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* Questi autori hanno contribuito in egual misura
Descriviamo un protocollo di inoculazione ritardata per generare infezioni croniche delle ferite nei topi immunocompetenti.
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è un grave agente patogeno nosocomial e crescente rilevanza per la salute umana e le malattie, in particolare nell'impostazione di infezioni croniche delle ferite nei pazienti diabetici e ricoverati in ospedale. Vi è un'urgente necessità di modelli di infezione cronica per aiutare nello studio della patogenesi delle ferite e nello sviluppo di nuove terapie contro questo agente patogeno. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza l'inoculazione ritardata 24 ore dopo la ferita escissionale a tutto spessore. L'infezione della matrice provvisoria della ferita presente in questo momento previene la rapida staccazione o la diffusione dell'infezione e stabilisce invece un'infezione cronica della durata di 7-10 giorni senza la necessità di impiantare materiali estranei o di soppressione immunitaria. Questo protocollo imita un tipico decorso temporale di infezione post-operatoria negli esseri umani. L'uso di un ceppo luminescente di P. aeruginosa (PAO1:lux) consente una valutazione giornaliera quantitativa del carico batterico per le infezioni da ferite da P. aeruginosa. Questo nuovo modello può essere uno strumento utile nello studio della patogenesi batterica e nello sviluppo di nuove terapie per le infezioni croniche della ferita P. aeruginosa.
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è un batterio a forma di asta Gram-negative con crescente rilevanza per la salute umana e la malattia. È responsabile di un'estesa morbilità e mortalità in contesti nosocomiali, in particolare per quanto riguarda le infezioni delle ferite nei pazienti immunocompromessi1,2. L'emergere di ceppi multifarmacoresistenti di questo agente patogeno ha fornito ulteriore impulso per l'indagine sui fattori che contribuiscono alla virulenza Di P. aeruginosa, i meccanismi della resistenza agli antibiotici P. aeruginosa e nuovi metodi per la prevenzione e il trattamento di questa infezione mortale3. Di conseguenza, la necessità di modelli animali di infezione da ferite croniche come strumenti per studiare queste domande di ricerca non è mai stata maggiore.
Purtroppo, molti modelli animali di infezione da P. aeruginosa tendono a simulare l'infezione acuta con rapida risoluzione dell'infezione o il rapido declino a causa della sepsi4,5, che non simula adeguatamente la natura spesso cronica di queste infezioni. Per risolvere questo inconveniente, alcuni modelli utilizzano l'impianto di corpi estranei come perline di agar, impianti in silicone o gel alnati6,7,8. Altri modelli utilizzano topi immunocompromessi a causa dell'età avanzata, dell'obesità o del diabete, o attraverso mezzi farmacologici come la neutropenia indotta da ciclofosofe9,10,11,12. Tuttavia, l'uso di materiali estranei o di ospiti compromessi immunitari probabilmente altera il processo infiammatorio locale, rendendo difficile comprendere la fisiopatologia coinvolta nelle infezioni croniche delle ferite negli ospiti con sistemi immunitari altrimenti normali.
Abbiamo sviluppato un modello cronico di infezione da ferita da P. aeruginosa nei topi che comporta un'inoculazione ritardata con batteri dopo la ferita escisazionale. L'inoculazione ritardata consente esperimenti che valutano il carico batterico che si estende ad almeno 7 giorni. Questo modello apre nuove opportunità per studiare sia la patogenesi che i nuovi trattamenti delle infezioni croniche di P. aeruginosa.
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Stanford University.
