Rilevamento in tempo reale della produzione di specie reattive dell'ossigeno nella risposta immunitaria nel riso con un saggio di chemiluminescenza

Qui, descriviamo un metodo per la rilevazione in tempo reale della produzione di specie reattive dell'ossigeno apoplastico (ROS) nei tessuti di riso nella risposta immunitaria innescata da pattern molecolari associati ai patogeni. Questo metodo è semplice, standardizzato e genera risultati altamente riproducibili in condizioni controllate.

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo vitale in una varietà di processi biologici, tra cui il rilevamento di stress abiotici e biotici. In caso di infezione da patogeni o di sfida con sostanze chimiche associate ai patogeni (modelli molecolari associati ai patogeni [PAMP]), una serie di risposte immunitarie, tra cui un burst di ROS, vengono rapidamente indotte nelle piante, che è chiamata immunità innescata da PAMP (PTI). Un burst ROS è una risposta PTI caratteristica, che è catalizzata da un gruppo di ossidasi NADPH localizzate nella membrana plasmatica, le proteine della famiglia RBOH. La stragrande maggioranza dei ROS comprende perossido di idrogeno (H 2 O₂), che può essere facilmente e costantemente rilevato con un metodo di chemiluminescenza a base di luminol. La chemiluminescenza è una reazione che produce fotoni in cui il luminolo, o il suo derivato (come L-012), subisce una reazione redox con ROS sotto l'azione di un catalizzatore. Questo articolo descrive un metodo di chemiluminescenza ottimizzato basato su L-012 per rilevare la produzione di ROS apoplast in tempo reale dopo l'elicitazione di PAMP nei tessuti di riso. Il metodo è facile, costante, standardizzato e altamente riproducibile in condizioni saldamente controllate.

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) comprendono una serie di derivati dell'ossigeno chimicamente attivi, compresi i radicali anionici superossido (O₂-) e i suoi derivati, i radicali idrossilici (^OH-), il perossido di idrogeno e i prodotti dell'ossigeno singoletto o delle reazioni di ^{ossido-riduzione}, che sono costantemente prodotti in plastidi e cloroplasti, mitocondri, perossisomi e altre sedi subcellulari¹ . I ROS svolgono un ruolo importante in molti processi biologici e sono essenziali per tutte le piante ^2,3,4. L'ampio spettro delle funzioni dei ROS varia dalla regolazione della crescita e dello sviluppo alla percezione degli stress abiotici e biotici 5,6,7,8.

Nel sistema immunitario delle piante, i recettori localizzati nella membrana plasmatica delle cellule vegetali - i cosiddetti recettori di riconoscimento dei pattern (PRR) - percepiscono i modelli molecolari associati ai patogeni (PAMP) delle sostanze chimiche derivate dai patogeni. Questo riconoscimento innesca una serie di risposte immunitarie veloci, tra cui afflusso di calcio, ROS burst e cascata MAPK; quindi, questo strato di immunità è chiamato immunità innescata da PAMP (PTI). Il burst ROS è una risposta PTI distintiva, la cui determinazione è ampiamente applicata agli studi relativi a PTI ^9,10. La produzione di ROS innescata dai PAMP è attribuita alla NADPH ossidasi residente nella membrana plasmatica, o proteine della famiglia dell'omologo dell'esplosione respiratoria ossidasi (RBOH), che trasferiscono elettroni dal NADPH citosolico o NADH all'ossigeno extracellulare per produrre superossido (O 2^-) che viene convertito spontaneamente in perossido di idrogeno (H 2 O ₂) dalla superossido dismutasi⁸ . Lo scoppio di ROS innescato da PAMP è abbastanza rapido, appare solo pochi minuti dopo il trattamento PAMP e raggiunge il picco a ~ 10-12 minuti. La stragrande maggioranza delle molecole di ROS comprende perossido di idrogeno (H 2 O₂), che può essere facilmente e costantemente rilevato con un saggio di chemiluminescenza.

Nella chemiluminescenza, il reagente chemiluminescenza reagisce con l'ossigeno attivo, sotto l'azione di un catalizzatore, per produrre gli intermedi di stato eccitato. Quindi, gli elettroni nel prodotto ritornano allo stato fondamentale attraverso la transizione non radiativa ed emettono fotoni. I reagenti comuni a chemiluminescenza includono luminol e L-012, con luminolo che domina l'applicazione^11,12,13. Tuttavia, sempre più ricercatori scelgono L-012 per rilevare la produzione di ROS, poiché L-012 ha un'efficienza di emissione luminosa molto più elevata in condizioni di pH neutro o quasi neutro rispetto al luminolo.

