Rilevamento e caratterizzazione dell'autoassemblaggio proteico in vivo da parte della Cytometria di flusso

Questo articolo descrive un protocollo di citometria di flusso basato su FRET per quantificare l'autoassemblaggio delle proteine nelle cellule S. cerevisiae e HEK293T.

L'autoassemblaggio delle proteine regola la funzione proteica e compartimenta i processi cellulari nello spazio e nel tempo. Gli attuali metodi per studiarlo soffrono di bassa sensibilità, letture indirette, velocità effettiva limitata e/o livello di popolazione piuttosto che risoluzione a cella singola. Abbiamo progettato una metodologia singola basata sulla citometria di flusso che affronta tutte queste limitazioni: Distributed Amphifluoric FRET o DAmFRET. DAmFRET rileva e quantifica gli auto-assemblaggi proteici con FRET a emissione sensibilizzata FRET in vivo, consente la distribuzione attraverso sistemi modello, dal lievito al lievito umano, e raggiunge put-out sensibili, monocellulari e ad alta velocità effettiva indipendentemente dalle proteine localizzazione o solubilità.

I saggi per studiare le interazioni delle proteine omotipiche, o "auto-assemblaggio" sono importanti perché lo stato oligomerico e la solubilità delle proteine determinano la loro funzione. Il proteoma abbonda di omo-multimers^1,2,3,4, mentre relativamente poche proteine funzionano come monomeri. Le proteine possono anche assemblare aberrantemente a causa di stress, età, o cattiva regolazione, portando a cambiamenti patologici nell'attività. Identificare i fattori che modulano tali eventi, o anche la natura fisica degli assiemi, è spesso eccezionalmente impegnativo.

Un numero crescente di proteine è ora riconosciuto per auto-assemblarsi con straordinaria cooperatività e stoichiometria indeterminata, con conseguente loro demixing da altri costituenti cellulari, come fasi ad alta densità proteica. Questi assumono la forma di condensati disordinati, come goccioline e gel, o filamenti altamente ordinati, come le fibre amiloidi. Le fluttuazioni conformazionali associate a quest'ultimo rendono la sua formazione iniziale, o nucleazione, intrinsecamente probabilistica al livello molecolare^5,6. Poiché la probabilità di nucleazione si adatta al volume, la formazione di tali assiemi può essere altamente stocastica nei confini spaziali delle cellule viventi^7,8. All'estremo della separazione di fase limitata alla nucleazione stocastica sono prioni, assemblaggi proteici altamente ordinati che solo raramente nucolono spontaneamente, ma una volta formati, modello la propria crescita a tempo indeterminato. Una di queste proteine, nota come ASC, esegue un interruttore digitale simile a un prione nell'attività delle cellule immunitarie innate dei mammiferi. L'autoassemblaggio ASC è nucleato dalla sua interazione con specifiche proteine che si sono oligomerizzate su modelli molecolari associati a patogeni o al pericolo. Le assemblee ASC a loro volta nucleate procaspase-1 si auto-assemblano e si attivano, portando alla maturazione della citochina e alla piroptosi della cella^9,10. La regione dell'ASC responsabile della sua assemblea appartiene alla superfamiglia del dominio della morte, che consiste di oltre cento membri del proteoma umano. Nonostante i ruoli fondamentali dei domini di morte nell'immunità innata e nella morte cellulare programmata, la maggior parte di essi non sono ancora stati caratterizzati rispetto all'auto-assemblaggio. La scoperta e la caratterizzazione di proteine aggiuntive con tale comportamento sarà notevolmente facilitata da una lettura diretta a singola cellula dell'autoassemblaggio delle proteine.