1. Preparazione e crescita dei batteri
2. Preparazione della procedura
3. Rimozione dei capelli
4. Chirurgia della ferita escissione a tutto spessore
5. Inoculazione con P. aeruginosa
6. Immagini in vivo di ferite infette
7. Gestione postoperatoria
8. Escissione della ferita
Utilizzando un ceppo luminescente di PAO1 con un plasmide che codifica il luxABCDE reporter system (PAO1:lux), abbiamo eseguito la ferita eccisionale sui topi, inoculato queste ferite con planctonico P. aeruginosa 24 h più tardi, e onere batterico nel tempo(Figura 1 e Figura 2). Un'immagine rappresentativa ottenuta utilizzando un sistema ottico di imaging dimostra che questo modello produce luminescenza rilevabile (Figura 3A). L'infezione ha raggiunto il picco al terzo giorno di inoculazione e ha continuato 7 giorni dopo l'inoculazione sulla base sia della bioluminescenza che dei conteggi delle nestici(Figura 3B–C). Utilizzando questo modello, siamo in grado di generare in modo affidabile ferite della durata di 7-10 ay a seconda del ceppo di batteri e dello sfondo del topo. La coltura dei batteri isolati dalla ferita ha mostrato che la CFU/ferita quantificata era correlata alla luminescenza rilevata (Figura 3D). Infine, nonostante l'infezione da P. aeruginosa dimostrabile e quantificabile, i topi sopravvissero per almeno 7 giorni. Anche se c'era iniziale perdita di peso rapida subito dopo l'infezione, iniezioni saline e nutrizione supplementare ha portato al ripristino del peso (Figura 3E). Infine, abbiamo calcolato la dose di inoculazione alla quale il 50% delle ferite sarebbe stato infettato in modo sostenibile da PAO1. Il valore Calcolato iC50 era di 7,7 USD x 102 CFU/mL. Dosi superiori a 104 CFU/mL hanno provocato un tasso di infezione del 100% (Figura 3F). Questi risultati sono stati adattati dai dati pubblicati in precedenza13.
Figura 1: Schematico raffigurante il modello di infezione della ferita a grande spessore excisionale con inoculazione ritardata con bioluminescente P. aeruginosa. Streak PAO1:lux il giorno -2. Selezionare una colonia il giorno -1 e crescere durante la notte in brodo LB. Eseguire un intervento chirurgico di ferita excisionale il giorno -1. Il giorno 0, inoculare con PAO1:lux iniettando nel letto della ferita attraverso la medicazione pellicola trasparente. Eseguire l'imaging di bioluminescenza dopo l'inoculazione. Ripetere l'imaging ogni giorno fino al giorno 7-10. Il giorno 7-10, sacrifica gli animali e raccogli le ferite. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema della chirurgia escissionale delle ferite. Dopo la depilazione e la sterilizzazione della pelle con alcol e betadina, utilizzare un punzone biopsia di 6 mm per fare un'incisione iniziale attraverso l'epidermide del dorsum sinistro e destro. Utilizzare forbici e pinze per rimuovere gli strati dermici ed epidermici. Lavare con PBS. Coprire con una medicazione chiara. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'infezione da ferita da P. aeruginosa può essere rilevata attraverso 7 giorni di infezione. (A) Immagine rappresentativa di un topo infettato da PAO1:lux con sovrapposizione di bioluminescenza su ferite escissionali. (B) Segnale luminescente che riflette il carico batterico della ferita. N - 6 ferite. Inoculazione: 105 CFU/mL PAO1. (C) Analisi lineare di regressione del segnale luminescente in vivo e della CFU batterica delle ferite infettate da PAO1:lux, raccolta 4-7 giorni dopo l'inoculazione con 105 CFU/mL per consentire una serie di oneri batterici. (D) Il carico batterico nella CFU/ferita nel tempo nei topi infettati da 105 CFU/mL PAO1:lux. (E) Cambio di peso (relativo al peso prima dell'intervento chirurgico di escissione della ferita su T -1) N Sono raffigurati boxplot per 5-95 percentile. Le statistiche sono bidirezionali a Nova corrette con il confronto multiplo di Sidak. (F) Analisi di regressione non lineare del tasso di infezione della ferita utilizzata per calcolare l'IC50 per PAO1 tre giorni dopo l'inoculazione. Tutti i grafici sono rappresentativi di esperimenti n-3. Questa cifra è stata modificata da Sweere et al. 201913. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Abbiamo sviluppato un nuovo modello di infezione della ferita P. aeruginosa ritardata. La strategia di ritardare l'inoculazione con i batteri fino a 24 h dopo il ferimento eccisionale consente la valutazione delle infezioni della ferita in un lasso di tempo di 1 settimana. Utilizzando un ceppo luminescente di P. aeruginosa, è possibile monitorare la progressione dell'infezione durante il corso di infezione. Il più lungo decorso dell'infezione rispetto ad altri modelli di infezione da P. aeruginosa permetterà nuove opportunità per studiare le interazioni ospite-patogeno e nuove terapie che prendono di mira le infezioni da ferite da P. aeruginosa. Ad esempio, abbiamo già usato questo modello per dimostrare il ruolo del batteriofago Pf nello stimolare una risposta immunitaria antivirale che permette a P. aeruginosa di eludere il sistema immunitario ospite14.