Questo articolo descrive un metodo di chemiluminescenza ottimizzato, basato su L-012, per la rilevazione in tempo reale della produzione di ROS dopo l'elicitazione di PAMP nei dischi e nella guaina dei tessuti di riso (Oryza sativa). Il metodo qui fornito è semplice, stabile e standardizzato ed è altamente adattabile per soddisfare diverse esigenze sperimentali. I dati ottenuti con questo metodo sono altamente riproducibili in condizioni saldamente controllate.

NOTA: Il protocollo è applicabile a diversi tessuti vegetali. Guaina di riso e dischi di foglie sono stati utilizzati in questo protocollo per il rilevamento ROS dopo l'elicitazione PAMP. Poiché le differenze sorgono principalmente a causa del metodo di campionamento, solo le procedure comuni sono descritte di seguito, con misure specifiche menzionate ove necessario.

1. Coltura vegetale

1. Sterilizzare i semi di riso decorticati con etanolo al 70% per 1 minuto, quindi con ipoclorito di sodio al 40% (NaClO) per 1 ora. Quindi, sciacquare i semi 5 volte con acqua sterile per rimuovere il cloro residuo.
2. Placcare i semi in modo asettico su 1/2 MS di terreno (2,37 g/L Murashige e Skoog (MS) mezzo, 30 g/L di saccarosio, 2,1 g/L di fitagel, pH 5,7, in autoclave).
   1. Nel metodo della guaina di riso, placcare direttamente i semi nel recipiente di vetro sterile con mezzo MS.
   2. Nel metodo del disco fogliare, placcare i semi su piastre MS per 5-7 giorni e trapiantarli nella matrice di crescita o nel terreno (Figura 1A).
3. Coltiva le piantine in una stanza di crescita con un fotoperiodo di 12 ore di luce / 12 ore di buio.

2. Preparazione e pretrattamento dei tessuti

1. Guaina di riso
   1. Tagliare la guaina delle piantine di riso di 10 giorni in segmenti di 3 mm con una lama affilata o una lama chirurgica per il pretrattamento 1 giorno prima del test ROS (Figura 1B).
   2. Collocare cinque segmenti di guaina in un singolo pozzetto di una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti contenente 100μL di ddH 2 O per 10-12 ore, al buio a 25 °C, che consente di ridurre la perdita di ioni correlata alle lesioni della ferita e le risposte di difesa (Figura 2).
      NOTA: Fare attenzione a mantenere i tagli verticali per garantire una superficie di taglio uniforme esposta alla soluzione di elicitazione è un passo importante per ottenere risultati altamente riproducibili. Spostate delicatamente i segmenti. Non effettuare ulteriori tagli o ferite sui segmenti, che potrebbero essere una fonte di variazione dei dati. In linea di principio, ogni test deve contenere almeno cinque repliche poiché la variazione del valore ROS è grande. Maggiore è il numero di repliche impostate, più affidabili sono i dati.
2. Disco foglia
   1. Tagliare i dischi fogliari (4 mm di diametro) dalle piante di riso di 4-6 settimane usando un punzone bioptico con uno stantuffo. Tagliare sempre i dischi foglia dal terzo centrale della seconda foglia (numerata dall'alto) della fresatrice principale per ridurre la variazione dei dati (Figura 1C).
   2. Posizionare un disco fogliare in un pozzetto individuale di una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti contenente 100μL di ddH 2 O per 10-12 ore per il pretrattamento, che consente di ridurre le risposte legate alle ferite in quanto potrebbero interferire con l'induzione di ROS da parte dei PAMP (Figura 2).
      NOTA: azionare delicatamente i dischi fogliari. Non eseguire ulteriori tagli o ferite sui dischi nell'esperimento, che potrebbero causare variazioni dei dati. L'induzione di ROS avviene principalmente dalle cellule del bordo tagliato, poiché le superfici dei tessuti di riso (foglie o guaine), sono ricoperte da strati idrofobici. Solo le celle dei bordi tagliati sono in contatto con la soluzione di elicitazione (fare riferimento alla sezione discussione).
   3. Mantenere tutti i dischi fogliari galleggianti, con la superficie abassiale rivolta verso l'alto, nei pozzetti di una piastra di microtitolazione per il pretrattamento dell'acqua per evitare variazioni associate al lato fogliare.