Gli approcci classici della biochimica delle proteine per studiare l'autoassemblaggio delle proteine, come la cromatografia delle dimensioni-esclusione e l'ultracentrifugazione, sono in gran parte limitati alle valutazioni del livello della popolazione. Tuttavia, l'eterogeneità tra celle risultante da transizioni di fase con cocillatura limitata non può essere modellata con questo livello di dettaglio. Gli approcci a singola cellula basati sulla microscopia a fluorescenza riacquistano questa capacità, ma non hanno la velocità effettiva necessaria per quantificare con precisione la nucleazione o per rilevare assiemi rari. Inoltre, gli auto-assemblaggi solubili come la maggior parte degli enzimi e degli oligomeri pre-amiloidi sono troppo piccoli e mobili per essere risolti mediante microscopia leggera standard. Possono essere rilevati da approcci più sofisticati come la spettroscopia di correlazione a fluorescenza, ma questi sono molto limitati nel numero di cellule e nella produttività.

I saggi basati sulla prossimità dell'assemblaggio proteico, come FRET e il completamento del fluooforo diviso, offrono una potenziale soluzione a questi problemi. Tuttavia, generalmente richiedono l'uso di due diversi costrutti che esprimono la proteina di interesse fusa a tag complementari, il donatore e il fluoroforo dell'accettatore nel caso di FRET. Ciò compromette la produttività sperimentale e riduce anche la sensibilità dovuta alla variazione da cellula a cellula nei livelli relativi di donatore e accettatore. Per aggirare questo, abbiamo progettato un saggio che impiega un fluoroforo fotoconvertibile, mEos3.1¹¹, che permette a un singolo costrutto di esprimere sia la proteina con etichettatrice donatore che quella accettatrice. Lo spettro di emissione di mEos3.1 non convertito (donatore simile a GFP) si sovrappone sufficientemente allo spettro di eccitazione di mEos3.1 (accettatore di tipo dsred) per consentire il verificarsi di FRET quando le molecole si trovano in stretta vicinanza (<10 nm). Così, esponendo le cellule a una dose empiricamente determinata di 405 nm di luce, che fotoconverte una frazione ottimale di mEos3.1 totale nella forma di accettazione, otteniamo livelli relativi coerenti e riproducibili di donatore e accettatore in più campioni, livelli di espressione ed esperimenti. Misuriamo la fluorescenza dell'acceleratore quando eccitati direttamente con una luce di 561 nm, o indirettamente (tramite trasferimento di energia dal donatore) con 488 nm di luce (cioè, emissione sensibilizzata FRET). Riportiamo l'assemblaggio proteico come il rapporto di questi due valori e lo chiamiamo anfifluorico FRET o AmFRET.

Al fine di calcolare la concentrazione di proteine per citometria di flusso, calcoliamo prima l'intensità media di fluorescenza di Spc42 etichettata con mEos3.1. Poiché le cellule di lievito contengono circa 1000 molecole di Spc42, calcoliamo quindi l'intensità di fluorescenza di una singola molecola fluorescente verde mEos3.1. Sfruttando la fotoconversione uniforme a tutte le concentrazioni cellulari (Figura 1E), correliamo quindi i valori totali di fluorescenza mEos3.1 per tutte le intensità dell'accettatore dopo la fotoconversione. Siamo quindi in grado di dividere il numero totale di talpe di proteine fluorescenti per il volume citosolico approssimativo (come determinato utilizzando la citometria del flusso di imaging) per ottenere la concentrazione citosolica totale della proteina di interesse. Per calcoli esatti, si prega di consultare il manoscritto originale⁸.

Esprimendo la proteina mEos3.1-fusa da un plisma 2o nel lievito, sondiamo una gamma di circa mille volte di concentrazione proteica in ogni campione⁸. Otteniamo lo stesso nelle cellule HEK293T in virtù della variazione nell'assorbimento del plasmide durante la trasfezione, e quindi il numero di copia variabile.

La distribuzione risultante di AmFRET, o DAmFRET, per molte migliaia di cellule rivela la dipendenza da concentrazione dell'auto-assemblaggio nel citosol per qualsiasi proteina di interesse. Nel complesso, DAmFRET rappresenta una metodologia abilitante per scoprire e caratterizzare l'auto-assemblaggio delle proteine con una combinazione senza precedenti di sensibilità, produttività e riproducibilità.

