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Questo protocollo consente l'ottimizzazione e la successiva generazione efficiente di frazioni nucleari e citoplasmiche dalle cellule leucemiche linfocitiche croniche primarie. Questi campioni sono utilizzati per determinare la localizzazione delle proteine e i cambiamenti nel traffico di proteine che si svolgono tra i compartimenti nucleari e citoplasmatici dopo la stimolazione cellulare e il trattamento farmacologico.
L'esportazione nucleare di macromolecole è spesso deregolata nelle cellule tumorali. Le proteine soppressori del tumore, come il p53, possono essere rese inattive a causa della localizzazione cellulare aberrante che interrompe il loro meccanismo di azione. La sopravvivenza delle cellule lacofocitiche croniche (LLC), tra le altre cellule tumorali, è favorita dalla deregolazione dell'chiusura da nucleare a citoplasma, almeno in parte attraverso la deregolamentazione del recettore di trasporto XPO1 e l'attivazione Percorsi di segnalazione mediati da PI3K. È essenziale comprendere il ruolo delle singole proteine nel contesto della loro posizione intracellulare per ottenere una comprensione più profonda del ruolo di tali proteine nella patobiologia della malattia. Inoltre, l'identificazione dei processi alla base della stimolazione cellulare e del meccanismo d'azione di specifici inibitori farmacologici, nel contesto del traffico di proteine subcellulari, fornirà una comprensione più completa del meccanismo di azione. Il protocollo qui descritto consente l'ottimizzazione e la successiva generazione efficiente di frazioni nucleari e citoplasmiche dalle cellule leucemiche linfocitiche croniche primarie. Queste frazioni possono essere utilizzate per determinare i cambiamenti nel traffico di proteine tra le frazioni nucleari e citoplasmache durante la stimolazione cellulare e il trattamento farmacologico. I dati possono essere quantificati e presentati in parallelo con immagini immunofluorescenti, fornendo così dati robusti e quantificabili.
Il trasporto di macromolecole tra il nucleo e il citoplasma è stato a lungo stabilito per svolgere un ruolo chiave nella normale funzione cellulare ed è spesso deregolamentato nelle cellule tumorali1,2. Tale deregolamentazione può derivare da sovraespressione/mutazione delle proteine che controllano l'esportazione nucleare. Una di queste proteine Exportin-1 (XPO1), è un recettore di trasporto che esporta >200 proteine contenenti segnale di esportazione nucleare (NES) nel citoplasma del nucleo2. XPO1-cargos includono p53, membri della famiglia FOXO e IB, contribuendo alla loro inattivazione inibendo il loro meccanismo di azione1,2,3. Un'ulteriore dislocalizzazione delle proteine può verificarsi quando i segnali microambientali incidono sulle cellule tumorali, portando all'attivazione di vie di segnalazione intracellulari come il fosfatidil-inositolo-3-kinase (PI3K)/Akt percorso, con conseguente inattivazione dei membri della famiglia FOXO e successiva esportazione dal nucleo4,5. Tale cattiva localizzazione delle proteine soppressori tumorali è stata implicata nella progressione di un certo numero di tumori ematologici e solidi1,2,6.
Lo sviluppo di inibitori di piccole molecole per uso clinico in malignità ematologiche (leucemia mieloide acuta (AML)/CLL), che si legano e inibiscono selettivamente la funzione XPO1, sottolinea l'importanza di sviluppare tecniche appropriate per impatto degli agenti farmacologici sull'chiusura delle proteine tra i compartimenti nucleari e citoplasmamici6,7,8. Le tecniche di imaging sono avanzate in modo significativo consentendo l'identificazione delle proteine nei compartimenti subcellulari sulla stimolazione esterna dei trattamenti farmacologici, tuttavia, l'importanza di tecniche parallele robuste e di supporto è fondamentale per informare un pubblico scientifico della validità di un risultato.
I linfociti a riposo e le cellule cLL-B maligne isolate dai campioni di sangue dei pazienti rappresentano una sfida nella generazione di frazioni nucleari e citoplasmiche a causa dell'elevato rapporto nucleare: citoplasmaico. L'ottimizzazione delle condizioni sperimentali per generare dati sperimentali affidabili e affidabili è ovviamente fondamentale per pianificare futuri programmi sperimentali. Il metodo qui descritto consente la quantificazione delle proteine nelle frazioni nucleari e citoplasmiche e determina come queste proteine possono essere influenzate dalla stimolazione cellulare e/o dal trattamento farmacologico.
