין שתי הקבוצות, כפי שנמדד על ידי הסטטיסטיקה של תמונה J. עם זאת, הערך הממוצע של קבוצת טווינה היה נמוך בעדינות, מה שמצביע על פחות ביטוי (טבלה 5).

טבלה 5. ביטוי IL-β בסינביום (, *^10-2). שני מדגם t בלתי תלוי שימש לניתוח סטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

מחקר זה מספק פרוטוקול למניפולציה של Tuina על חולדות KOA. באמצעות בדיקות התנהגות כאב וממצאים היסטומורפולוגיים, הוא הציע כי סדרה כזו של מניפולציה Tuina המיושמת על חולדות KOA יכולה להפחית דלקת סינוביאלית ואפופטוזיס סחוס, אשר יכול להיות התייחסות של מניפולציה Tuina על מודלים בעלי חיים של KOA.

ישנם מספר הליכים קריטיים במהלך הפרוטוקול. ראשית, חשוב לבחור שיטה מתאימה להשראת מודל KOA. ישנן שיטות שונות לזירוז מודל KOA, כולל הזרקת חלל מפרק²⁵, ניתוח תוך מפרקי 26,27, שיטת בלימת מפרקים ^28,29 וכו '. מכיוון שמודלים של KOA המושרים בשיטות פולשניות ישאירו פצעים ליד המפרקים, מה שעלול להפריע להשפעה של מניפולציה של טווינה, בחרנו בשיטה הלא פולשנית של אימוביליזציה של מפרקים. ניתן לחלק את שיטת האימוביליזציה המשותפת להיפר-הרחבה וקיבוע היפר-פלקסיה. שאנג ועמיתיו השוו את ההשפעות של שתי שיטות קיבוע אלה ומצאו שיש הבדל קטן בהשפעה של אפופטוזיס סחוס²³. עם זאת, נושאי הניסוי שלהם היו ארנבות, שהן גדולות יותר וקלות יחסית לתיקון בהשוואה לחולדות. טיח קבוע במצב כיפוף סביר יותר ליפול תחת חולדות מכרסמים. לכן, בחרנו בשיטת האימוביליזציה של קיבוע היפר-הארכה כדי לגרום ל-KOA. התייחסנו ל- He et al. והשתמשנו בתחבושת הגבס עם מדכא לשון כמכשיר קיבוע³⁰. עם זאת, יכולת הכרסום של חולדות הייתה חזקה מהצפוי, והמכשיר לא יכול היה לשמש כקיבוע. בהמשך מצאנו מעין חומר בסיס תותבות, שיכול ליצור מעטפת ניתנת לעיצוב אך קשה בחלק החיצוני של הטיח, ולהפחית ביעילות את הבלאי של מכשיר הקיבוע על ידי חולדות המכרסמות. קיבוע הדוק ישפיע על זרימת הדם של הגפיים התחתונות, בעוד קיבוע רופף מדי יהיה קל ליפול. לכן, את זרימת הגפיים התחתונות של החולדות יש לראות מדי יום במהלך 3 שבועות של דוגמנות. הקיבוע צריך להשתחרר כאשר הגפיים התחתונות הופכות נפוחות וארגמניות. התקינו מחדש את הקיבוע כאשר הוא רופף, והחולדות יכולות לכופף את ברכיהן. במהלך מחקר זה, החולדות לא הוגבלו מלהתרועע במהלך הדוגמנות, אך נמצא שהן היו לועסות זו את הקיבעון של זו כדי לעזור זו לזו להשתחרר. אולי בידוד החולדות היה מביא למודלים טובים יותר. עם זאת, בידוד עשוי לתרום לדיכאון ולהתנהגות סטריאוטיפית של החולדות.

אנו רואים כי נקודת המפתח של מניפולציה Tuina היא לשמור על עקביות של אינטנסיביות ותדירות. מחקרים קודמים הגיעו למסקנה כי העוצמה האופטימלית עבור טווינה של בעלי חיים צריכה להיות 80% מהעוצמה המרבית הנסבלת שלה³¹. בשלב זה, החולדות אמורות להראות סימנים של קבלת גירוי מכני, אך ללא סימני כאב או נסיגת כפות. בדקנו את העוצמה המרבית הנסבלת של חולדות, שהיא בסביבות 5-8 N. לכן, קבענו את עוצמת הדחיפה ל 3-5 N, מה שעשוי להוביל ליעילות טובה יותר. תדירות המניפולציה היא 2 הרץ, על פי ספר הלימוד של טווינה. מחקרים קודמים לא קבעו סטנדרטיזציה למניפולציה של טווינה, והעוצמה והתדירות עשויות להשתנות לאחר הפעלת נקודות דיקור שונות ושינוי יד שמאל וימין במהלך הניסוי, מה שיכול להשפיע על דיוק התוצאות. הקלטות לחץ האצבע המשמשות בניסוי זה מספקות תצפית בזמן אמת על עוצמת ותדירות המניפולציה במהלך הניסוי, מה שיכול לשמור על עקביות המניפולציה. יש חוקרים המשתמשים במכונות כדי לדמות מניפולציה של טווינא וליישם אותה על בעלי חיים, דבר שיש לו יתרון של סטנדרטיזציה של המניפולציה³² .