Mentre l'utilizzo di un citometro di imaging ci permette di ottenere misurazioni della concentrazione di proteine in vivo, tali citometri non sono ancora disponibili nella maggior parte degli istituti di ricerca. Tuttavia, DAmFRET può essere eseguito anche in un tipico citometro non di imaging per ottenere distribuzioni dell'assemblaggio delle proteine in una gamma di espressione proteica.

1. Preparazione di Saccharomyces cerevisiae per il saggio DAmFRET

1. Trasformare i ceppi di lievito rilevanti sperimentalmente con un plasmide indotbile di galactose di 2ose che esprime la proteina di interesse⁸ etichettata al capolinea C o N con mEos3.1 utilizzando un protocollo standard di acetato di litio¹² .
2. Coltivare il lievito nella coltura liquida.
   1. Per ogni proteina interrogativa, colonie di lievito inoculato (trasformate), in triplice copia, in 200 , ciascuna di 200 - luna di supporti di crescita non indurre appropriati (cioè supporti contenenti il 2% di decsomo, base di azoto del lievito e aminoacidi per la selezione del plasmide) in una piastra di 96 pozze ( Figura 1C).
   2. Incubare le cellule mentre si agita su uno shaker di piastra (vedi la tabella dei materiali) con 1,5 mm di orbita a 1200 rpm a 30 gradi centigradi per 16 h.
3. Indurre l'espressione del gene di interesse (protocollo rappresentativo per 16 h-alcune proteine possono richiedere più o meno tempo).
   1. Dopo 16 h di induzione, far girare la piastra a 2200 x g per 2 min a temperatura ambiente (RT0 per pelare i campioni.
   2. Rimuovere i supporti per inversione forte. Risospendere le cellule con 200 - L di supporti di induzione appropriati (cioè supporti contenenti 2% galactose, base di azoto lievito e aminoacidi per la selezione del plasmide). Vedere la figura 1C.
   3. Incubano le cellule agitando a 30 gradi centigradi per 12 h.
   4. Centrifuga (vedi tabella dei materiali) la piastra a 2200 x g per 2 min a RT per pellet i campioni. Rimuovere i supporti per inversione forte. Risospendere le cellule con 200 l del supporto di induzione.
   5. Incubano le cellule a 1200 giri/min a 30 gradi centigradi per altre 4 h. Questa sospensione in supporti freschi dovrebbe avvenire 4 h prima dell'esecuzione di DAmFRET, al fine di ridurre l'autofluorescenza.

2. Creazione di plasmidi mammiferi

1. Costruire un vettore di mammiferi che ha un promotore coniugale e mEos3.1 con un segnaposto per inserire il gene di interesse e un linker tra di loro.
   NOTA: Abbiamo costruito un vettore compatibile con cancello d'oro, M1, da un plasmide disponibile al pubblico (vedi Tabella dei materiali) con le seguenti modifiche: un sito BsaI esistente è stato rimosso da una mutazione punto da G ad A (alla posizione 3719 secondo il deposito sequenza). mEos3.1 è stato ottenuto utilizzando la mutagenesi site-directed del fluoroforo all'I157V. Siti BsaI invertiti seguiti da 4x (EAAAR) linker sono stati inseriti, dall'assemblea Gibson, in-frame tra CMV promoter e mEos3.1 per produrre il vettore M1 finale. L'espressione proteica è guidata dal potenziatore e promotore di CMV; e terminazione della trascrizione mediante segnale di poliadenilazione SV40.
2. Creare una libreria di inserti, compatibile con il vettore costruito.
   NOTA: ordiniamo i nostri inserti per l'assemblaggio Golden Gate come frammenti lineari sintetici (vedi tabella dei materiali) affiancati da siti BsaI per la legatura in M1 tra CMV promoter e 4x(EAAAR)-mEos3.1.