L'uso di campioni primari di pazienti affetti da CLL descritti qui è stato approvato dal West of Scotland Research Ethics Service, NHS Greater Glasgow and Clyde (UK) e tutto il lavoro è stato svolto in conformità con le linee guida approvate.
1. Isolamento delle cellule CLL dai campioni di sangue del paziente
2. Citometria di flusso delle cellule CLL
3. Preparazione delle frazioni subcellulari dalle cellule CLL
NOT: Quando si pianifica l'allestito sperimentale, includere un pozzo di cellule non stimolate/non trattate da cui è possibile generare l'estratto di cellule.
4. Analisi a valle delle frazioni subcellulari
NOT: In questo protocollo, l'analisi delle frazioni cellulari generate è stata effettuata mediante oscillazioni occidentali utilizzando protocolli standard, caricando numeri cellulari/corsie uguali (equivalenti a 10 dollari di proteine) per le frazioni nucleari e citoplasmiche.
Quando si pianificano esperimenti sulle cellule CLL primarie, se i saggi richiedono un gran numero di cellule (>50 x 106 celle), c'è una preferenza per utilizzare cellule CLL appena isolate, piuttosto che cellule crioconservate che richiedono scongelamento, tuttavia questo non è sempre possibile. Questo perché il processo di congelamento / disgelo può provocare la morte fino al 50% delle cellule CLL, anche se questo è dipendente dal campione. L'arricchimento delle cellule CLL con un WCC >40 x 106/mL utilizzando la centricazione della densità come descritto qui (passaggi da 1.3 – 1,5) consente un elevato recupero cellulare con elevata purezza (z 95%) delle cellule CLL primarie. Nel campione mostrato, è stato recuperato il WCC 177 x 106/mL: da un campione di sangue da 30 mL 5 x 109 cellule, che rappresenta una resa cellulare del 94% delle cellule totali. L'analisi di questo campione per citometria di flusso ha rivelato una purezza delle cellule CLL di >95% come indicato dalla doppia espressione superficiale dei marcatori di cella CLL CD19 e CD5 dopo l'analisi su FSC/SSC, singole cellule che erano DAPI negative (cellule vitali) (Figura 1).
L'ottimizzazione della procedura di frazionamento subcellulare è stata effettuata utilizzando una gamma di rapporti detergenti (da 1:20 a 1:60) durante la preparazione della frazione citoplasmatica (passaggio 3.4). Successivamente, sono state preparate le frazioni nucleari e i CL (rispettivamente i passaggi 3.5 e 3.6). Immunoblot sono stati eseguiti sulle frazioni risultanti della linea cellulare CLL MEC1 (Figura 2A) e cellule CLL primarie (Figura 2B). Le macchie sono state sondate per i marcatori di frazione Lamin A/C (nucleare; 74/63 kDa) e la tubulina z-tubulina (citoplasmaico; 55 kDa) per confermare la frazione cellulare di successo. La frazione indica che il livello di detergente ottimale per le cellule MEC1 è una diluizione 1:60 (Figura 2A), rispetto a una diluizione 1:30 ottimale per le cellule CLL primarie (Figura 2B), come indicato da un arricchimento di proteina nucleare e la mancanza di proteine citoplasmiche nelle frazioni e viceversa. I WCL rappresentano la proteina totale e fungono da controllo positivo per gli anticorpi utilizzati per sondare le frazioni subcellulari. È importante scegliere le proteine appropriate come marcatori di frazione: la figura 2C mostra immunoblot delle frazioni nucleari/citoplasmatiche preparate da cellule MEC1 in cui l'RNA polimerasi II (Rpb1 CTD; 250 kDa) e lamin A/C sono stati crollati come marcatori di frazioni nucleari, mentre la tubulina e la tubulina z (50 kDa) sono state usate come marcatori citoplasmatici. È chiaro che la zbulina è arricchita nel citoplasma tuttavia l'espressione è evidente nel nucleo, come mostrato in precedenza9.