L'inclusione di 24 h di tempo di recupero tra la chirurgia della ferita escisazionale e l'inoculazione batterica è un passo critico in questo modello di infezione della ferita. Permette agli animali di riprendersi dall'intervento chirurgico della ferita prima di essere infettati, che probabilmente svolge un ruolo nella loro capacità di sopravvivere attraverso almeno 7 giorni. Inoltre, supporta la formazione di una matrice provvisoria della ferita prima dell'inoculazione, che, in combinazione con la pellicola trasparente, fornisce un ambiente favorevole alla formazione di biofilm. Abbiamo eseguito una serie di esperimenti esplorativi durante lo sviluppo di questo modello esaminando diverse quantità di tempo tra ferimento e inoculazione. Nella nostra esperienza, l'inoculazione immediata dopo il ferimento spesso provoca sepsi e morte. Al contrario, l'inoculazione a 48 ore e successivi punti temporali ha portato a livelli inaccettabili di eterogeneità tra i topi e tra le ferite sullo stesso topo. Come evidente nella Figura 3A, ci può essere ancora un certo grado di eterogeneità prevista nel carico batterico di ferite infette, anche con l'inoculazione ritardata 24 ore. Un modo per compensare questo è quello di utilizzare più animali in ogni esperimento.
Un aspetto unico di questo protocollo è l'escissione di due ferite in modo indipendente piuttosto che piegare la pelle lungo la linea mediana e perforare per creare due ferite bilaterali, come avviene in alcuni altri modelli di ferita. Abbiamo scoperto che questo metodo di piegatura era efficace anche per produrre ferite simmetriche con margini puliti. Tuttavia, i topi trattati in questo modo in genere sono diventati settici rapidamente dopo l'inoculazione batterica e sono morti. Crediamo che questo possa essere dovuto al fatto che questo metodo di piegatura rimuove il dermal Panniculus carnosus - un sottile strato di muscolo alla base della pelle dei topi che non è presente negli esseri umani. Ipotizziamo che questa barriera possa aiutare a prevenire la diffusione batterica.
Una componente importante di questo protocollo è la rimozione dei peli sufficiente dal sito chirurgico, in quanto i capelli in eccesso potrebbero fornire un nidus per la superinfezione e interferisce con l'aderenza della medicazione trasparente pellicola. Abbiamo scoperto che la rasatura oltre alla crema per la rimozione dei peli fornisce la rimozione ottimale dei peli con un'irritazione minima della pelle, anche se lavare accuratamente la crema con acqua tiepida è ancora importante.
Un altro fattore integrale è il supporto nutrizionale, idratazione, e il controllo del dolore durante i primi giorni del corso postchirurgico e infezione. Per risolvere questo problema, amministriamo 500 l di cloruro di sodio sottocutaneo 0,9% il giorno -1 e 0, quindi 250 l il giorno 1 e 2. Forniamo anche un integratore di gel liquido multivitaminico e calorico al momento della chirurgia della ferita excisionale. Come illustrato nella Figura 3E, queste misure consentono un adeguato recupero del peso entro il terzo giorno. Per quanto riguarda l'analgesia, abbiamo scoperto che il rilascio sostenuto 0,5 mg/kg di buprenorphine somministrato prima della chirurgia della ferita excisionale fornisce un controllo del dolore sufficiente per 72 h, ma possono essere somministrate dosi aggiuntive se giustificate in base ai risultati di disagio in ogni singolo topo.