3. Coltura e trasfezione delle cellule mammaliane

1. Coltura HEK293T cellule in DMEM - 10% FBS - 1x PenStrep media a 37 s C al 5% CO₂.
2. Il giorno prima della trasfezione, il seme 5 x 10⁵ cellule in una piastra di 6 pozze con 2 mL di supporti.
3. Cellule transfetto con 2 g di DNA plasmide utilizzando una reagente di trasfezione (vedi la tabella dei materiali) con un rapporto di 3:1 (reagente di trasfezione:DNA). Mescolare i componenti in 150 l di supporti siero ridotti (si veda la Tabella dei Materiali) e incubarlo a RT per 15 min, aggiungere il mix ad ogni pozzo e incubare per 48 h per l'espressione proteica.
4. Confermare l'espressione proteica dopo 24 h mediante microscopia epifluorescenza (488 nm eccitazione, 515 nm di emissione).

4. Preparazione di cellule di mammiferi per il saggio DAmFRET

1. Dopo 48 h di espressione proteica, rimuovere i supporti da ogni pozzo e lavare con cura le cellule con 1 mL di 37 c. Dopo il lavaggio, aspirare il PBS.
2. Aggiungere 0,5 mL di acido trypsin-etilelenediaminetraacetic (EDTA) (0,25%) e incubare per 5 min a 37 gradi centigradi.
3. Aggiungere 0,5 mL di supporti DMEM completi a ogni pozzo, sospendere le celle e assicurarsi che non siano visibili grumi di grandi dimensioni.
4. Trasferire l'intero volume di ogni pozzo in tubi da 1,5 mL.
5. Ruotare le celle per 5 min a 1000 x g a temperatura ambiente (RT).
6. Rimuovere il pellet cellulare supernatante e resospendere in 1 mL di PBS - 10 mM EDTA.
7. Girare le celle per 5 min a 1000 x g a RT.
8. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL 4% paraformaldeide (PFA) - 10 mM EDTA in PBS.
9. Fissare le cellule per 5 min su un tavolo di agitazione con movimento costante.
10. Girare le celle per 5 min a 1000 x g a RT.
11. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS - 10 mM EDTA.
12. Girare le celle per 5 min a 1000 x g a RT.
13. Rimuovere il supernatante e risospendere nuovamente le cellule in un volume adeguato di buffer per la corsa di citometria (per 1 pozzetto di una piastra da 96 po' di 200 - L di PBS - 10 mM EDTA).
14. Trasferire le celle risospese su un pozzo di una piastra rotonda inferiore 96 pozze.

5. Fotoconversione di lieviti e cellule di mammiferi per l'analisi

1. Campioni fotoconvertiti in una micropiastra senza copertura utilizzando una lampada UV (vedi Tabella dei Materiali) dotata diun filtro da 320-500 nm (viola) e di un collimatore a fascio, posizionato 45 cm sopra la piastra, per una durata di 25 min durante la scossa. Queste condizioni sono appropriate quando la potenza del fascio allapiastra è di 11,25 mW/cm 2, con circa 17.000 mJ/cm² di dose totale di fotonionica⁸.