Una volta ottimizzate le condizioni sperimentali, è possibile eseguire un esperimento. Negli esempi mostrati, la localizzazione subcellulare di FOXO1 nelle frazioni nucleari e citoplasmiche è stata determinata sulla stimolazione delle cellule con il recettore dell'antigene a cellule B (BCR) in presenza o assenza del doppio inibitore mTORC1/2 A-D8055, nelle cellule MEC1 ( Figura 3A) e celle CLL primarie ( Figura3B)5,10. In entrambi gli esempi, la generazione di frazioni nucleari e citoplasmatiche altamente arricchite è stata ottenuta come indicato dall'espressione quasi esclusiva di Lamin nella frazione nucleare e nella tubulina z-tubulina nelle frazioni citoplasmiche. In entrambi i tipi di cellule, l'espressione di FOXO1 è stata ridotta nel citoplasma dopo il trattamento con l'A-D8055 rispetto a NDC, accompagnata da un aumento dell'espressione FOXO1 nel compartimento nucleare, dimostrando così la traslocazione proteica (Figura 3). Per rimuovere la soggettività dell'interpretazione dei dati, sono stati quantificati singoli immunoblot da cinque campioni primari di LL sottopongo all'interno di frazioni subcellulari (passaggio 4; Figura 4A), utilizzando le rispettive proteine nucleari o citoplasmatiche come controlli di carico interni per ciascun campione e quindi normalizzando ogni frazione al controllo NON stimolato (US) nessun controllo dei farmaci (NDC), come indicato. Il grafico risultante mostra le tendenze del movimento FOXO1 tra le frazioni nucleari e citoplasmiche, con l'A-D8055 che riduce i livelli di espressione FOXO1 nel citoplasma, aumentando contemporaneamente l'espressione nel nucleo. Inoltre, un'elevazione nell'espressione citoplasmica FOXO1 è evidente sul collegamento bCR.
Tubo | Nome tubo | Celle/Perline | antigene m | Fluoroforo |
1 | Innocente | Cellule | Na | Na |
2 | Macchia singola | Perline | CD5 (in formato CD5) | Fitc |
3 | Macchia singola | Perline | CD19 (informazioni in stato INstato CD1 | PE-Cy7 |
4 | Macchia singola | Perline | CD23 (in formato CD23) | Apc |
5 | Macchia singola | Perline | CD45 (informazioni in stato indue) | APC Cy7 |
6 | Macchia singola | Cellule | attuabilità | Dapi |
7 | Macchie CLL | Cellule | CD5, CD19, CD23, CD45 e redditività | FITC, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 e DAPI |
Tabella 1: Tabella che mostra il set ideale di tubi campione necessari per la citometria di flusso delle cellule CLL. Ogni esperimento deve includere tutti i controlli appropriati per un'analisi accurata dei risultati ottenuti.
Figura 1: grafico dell'analisi della citometria del flusso rappresentativo dei pazienti arricchiti con CLL. Le cellule mononucleari-CLL arricchite dal sangue periferico di un singolo paziente a base di CoLl sono state gated utilizzando FSC-A contro SSC-A, e i doppietti sono stati poi esclusi utilizzando FSC-A vs FSC-H (A). Le cellule non colorate (tubo 1) e i controlli di compensazione (tubi 2-6) sono stati utilizzati per impostare il citometro di flusso per rilevare le cellule e compensare tra i canali fluorescenti, garantendo così che i segnali di fluorescenza siano stati rilevati correttamente. (B) Un esempio di colorazione negativa (cellule non colorate; tubo 1) nei canali di fluorescenza CD19 e CD5. Le cellule live (DAPI negativo) e le cellule positive CD45 sono state recintate (C) e la percentuale di CD19-CD5 (95,5%) (91,2%) cellule all'interno del DAPI-CD45è stata determinata popolazione (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Ottimizzazione della frazione nucleare/citoplasmaica. Le frazioni citoplasmache e nucleari, e le lismiari intere (WCL), sono state preparate da pellet cellulari (10 a 20 x 106 cellule) della linea cellulare CLL(A) MEC1 o(B)delle cellule CLL primarie arricchite dal sangue periferico dei pazienti Passo 3. L'ottimizzazione della frazione subcellulare è stata effettuata utilizzando una gamma di rapporti detergenti (da 1:20 a 1:60) durante la preparazione della frazione citoplasmatica (come descritto al punto 3.4). I campioni risultanti sono stati immunoblotted e sondati con anticorpi anticorpi anti-Lamin A/C (nucleare) e anti-tubulina (citoplasma) per confermare il successo della frazione cellulare insieme alla WCL. I marcatori di peso molecolare sono mostrati a sinistra della macchia (M). : indica le condizioni ottimali del detersivo per la lisi cellulare. (C) Immunoblot di frazioni nucleari e citoplasmatiche