Figura 1: Le condizioni di crescita e le fasi delle piantine di riso per il campionamento della guaina e parti della guaina di riso e delle foglie di riso utilizzate nel test. (A) Le piantine di riso coltivate su mezzo 1/2 MS in condizioni sterili per 10 giorni possono essere campionate per il test ROS. I semi di riso sterilizzati sono stati coltivati su mezzo 1/2 MS e coltivati in un fotoperiodo di 12 ore di luce / 12 ore di buio in fiala di vetro trasparente, 8,5 cm di diametro e 15 cm di altezza. (B) Schema delle parti di campionamento delle guaine fogliari. Le guaine fogliari sono state tagliate da piantine di riso di 10 giorni. Le posizioni delle guaine fogliari erano sopra le radici e sotto la prima foglia. (C) Schema della posizione di campionamento dei dischi fogliari. I dischi fogliari possono essere tagliati dal terzo medio della seconda foglia (contare dall'alto) del timone principale delle piante di riso sane in qualsiasi fase di crescita. Abbreviazioni: ROS = specie reattive dell'ossigeno; MS = Murashige e Skoog. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Schema della configurazione della piastra per misurare la produzione di ROS con diverse linee di Oryza sativa. Pretrattamento e test dei tessuti di riso utilizzando una piastra a 96 pozzetti. Linea 1, Linea 2 e Linea 3 (fino a otto linee su un piatto) possono essere qualsiasi materiale di interesse, diverse cultivar, mutanti o linee transgeniche. I tessuti sono stati stimolati con soluzioni di elicitazione con PAMP (PAMP, bianco) o senza PAMP (ddH₂O, grigio) per misurare la risposta ROS. Va notato che più sono i campioni da testare, più lungo è l'intervallo di tempo tra le letture. Abbreviazioni: ROS = specie reattive dell'ossigeno; PAMP = pattern molecolare associato ai patogeni; ddH₂O = acqua bidistillata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

3. Preparazione della soluzione di elicitazione

1. Sciogliere la polvere di L-012 in 20 mM (6,23 mg/ml) di soluzione acquosa con ddH₂O per ottenere la soluzione madre. Quindi, diluire la soluzione madre con tampone Tris HCl da 50 mM (pH 7,5) per ottenere la soluzione di lavoro alla concentrazione finale di 500 μM L-012. Conservare la soluzione madre congelata e diluire alla soluzione di lavoro prima dell'uso.
2. Preparare la soluzione di elicitazione contenente PAMP, L-012 e perossidasi di rafano (HRP; 10 mg/ml in ddH₂O). Per una soluzione di elicitazione da 10 ml, miscelare 9,4 mL di soluzione di Tris HCl (pH 7,5) da 50 mM, 400 μL di soluzione di L-012, 100 μL di HRP e 100 μL di flg22 (PAMP; 10 mM in ddH₂O). Per il controllo negativo, aggiungere 100 μL di ddH₂O invece di PAMP.
   NOTA: Conservare le soluzioni di elicitazione preparate a temperatura ambiente per evitare stress da freddo ai tessuti di riso. Altri PAMP possono anche essere utilizzati per il trattamento come richiesto, come la chitina (20 ng / ml in concentrazione finale). Poiché L-012 è sensibile alla luce, coprire tutti i tubi contenenti la soluzione di L-012 con un foglio di alluminio.

4. Avvio del software e impostazione del protocollo con il lettore di micropiastre di riferimento (vedere Tabella dei materiali)

NOTA: L'impostazione dei parametri del software del lettore di micropiastre richiede del tempo. Si consiglia di preparare la macchina e il protocollo (un clic per procedere) prima di aggiungere la soluzione di elicitazione.

1. Avviare il software. Fare clic sul pulsante Esperimenti per creare un nuovo protocollo o utilizzare un protocollo esistente.
2. Fare clic su Procedura nel popup per impostare la piastra. Selezionare i pozzetti dalla piastra da monitorare.
3. Fare clic su Start Kinetic per impostare il tempo di esecuzione totale e l'intervallo di lettura. Impostare il tempo di esecuzione su 35 minuti o più, a seconda dei requisiti sperimentali. Per ottenere letture il più frequentemente possibile, selezionare Intervallo minimo. Per il tempo di integrazione, scegliere 1 s o più, a seconda dell'intensità del segnale.
   NOTA: l'intervallo di lettura dipende dal numero di campioni e dalla durata dell'integrazione del segnale.
4. Fai clic su Convalida | OK per confermare le impostazioni.
5. Fare clic su Rileva la nuova piastra nel pop-up e attendere che il software richieda la finestra di dialogo della piastra di carico. Posizionare la piastra da testare sul supporto.
6. Fermati qui per aspettare che venga stabilito il sistema di elicitazione (nella prossima sezione). Non appena il sistema di elicitazione è pronto, clicca su Esegui per avviare la lettura.