Anche se un modello di infezione da ferita da P. aeruginosa che si estende a 7-10 giorni è un vantaggio significativo rispetto ai modelli più acuti di infezione, questo potrebbe ancora non essere sufficiente per rispondere ad alcune domande di ricerca che coinvolgono più infezioni croniche. Uno dei motivi di questa limitazione è che il segnale luminescente del ceppo PAO1:lux di P. aeruginosa raggiunge il giorno 2–3 (Figura 3B). Dopo 7 giorni il segnale luciferasi può diventare inaffidabile. Per questo motivo, quantifichiamo i batteri placcando gli effluenti delle ferite su piastre LB e contando le CFU per confermare l'infezione di ogni ferita alla fine dell'esperimento. Un altro possibile svantaggio di questo modello è il requisito di un sistema di imaging in vivo, a cui alcuni laboratori potrebbero non avere accesso. Un modo per aggirare questo ostacolo è quello di utilizzare ceppi batterici di tipo selvatico non luminescente. Questo permette ancora al ricercatore di sfruttare questo modello di infezione cronica e, come indicato sopra, i batteri CFU possono essere quantificati alla fine dell'esperimento.
Abbiamo descritto un nuovo modello di inoculazione ritardata dell'infezione da ferita da P. aeruginosa che consente esperimenti che si estendono fino a 7-10 giorni. Questo modello servirà come uno strumento utile per valutare l'interazione ospite-patogeno con P. aeruginosa, così come lo sviluppo di nuove terapie. Questo modello ha il potenziale per molteplici direzioni future, tra cui l'adattamento per altri patogeni della ferita come lo Staphylococcus aureus, così come le infezioni polimicrobiche tra cui P. aeruginosa combinate con altri patogeni.
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da divulgare.
Il vettore di costruzione luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 è stato un dono gracile di J. Hardy. Gli schemi sono stati creati con BioRender.com. Ringraziamo il laboratorio di G. Gurtner per i loro consigli sul modello di infezione da ferita. Ringraziamo anche T. Doyle dello Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging per la sua esperienza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni R21AI13370, R21AI13340, R01AI12492093, e le sovvenzioni di Stanford SPARK, il Falk Medical Research Trust e la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) a P.L.B. C.R.D è stata supportata da T32AI0007502. Una Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering e una Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinary Graduate Fellowship hanno supportato J.M.S.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.9% Sodium Chloride injection | Hospira | 2484457 | |
18 G x 1 sterile needle | BD | 305195 | |
25 G x 1 1/5 sterile needle | BD | 305127 | |
Alcohol swab | BD | 326895 | |
Aura Imaging Software | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
Betadine | Purdue Frederick Company | 19-065534 | |
Buprenorphine SR LAB | Zoopharm | n/a | |
C57BL/6J male mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Disposable biopsy punch, 6mm | Integra | 33-36 | |
Fine scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | |
Glass Bead Dry Sterilizer | Harvard Apparatus | 61-0183 | |
Granulated Agar | Fisher BioReagents | BP9744 | |
Heating Pad | Milliard | 804879481218 | |
Insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
Lago X Imaging System | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
LB broth | Fisher BioReagents | BP1426 | |
Leur-Lok 1 mL syringe | BD | 309628 | |
Mini Arco Animal Trimmer | Wahl Professional | 919152 | |
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil | Church and Dwight | n/a | Available at any pharmacy |
Octagon Forceps | Fine Science Tools | 11041-08 | |
Petri dish | Falcon | 351029 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x | Corning | 21-040-CV | |
Press and Seal Cling Wrap | Glad | n/a | |
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle | BD | 305934 | |
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW | BD | 305934 | |
Scale | Ohaus Scout Pro | SP202 | |
Supplical Nutritional Supplement | Henry Schein Animal Health | 29908 | |
Tegaderm, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
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