6. Raccolta dati DAmFRET

1. Sintonzia le cellule usando un citometro con laser non-collineari 488/561. I seguenti dati sono i requisiti minimi per il calcolo di FRET.
   1. Utilizzare un canale di emissione di 488 nm per la raccolta della fluorescenza del donatore.
   2. Utilizzare un canale di emissione di 488 nm per la raccolta della fluorescenza del segnale FRET.
   3. Utilizzare un canale di emissione di 561 nm per l'eccitazione/595 nm (non collineare con il canale 488/595) per la raccolta della fluorescenza dell'accettatore.
   4. Utilizzare un canale di emissione di 405 nm per la raccolta di autofluorescenza⁸.
   5. Utilizzare un canale di immagine brightfield per il calcolo del volume.
      NOTA:Le impostazioni del citometro di imaging per S. cerevisiae sono le seguenti:60x obiettivo a bassa portata e alta sensibilità; le potenze laser impostate su 405 nm a 15 mW, 488 nm a 15 mW, 561 nm a 20 mW.Imaging impostazioni del citometro per le cellule HEK293T sono i seguenti:obiettivo 40x a bassa portata e alta sensibilità; le potenze laser impostate su 405 nm a 15 mW, 488 nm a 15 mW, 561 nm a 20 mW.Si noti anche che, il nostro citometro di imaging è stato progettato su misura per avere spazialmente separati 488 nm e 561 nm laser (cioè su diverse telecamere) in modo da ottenere una chiara risoluzione di FRET dall'accettatore fluorescen ce .
2. Raccogliere dati per 20.000-50.000 cellule singole per campione all'interno di un cancello positivo a fluorescenza.
   1. Cancello singole celle da un alto rapporto di aspetto e una piccola area cellulare al contrario di cellule o detriti ammassati che avrebbero basso rapporto di aspetto e grandi o molto piccole aree cellulari rispettivamente.
      NOTA: i parametri equivalenti in un citometro non di imaging sono FSC (avanti dispersione) per le dimensioni approssimative delle celle e SSC (dispersione laterale) per la granularità delle celle. Inoltre, utilizzare l'altezza dell'impulso FSC rispetto alla larghezza dell'impulso come proxy per il gating a cella singola. Inoltre, è fondamentale non raccogliere eventi che hanno valori di fluorescenza oltre il limite superiore di sensibilità del citometro. Nel nostro cytometro di imaging, limitiamo la raccolta di eventi a un valore massimo di pixel non elaborato inferiore a uno inferiore al limite di saturazione per ogni canale fluorescente che raccogliamo. Analogamente, per i ciclimetri di flusso convenzionali, i punti dati nel contenitore con intensità più alta (che include eventi che esulano dalla gamma dinamica di rilevamento) non devono essere analizzati.

7. Analisi dei dati

1. Eseguire una compensazione utilizzando un campione mEos3.1 non fotoconvertito per il segnale donatore puro e il monomerico DsRed2, che ha uno spettro simile alla forma rossa di mEos3.1, per il segnale di accettazione puro¹³. Per una maggiore sensibilità, assicurarsi che il canale del rivelatore FRET sia considerato anche come obiettivo di fuoriuscita, nel programma di analisi.
2. Campioni di cancello per selezionare solo singole celle che sono fluorescenza positiva (come nella figura 2).
3. Calcolare il parametro AmFRET come rapporto del segnale FRET totale (488ex/595em) diviso per il segnale totale dell'accettazione FRET (561ex/595em).
4. Visualizzare i dati utilizzando un software di citometria di flusso (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: le concentrazioni di citosoliche per S. cerevisiae in questo studio sono state calcolate con le impostazioni seguenti come in Khan et al.⁸. L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il software di citometria di flusso (vedere Tabella dei materiali).

Rilevamento di oligomeri che non formano puncta

In precedenza abbiamo applicato DAmFRET per la caratterizzazione della separazione delle fasi proteiche, che in genere si traduce nella formazione di grandi gruppi proteici che possono essere rilevati anche dalla microscopia a fluorescenza. Per dimostrare l'applicabilità di DAmFRET agli assemblaggi proteici con limitato diffrazione, abbiamo analizzato una proteina biochimicamente ben caratterizzata che forma omo-heptamers discreti che sono troppo piccoli per essere visualizzati con la microscopia leggera: l'uomo umano co-chaperonina, HSPE1¹⁴. Abbiamo confrontato i profili DAmFRET delle cellule di lievito che esprimono mEos3.1 da solo, o HSPE1-mEos3.1. Quest'ultimo mostrava valori AmFRET positivi uniformi, mentre il primo mostrava amFRET trascurabile (Figura 3A). Le immagini delle cellule acquisite dal citometro del flusso di immagini (si veda la Tabella dei Materiali) hanno rivelato una fluorescenza diffusa in tutti i canali donatore, FRET e accettatore, sia per le cellule mEos3.1 che per HSPE1-mEos3.1-expressing ( Figura3B). Per confermare questa scoperta a una risoluzione ottica più elevata, abbiamo usato la microscopia confocale per catturare z-stack per più campi di cellule. Infatti, la fluorescenza è stata distribuita uniformemente in tutto il citosol, senza puncta rilevabili, se le cellule esprimevano HSPE1-mEos3.1 o il fluoroforo da solo (Figura 3C). Si noti che il K_d di HSPE1 è di circa 3 M che è leggermente al di sotto della sensibilità del nostro sistema, e quindi non osserviamo il rapporto sigmoidale di FRET alla concentrazione che ci si aspetterebbe per questo discreto omo-oligomero. Tuttavia, concludiamo che DAmFRET rileva in modo robusto l'omo-oligomerizzazione solubile in vivo a risoluzione a singola cellula.