5. Stabilire il sistema di elicitazione e misurare la produzione di ROS in tempo reale

1. Rimuovere con cautela il ddH₂O dai pozzetti contenenti i tessuti pretrattati, evitando danni tissutali o disseccamenti.
2. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 μL della soluzione di elicitazione ai pozzetti contenenti i tessuti.
3. Agitare delicatamente per mescolare. Fare clic su Esegui per avviare il rilevamento.
   NOTA: Con il trattamento PAMP, i tessuti vegetali rispondono e producono ROS molto rapidamente. Pertanto, si suggerisce di trattare prima il controllo negativo senza PAMP per ridurre il tempo di funzionamento, quando ci sono più trattamenti. Operare il più rapidamente possibile per ridurre il ritardo di elicitazione tra i trattamenti. Più breve è il tempo tra l'aggiunta della soluzione di elicitazione e l'inizio del rilevamento, migliore sarà l'acquisizione di importanti dati sperimentali.

Qui, prendiamo il materiale di riso come esempio per determinare il ROS prodotto con il trattamento flg22. La generazione di ROS dopo l'elicitazione è transitoria. Nel riso, l'aumento della produzione di ROS è stato rilevato per la prima volta in 1-2 minuti, ha raggiunto il picco a 10-12 minuti ed è tornato alla linea di base in ~ 30-35 minuti (Figura 3). Rispetto al test di controllo, in cui il PAMP era assente nella soluzione di elicitazione con conseguente assenza di induzione evidente di ROS, è stato indotto uno specifico burst ROS solo quando la soluzione di elicitazione contenente flg22 o altri PAMP, come la chitina. Nel frattempo, la quantità totale di ROS può essere calcolata dalla curva (Figura 4).

Figura 3: Induzione dei ROS nei tessuti di riso. (A) Dischi fogliari (4 mm di diametro) e (B) guaine lunghe 3 mm sono stati utilizzati per indurre ROS da flg22. La generazione di ROS viene monitorata per 35 minuti. Le barre indicano le medie di SD calcolate da cinque ripetizioni tecniche. I dati di lettura sono stati importati in un foglio di calcolo. Applicare le formule "AVERAGE" e "STDEV. P" al set di dati per calcolare rispettivamente il valore medio e l'errore standard dalle repliche per ciascun punto dati. Quindi, le curve sono state generate dai valori ROS (valore medio ed errore standard). Abbreviazioni: ROS = specie reattive dell'ossigeno; FLG22 = peptide flagellinico di 22 amminoacidi; ddH₂O = acqua bidistillata; RLU = unità di luminescenza relativa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: La quantità totale di ROS generata con la guaina. La quantità totale di ROS viene solitamente calcolata dalla curva ottenuta dal test. Gli importi totali di ROS mostrati qui sono stati calcolati dalla curva corrispondente alla figura 3A. Per ottenere la quantità totale di valori ROS, applicare la formula "= (y̅ _n+ _{n + 1}) × intervallo di tempo/2" ai set di dati corrispondenti per calcolare il ROS generato in ogni intervallo di tempo, che può essere combinato applicando la formula "SOMMA" per calcolare l'importo totale generato. Abbreviazioni: ROS = specie reattive dell'ossigeno; FLG22 = peptide flagellinico di 22 amminoacidi; ddH₂O = acqua bidistillata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Produzione di ROS nelle celle esposte del tagliente. Una singola metà intera o due di un disco fogliare sono state poste nei pozzetti di una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti, pretrattata con 100 μL di ddH₂O per 10-12 ore, e quindi trattata con flg22 per l'induzione ROS. I valori di lettura dei due campioni del mezzo disco sono molto più alti di quelli dell'intero disco fogliare (A). In media, i valori totali dei due campioni di mezzo disco sono ~ 1,6 volte quelli dell'intero disco fogliare (B), che è proporzionale alla lunghezza del bordo, non all'area, dei campioni. Questo risultato supporta che i ROS sono generati principalmente nelle cellule nel sito della ferita. Abbreviazioni: ROS = specie reattive dell'ossigeno; FLG22 = peptide flagellinico di 22 amminoacidi; ddH₂O = acqua bidistillata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Lo scopo di questo studio era quello di stabilire un metodo altamente efficiente per quantificare la produzione precoce di ROS in risposta al PAMP nei tessuti di riso. Questo metodo fornisce una procedura standardizzata per la determinazione in tempo reale dei ROS apoplast prodotti da tessuti di riso trattati. Questo metodo è semplice nel funzionamento, a basso costo, chiaro nella composizione e indipendente dai kit commerciali. Utilizzando questo metodo, i ricercatori possono studiare la produzione in tempo reale di ROS apoplast quando le piante sono sottoposte a stress biotici o abiotici.