provenienti da cellule MEC1 con condizioni di controllo (NDC) o trattamento farmacologico (8055) in presenza di assenza di stimolazione (rispettivamente il collegamento incrociato di BCR). I blots sono stati sondati con anticorpi anti-Rbp1 CTD (clone 4H8; riconoscendo RNA polymerase II subunit B1), anti-Lamin A/C, anticorpi anti-tubulina o anti-zzbulina (clone GTU-88), per identificare le frazioni subcellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La frazione subcellulare dimostra l'chiusura di FOXO1 tra il nucleo e il citoplasma in CLL. (A) Le cellule MEC-1 e(B)le cellule CLL primarie sono state pretrattate per 30 min con 100 nM A'D8055 (8055) o lasciate non trattate (NDC) come indicato e quindi BCR è stato ligate per 1 h o lasciato dagli Stati Uniti. Le frazioni nucleari e citoplasmatiche sono state poi preparate e immunoblotte. Dopo la conferma della frazione mediante indagine con anticorpi anticorpi anticorpi anti-lamin A/C (nucleari) e anti-tubulina (citoplasma) anti-lamina, l'effetto sia del trattamento farmacologico che della legatura BCR è stato valutato sull'espressione della proteina FOXO1, utilizzando un anticorpo anti-FOXO1. M indica un marcatore di peso molecolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Un esempio elaborato di analisi quantitativa delle macchie occidentali (densitometria). (A) Densitometry è stato eseguito utilizzando il software di analisi western blot disponibile online. In breve, all'interno del nastro Di analisi, i rettangoli sono stati disegnati intorno alle bande proteiche nell'immagine per calcolare l'intensità del segnale. È raffigurata la densitometria di un'immagine commerciale rappresentativa di un campione di pazienti con CLL sottoposto a frazione citoplasmica/nucleare. Le frazioni citoplasmatiche e nucleari si distinguono per l'espressione di marcatori citoplasmatici (z-tubulina) e nucleari (Lamin A/C). L'espressione normalizzata di FOXO1 per una determinata condizione può essere calcolata dividendo il segnale ottenuto per FOXO1 per il segnale corrispondente per z-Tubulin o Lamin A/C, a seconda della frazione analizzata. L'espressione FOXO1 relativa (relativa al controllo del veicolo statunitense), può essere calcolata dividendo l'espressione FOXO1 normalizzata di una determinata condizione dall'espressione FOXO1 normalizzata del controllo veicolo statunitense di una determinata frazione cellulare. (B) Grafico che mostra i livelli di espressione FOXO1 nelle frazioni citoplasmatiche (sinistra) o nucleari (a destra) normalizzate al controllo US-NDC all'interno di ciascuna frazione cellulare. Il punto rosso sul grafico è l'esempio elaborato mostrato. Questi dati mostrano la variazione media della piega nell'espressione FOXO1 rispetto ai valori US-NDC - SEM. P sono stati determinati da studenti a due code abbinati t test. n - 5 campioni di pazienti cLL individuali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il protocollo descritto fornisce un metodo rapido ed efficiente per la generazione di frazioni nucleari e citoplasmatiche dalle cellule LL primarie e la successiva quantificazione del traffico di proteine tra le frazioni nucleari e citoplasmiche sulla stimolazione cellulare e il trattamento farmacologico. I dati presentati dimostrano la capacità di rilevare il traffico di proteine specifiche, ad esempio FOXO1, tra le frazioni nucleari e citoplasmiche, dopo il trattamento con un inibitore a doppio mTOR A-D8055 in presenza/assenza di BCR che si incrocia attraverso F( ab')2 stimolazione a frammentazione (Figura 3 e Figura 4 ). L'accoppiamento di questi esperimenti con la quantificazione delle macchie occidentali da singoli campioni di pazienti affetti da CLL, consente analisi obiettive dei dati generati e dimostra la robustezza dell'analisi descritta per quantificare i cambiamenti globali nella localizzazione delle proteine in Cellule CLL isolate dalle coorti dei pazienti (Figura 4). Dai dati è chiaro che una media di cinque campioni di pazienti nelle frazioni citoplasmiche ha raggiunto un significato quasi quasi significativo. Data l'eterogeneità clinica dei pazienti affetti da LLC11,queste analisi vengono normalmente eseguite su coorti di pazienti più grandi e/o focalizzate su sottogruppi prognostici specifici di pazienti per ottenere una comprensione più completa della risposta cellulare della CLL specifici trattamenti farmacologici.