Rilevamento di assiemi con limitazione della nucleazione

Per mostrare la capacità di DAmFRET di distinguere gli omo-oligomeri discreti dagli assiemi a basso contenuto di nucleazione come i prioni, abbiamo analizzato la proteina infiammante umana ASC. Mentre WT ASC^PYD forma filamenti invivo, l'inattivo mutanteR41E di ASC^PYD non 9^,10. Abbiamo espresso in cellule di lievito sia mEos3.1 da solo, o mEos3.1 fusa a WT o R41E ASC^PYD. Le cellule di lievito che esprimono il fluoroforo da solo o la forma mutante di ASC^PYD hanno mostrato AmFRET trascurabile su tutta la gamma di concentrazione, indicando un'incapacità di auto-interagire. Al contrario, WT ASC^PYD presentava un profilo DAmFRET con due popolazioni: una con AmFRET trascurabile e l'altra con AmFRET elevato (Figura 4A). Come confermato dalle immagini a fluorescenza (Figura 4B), queste popolazioni rappresentano cellule che contengono solo proteine solubili o contengono invece rispettivamente proteine per lo più auto-assemblate. La relazione discontinua tra le popolazioni, e il fatto che essi si verifichino a concentrazioni sovrapposte indica che una barriera di nucilazione stabilizza la forma monomerica della proteina e può impedirne l'assemblaggio per tutta la durata dell'esperimento ⁸. Il divario in AmFRET tra le due popolazioni indica che, una volta che si verifica la nucleazione, si presenta quasi istantaneamente altri monomeri alla forma assemblata e raggiunge un nuovo livello di stato costante di AmFRET. Il DAmFRET ha corroborato i dati strutturali precedenti che il punto mutante ASC^PYD R41E interrotto nucleazione tra le concentrazioni raggiungibili da questo sistema di espressione (Figura 4A).

Applicabilità del DAmFRET nelle cellule dei mammiferi

Anche se le cellule di lievito sono cellule ospiti ideali per DAmFRET, abbiamo voluto estendere l'applicabilità di DAmFRET alle cellule dei mammiferi. Al fine di evitare la morte cellulare causata da polimeri ASC funzionali, abbiamo testato DAmFRET in cellule HEK293T che mancano di espressione caspase-1. Abbiamo espresso le stesse proteine nelle cellule HEK293T come abbiamo fatto nelle cellule di lievito in Figura 4A. I profili DAmFRET risultanti nelle celle HEK293T assomigliano qualitativamente a quelli delle celle di lievito (Figura 4A,C). DAmFRET, quindi, serve come il metodo in vivo più versatile per rilevare e quantificare gli auto-assemblaggi di proteine nucleate a risoluzione singola cellulare con una velocità effettiva elevata, indipendentemente dalla presenza sia di puncta visibile al microscopica sia sul tipo di cellula.