In questo protocollo, L-012 è stato scelto come reagente di chemiluminescenza in quanto è una sostanza chimica non tossica. Il luminolo è ampiamente utilizzato nei saggi di chemiluminescenza per rilevare la produzione di ROS. Tuttavia, ci sono tre inconvenienti con il luminol, che lo rendono inadatto per il rilevamento di ROS nel riso e in altri tessuti vegetali: scarsa solubilità in acqua, breve durata della risposta e pH di reazione dura. Il luminolo produce luce solo in condizioni alcaline, con un pH ottimale a 9,5, che è troppo duro per le cellule vegetali e induce risposte indesiderate. Inoltre, il luminol possiede un'efficienza di emissione luminosa molto inferiore a quella di L-012, che possiede la più alta sensibilità luminescente in condizioni fisiologiche, a pH neutro o quasi neutro. Pertanto, L-012 è sempre più utilizzato nei tessuti viventi o nei sistemi cellulari per rilevare la produzione di ROS.

La produzione di ROS nella risposta PTI è influenzata da molti fattori interni o esterni. Pertanto, la variazione nell'induzione ROS nella risposta PTI è ampia. Per eliminare il più possibile le variazioni, questo protocollo adotta misure per controllare saldamente le condizioni di prova. In primo luogo, un sistema tampone Tris-HCl da 50 mM è stato applicato alla soluzione di elicitazione nel protocollo. Sebbene alcuni ricercatori utilizzino sistemi senza buffer per testare la produzione di ROS, abbiamo scoperto che un sistema buffer ha prestazioni migliori rispetto alla coerenza e alla riproducibilità dei dati e una migliore linea di base nel gruppo di controllo. In secondo luogo, gli autori suggeriscono vivamente di prelevare campioni nel modo più coerente possibile.

L'incoerenza tra i tessuti è una delle principali fonti di variazione dei dati. Questo protocollo raccomanda di scegliere tessuti dalla stessa posizione della stessa foglia (numero) o guaina di piante sane nelle stesse condizioni di coltura. Tagliamo sempre i dischi fogliari dal terzo medio della seconda foglia (numerata dall'alto) del timone principale e manteniamo la coerenza tra diversi gruppi sperimentali o diversi genotipi. Quando si utilizza la guaina come tessuto di prova, il taglio della guaina deve essere mantenuto verticale durante il processo di campionamento. Se il taglio è obliquo, l'area della ferita risultante non può essere mantenuta coerente, il che porterà a risultati sperimentali instabili. In terzo luogo, i tessuti devono essere operati delicatamente e pretrattati allo stesso modo. Ferite o lesioni sui tessuti in esame dovrebbero essere evitate, poiché le ferite espongono più cellule alla soluzione di elicitazione, il che comporterà senza dubbio una variazione dei dati. Come mostrato nella Figura 5, l'elicitazione dei ROS è principalmente attribuita alle cellule esposte. Inoltre, il valore della produzione di ROS sarà drasticamente ridotto quando si verificano nuovi danni poco prima della lettura.

Un altro fattore importante da considerare quando si rileva la produzione in tempo reale di ROS da parte dei tessuti vegetali è l'effetto dell'orologio circadiano. Abbiamo notato differenze nei valori di lettura in diversi momenti della giornata. È stato dimostrato che l'orologio circadiano può influenzare la produzione e la risposta dei ROS, nonché la regolazione trascrizionale dei geni correlati ai ROS. Il livello di ROS fluttua durante il giorno, raggiungendo un picco a mezzogiorno e scendendo a mezzanotte¹⁴. In sintesi, questa procedura ad alto rendimento consente il rilevamento simultaneo di più campioni, che può aiutare a evitare l'effetto dell'orologio circadiano sulla produzione di ROS. Per ottenere risultati riproducibili, si consiglia di eseguire repliche biologiche alla stessa ora del giorno.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Shanghai Natural Science Foundation (numero di sovvenzione: 21ZR1429300 / BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (programma Agri-X, numero di sovvenzione: AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (numero di sovvenzione: ZXWH2150201 / 001) a Jiangbo Fan, e dal progetto di collaborazione medico-ingegneristica della Shanghai Jiao Tong Univesity (numero di sovvenzione: 21X010301734) a Can Li.