לבחירת נקודות דיקור, התייחסנו למחקר של וואנג וליו ובחרנו חמש נקודות דיקור סביב מפרק הברך כדי להקל על מניפולציה^33,34. בחרנו בשיטת הגבס המשותק כדי לגרום ל-KOA, שמסתיימת בעיקר בניוון שרירים ונוקשות מפרקים³⁵. ST34 ו-ST35 שייכים למרידיאן הקיבה יאנגמינג של כף הרגל, שהוא קריטי לטיפול בניוון (המתבטא בעיקר בחולשה וניוון שרירים) בתורת הרפואה הסינית המסורתית ובעל יכולת הסתגלות טובה ל-KOA המושרה בשיטת הגבס. EX-LE4 היא נקודת דיקור נפוצה לטיפול קליני ב- KOA, המשמשת בעיקר יחד עם ST35. Tan et al. מצאו כי דיקור סיני ומוקסיבציה ב- ST35, ST36 ו- EX-LE4 יכולים להפחית את ביטוי הגורמים הדלקתיים בקרום הסינוביאלי³⁶. SP10 ו- BL40 הם נקודות הליבה של הטיפול הקליני בטווינה עבור KOA 37,38^, ו- SP10 משמש בתדירות הגבוהה ביותר במרשמים של Tuina עבור KOA³⁹.

חלק קשה של מניפולציה Tuina הוא קיבוע של חולדות. חולדות עשויות להיאבק או להימנע ממניפולציה, מה שמגביר את הקושי בביצוע הניסוי. למרות שאימובילייזרים של חולדות יכולים לשתק חולדות ולחשוף את הגפיים האחוריות שלהן, התפתחות KOA מגבילה את כיפוף והארכת הגפיים האחוריות. לכן, יישוב חולדות עם אימובילייזרים עלול להוביל לכאב ולחשיפה חלקית של הגפיים האחוריות, מה שעלול להשפיע על מניפולציה של טווינה. עיצבנו שקית בד חד-פעמית המבוססת על העדפתה של החולדה לסביבות חשוכות ונטייתה להתחפר. סגור את שקית הבד כאשר החולדה נכנסת, כלומר, הראש והגפיים הקדמיות ממוקמים בתיק, וגפיו האחוריות חשופות בחוץ. שיטה זו יכולה להפחית ביעילות את המאבק של חולדות ולשמור עליהן שקטות במהלך טווינה.

תוצאות הניסוי המקדים מצביעות על כך שמניפולציה של טווינה עשויה להפחית את התגובה הדלקתית של רקמה סינוביאלית ולהפחית את האפופטוזיס של כונדרוציטים, ובכך לשמש כטיפול ב- KOA. עם זאת, נדרשים מחקרים נוספים כדי לאמת זאת.

ישנם מספר חסרונות של פרוטוקול זה. ראשית, גודלן הקטן של החולדות מקשה על איתור מדויק של נקודות הדיקור. אצבעותיו של המפעיל גדולות מדי בהשוואה לנקודות הדיקור על חולדות, מה שעלול להשפיע על השפעת מניפולציית טווינה. שקלנו להוסיף חלקיק גומי בקוטר של כ-2 מ"מ על קצה האצבע כדי להגביר את הדיוק של גירוי נקודות דיקור. אבל החלקיקים עלולים להוביל לעוצמת לחץ גבוהה יותר ולהגביר את הקושי לשלוט בעקביות. בנוסף, היה סיכוי גבוה יותר לפגוע ברישומי לחץ האצבע, ולכן לא בחרנו בשיטה זו. שנית, המחקר שלנו התעלם משינוי הגורמים הדלקתיים בנוזל הסינוביאלי ובאפופטוזיס כונדרוציטים, מה שעלול להחליש את אמינות המחקר. בעתיד נעמיק את המחקר בתחום. שלישית, מניפולציה של לחיצה ולישה היא אחת המניפולציות של טווינה, ואינה יכולה להקיף את ההשפעות של טווינה בטיפול ב- KOA. מניפולציות אחרות של טווינה המיושמות בבעלי חיים צריכות להיחקר עוד יותר, כולל מניפולציות תנועה משותפות, ומניפולציות שפשוף. יתר על כן, שליטה חיובית תראה טוב יותר את יעילות המניפולציה, אך היא לא תוכננה במחקר זה, ונוסיף זאת במחקר המשך.

בסך הכל, מחקר זה מספק פרוטוקול סטנדרטי למניפולציה של Tuina על חולדות KOA, ויעילות המניפולציה אומתה על ידי בדיקות התנהגות כאב וממצאים מיקרוסקופיים. הפרוטוקול הראשוני מוכיח כי ההשפעות הטיפוליות של טווינה עשויות להיות קשורות להפחתת דלקת סינוביאלית ואפופטוזיס כונדרוציטים מאוחר. יש צורך במחקר נוסף כדי לחקור את המנגנון של Tuina עבור KOA.

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

עבודה זו נתמכה על ידי Shanghai Critical Clinical Specialties Construction Project (מספר מענק: Shslczdzk04001); תוכנית השיט של ועדת המדע והטכנולוגיה של שנגחאי (מספר מענק: 22YF1444300); פרויקטים במסגרת תקציב אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (מספר מענק: 2021LK091).