Figura 1 : Panoramica della progettazione sperimentale per S. cerevisiae. Questa cifra è stata adattata da Khan et al.⁸ con il permesso. (A) Mappa di 2 plasmi che mostra il telaio di lettura aperto per la proteina di interesse, etichettato con mEos3.1 fotoconvertibile e guidato da un promotore inducibile. (B) Quando trasformato in cellule di lievito, il sistema di replicazione di 2 o più di 2 porta ad un elevato numero di copie variabilità tra le cellule. Tale variazione, combinata con il rumore trascrizionale del promotore di GAL1, si traduce in un'ampia distribuzione dell'espressione proteica in una popolazione di cellule. (C) Panoramica sperimentale per il saggio di lievito DAmFRET. Per garantire cellule sane per il saggio, le colonie vengono prima inoculate per la proliferazione superiore a 16 h in supporti sintetici contenenti la fonte di carbonio che non induce, dextrose. In seguito alla proliferazione, le cellule vengono trasferite su supporti sintetici contenenti la fonte di carbonio che induce, il galactose, per 16 h. A seguito dell'induzione, le cellule vengono parzialmente e uniformemente fotoconvertite per esposizione a una luce di 405 nm. (D) I campioni vengono quindi analizzati utilizzando la citometria del flusso di immagine. Gli spettri e le intensità di mEos3.1 verde e rosso li rendono adatti rispettivamente a un donatore e accetto FRET. Quando in prossimità l'uno dell'altro, come avviene nel polimero raffigurato nella cellula inferiore, le molecole rosse fluoresceranno su eccitazione di molecole verdi (FRET). (E) Trama delle intensità del donatore e dell'acceleratore che mostra una stretta relazione lineare sulla fotoconversione, dimostrando che l'efficienza della fotoconversione non è influenzata dal livello di espressione. (F) Grafico di dispersione dell'accettatore medio rispetto all'intensità del donatore da parte di popolazioni di cellule che esprimono una varietà di proteine contrassegnate con mEos, sia in forme solubili che amiloidi, dimostrando che l'efficienza della fotoconversione non è influenzata dalla fusione partner o solubilità (le barre di errore indicano la deviazione standard dei triplicati biologici). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : strategia di gating DAmFRET per i dati di citometria del flusso di immagine. La strategia di Gating utilizzata per analizzare solo singole cellule mirate e non regolate che hanno una bassa autofluorescenza ed esprimono la proteina fluorescente. (A) Gerarchia delle porte per ottenere celle singole ben focalizzate, vive, per l'analisi. (B) Istogramma del gradiente RMS del canale brightfield. Questa misurazione consente la selezione di celle che sono correttamente focalizzate sotto la luce trasmessa. (C) Grafico di densità di circolarità rispetto all'area che mostra una popolazione recintata di singole celle sferiche non negoziate. (D) Grafico di densità che mostra l'autofluorescenza (Ch07) rispetto all'intensità della fluorescenza del donatore (Ch02) che mostra popolazioni separate di cellule che esprimono (gated) e cellule scure. (E) Grafico a dispersione tra donatore e intensità accettanti che mostrano una netta perdita di fluorescenza del donatore in un sottoinsieme di cellule, risultante da FRET tra il donatore e l'acceleratore fluorofori. (F) Trama finale di DAmFRET. Le cellule contenenti proteine non assemblate sono centrate intorno allo zero AmFRET, mentre le cellule contenenti proteine autoassemblate presentano un valore AmFRET positivo. Due popolazioni sovrapposte nel terreno sono indicative di una barriera finita alla nuclazione di tale proteina in assiemi di ordine superiore come gli amiloidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : dati rappresentativi delle proteine monoratriche ed efertamiche per citometria di flusso e microscopia. (A) Profilo DAmFRET della proteina monomerica mEos3.1 (a sinistra) e eptamerico HSPE1 etichettato con mEos3.1 (a destra) che mostra un aumento del rapporto metrico FRET derivante dall'assemblaggio omotipopico. (B) Immagini dal citometro, di cellule che esprimono mEos3.1 (a sinistra) e HSPE1 (a destra) mostrate in tutti i canali catturati. (C) Immagini rappresentative di cellule di lievito che esprimono mEos3.1 (a sinistra) e HSPE1 (a destra). Le immagini sono proiezioni somma di sezioni confocali. Almeno cinquanta cellule sono state immagini per confermare questa osservazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : i profili DAmFRET mostrano un comportamento di auto-assemblaggio simile dell'ASC^PYD umano proteine in cellule S. cerevisiae e HEK293T. (A) Densità che mostrano AmFRET contro concentrazione citosolica (in zM) di mEos3.1 (a sinistra), o mEos3.1 fuso a WT (al centro) o mutante monomerizzante di ASC^PYD (a destra) in S. cerevisiae. (B) Immagini del citometro, di cellule dei cancelli inferiore e superiore (rispettivamente pannelli sinistro e centrale) che esprimono WT ASC^PYD; e di cellule che esprimono ASC^PYD R41E del cancello indicato (pannello destro). (C) Grafici di densità che mostrano l'intensità di AmFRET rispetto all'intensità dell'accettatore per la stessa serie di proteine come in (A) ma espresse nelle cellule HEK293T. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