I dati presentati dimostrano l'importanza di scegliere marcatori proteici che risiedono esclusivamente nelle frazioni citoplasmate o nucleari, poiché la purezza della frazione sarà confermata da questi marcatori. Per la conferma della frazione citoplasmica, fu scelta la tubulina e Lamin A/C come marcatore nucleare. Proteine aggiuntive comunemente utilizzate sono GAPDH e tubulina per identificare la frazione citoplasmica o Brg1 (SMARCA4), TFIID e RNA Polymerase II per la purezza della frazione nucleare4,5. Tuttavia, occorre prestare attenzione quando si scelgono proteine altamente arricchite in frazioni specifiche e non presenti in entrambe le frazioni (ad es. tubulina ztubulina) (Figura 2C)9. Infatti, GAPDH e actina, pur generalmente considerate proteine citoplasmiche possono localizzare al nucleo12,13, evidenziando l'importanza di scegliere un marcatore di frazione che non si ripoloche quando la stimolazione o il trattamento è applicato alle cellule. Inoltre, è importante confermare che il marcatore proteico scelto è espresso nella cellula di interesse eseguendo il WCL insieme alle frazioni subcellulari.
Nell'esperimento rappresentativo mostrato, lo stesso numero di cellule CLL è stato utilizzato per ogni condizione (stimolazione / trattamento farmacologico), e successivamente i campioni di frazione sono stati preparati immediatamente. Il caricamento di 10 g di proteine/lane frazionate fornisce materiale sufficiente per il rilevamento delle proteine di interesse. Poiché questi campioni sono stati sottoposti solo a un trattamento e stimolazione farmacologica a breve termine (fino a 4 h), si è ipotizzato che il livello di proteina sarebbe rimasto lo stesso in ogni campione e non è stato eseguito un test proteico. Tuttavia, se i trattamenti cellulari vengono estesi (18- 72 h), il livello di morte cellulare o proliferazione nelle cellule può alterare significativamente la qualità e la quantità di proteine estratte, a seconda della stimolazione farmaco/cellula applicata, alterando così i livelli di proteine nel trattamento /campioni stimolati. In questi casi per trattamenti farmacologici a lungo termine, è consigliabile effettuare la quantificazione delle proteine utilizzando un saggio Bradford o equivalente, prima del gonfiore occidentale per garantire che la stessa quantità di proteine venga eseguita in ogni corsia dell'immunoblot. La presenza di detergenti può interferire con specifici saggi proteici14, questa interferenza può essere ridotta diluindo campioni di proteine della frazione cellulare. Inoltre, utilizzare il buffer di lisi completo come vuoto, utilizzando la stessa diluizione come nei campioni in fase di test.
Per fornire prove a sostegno dei risultati qui descritti, è possibile eseguire esperimenti paralleli utilizzando la microscopia a fluorescenza per analizzare la posizione di FOXO1 all'interno delle cellule CLL per consentire la visualizzazione di questi risultati5. Inoltre, le frazioni subcellulari generate possono essere utilizzate anche per i saggi di attività enzimatica o l'analisi proteomica in ulteriori analisi a valle.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Natasha Malik per aver esaminato criticamente il manoscritto. Questo studio è stato finanziato da una sovvenzione del progetto Bloodwise assegnata ad AMM (18003). Le strutture di analisi FACS sono state finanziate dalla Fondazione Howat. La MWM è stata finanziata da un dottorato di ricerca presso il centro di ricerca Friends of Paul O'Gorman Leukaemia, JC è stato finanziato dal Centro di ricerca Friends of Paul O'Gorman Leukaemia e JH è stato finanziato da una sovvenzione per il progetto Bloodwise (18003).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
DMSO | Sigma | D2650 | |
EDTA | Sigma | EDS | |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
HyperPAGE 10 - 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge | |
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