DAmFRET è il metodo più completo per rilevare l'autoassemblaggio delle proteine in vivo. DAmFRET combina la lettura diretta delle interazioni proteina-proteina omotipica su un'ampia gamma di concentrazioni, con risoluzione a singola cellula e alta produttività. La lettura diretta di DAmFRET e il fatto che le proteine fuse non richiedono una localizzazione subcellulare specifica o uno stato insolubile elimina i falsi positivi ed estende la sua applicabilità a una vasta gamma di proteine nelle loro posizioni subcellulari native. In particolare, etichettando organelli con fluorofori che sono compatiblosi spettrali con mEos3.1, come T-Sapphire e mCardinal, la localizzazione subcellulare di forme solubili e assemblate di proteine può essere determinata insieme a DAmFRET.

Utilizzando il citometro del flusso di imaging come descritto qui, ci vogliono 8 h per analizzare una piastra di 96 pozzetti con circa 20.000 cellule recintate per pozzo. Tuttavia, eseguiamo regolarmente anche DAmFRET con citometri standard (non di imaging) che raggiungono una velocità effettiva molto più elevata (fino a 20 campioni al minuto). Infatti, qualsiasi citometro di flusso con laser separati spazialmente da 488 e 561 nm esenti da artefatti dell'amplificatore di log e dotato di PMT e filtri appropriati per il rilevamento dei segnali donatore, FRET e acceleratore è sufficiente per eseguire DAmFRET. Attualmente, questo guadagno in termini di produttività va a scapito delle informazioni di localizzazione e della determinazione del volume, in modo che l'auto-assemblaggio debba essere analizzato in funzione dell'espressione proteica piuttosto che della concentrazione. Questo non è un problema per le analisi qualitative. Inoltre, potrebbe essere possibile stimare il volume citosolico fondendo un fluoroforo distinto spettrale a una proteina endogena di "pulizia" la cui espressione è strettamente correlata al volume citosolico.

Come abbiamo dimostrato attraverso la nostra distribuzione di DAmFRET sia in lieviti che in cellule di mammiferi, DAmFRET può essere facilmente adattato a diversi sistemi di espressione. Ciò consente di studiare l'autoassemblaggio delle proteine nei loro contesti cellulari nativi. Inoltre, offre la possibilità di confrontare l'assemblaggio di proteine attraverso modelli di coltura cellulare ampiamente divergenti per studiare la conservazione dei meccanismi che governano l'autoassemblaggio delle proteine.

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Vorremmo ringraziare Jeff Lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan, e Ellen Ketter per il loro lavoro verso lo sviluppo del saggio. Questo lavoro è stato fatto per soddisfare, in parte, i requisiti per la ricerca di tesi di dottorato per T.S.K. e A.R.G. come studenti registrati presso l'Open University, Regno Unito, e il Stowers Institute for Medical Research Graduate School, USA, rispettivamente. Ulteriori informazioni relative al saggio sono disponibili presso https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.1016/j.molcel.2018.06.016. I dati originali sottostanti questo manoscritto sono accessibili dal Stowers Original Data Repository presso http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Questo lavoro è stato finanziato dal premio di indipendenza anticipata del NIH DP5-OD009152, dalla March of Dimes Foundation Grant n. 5-FY17-32 e dallo Stowers Institute for Medical Research.

I contributi degli autori sono i seguenti. Concettualizzazione: T.S.K., S.V. e R.H.; Metodologia: T.S.K., S.V., A.R.G. e A.B; Indagine: S.V., T.S.K. e A.R.G.; Analisi formale: S.V. e T.S.K. ; Curazione dei dati: T.S.K.; Visualizzazione: T.S.K e S.V., Scrittura (Bozza originale): S.V., e T.S.K.; Scrittura (revisione, modifica): R.H., S.V. e T.S.K.; e Acquisizione di finanziamenti: R.H.