Una purificazione e l'analisi di attività In Vitro per un ppGpp (p) sintetasi da Clostridium difficile

Qui, descriviamo un metodo per purificare enzimi pyrophosphokinase istidina-etichettate e utilizzando la cromatografia su strato sottile di radiomarcato substrati e prodotti di test per l' attività enzimatica in vitro. L'analisi di attività dell'enzima è ampiamente applicabile a qualsiasi chinasi, ciclasi del nucleotide o reazione di fosforo-trasferimento cui meccanismo include idrolisi di trifosfato del nucleotide.

Gli enzimi della chinasi e pyrophosphokinase trasferire la gamma fosfato o la frazione di pirofosfato di beta-gamma dai precursori di nucleotide trifosfato ai substrati per creare prodotti fosforilati. L'uso di γ -³²- P etichettato precursori NTP permette monitoraggio simultaneo della formazione di prodotto e l'utilizzo di substrato dalla radiografia. Cromatografia su strato sottile (TLC) su piastrine di cellulosa consente la rapida separazione e quantificazione sensibile del substrato ed il prodotto. Presentiamo un metodo per utilizzando la cromatografia di strato sottile per analizzare l'attività pyrophosphokinase di una purificato sintetasi di ppGpp (p). Questo metodo è stato utilizzato in precedenza per caratterizzare l'attività della sintetasi del nucleotide e dinucleotide ciclici ed è ampiamente adatto per caratterizzare l'attività di ogni enzima che idrolizza un legame di nucleotide trifosfato o trasferisce un terminale fosfato da un donatore di fosfato ad un'altra molecola.

Gli enzimi della chinasi e pyrophosphokinase (o membrana in direzione extra-chinasi) trasferimento fosfati dai precursori di nucleotide trifosfato (NTP) per molecole substrato. I substrati possono includere altri nucleotidi, aminoacidi o proteine, carboidrati e lipidi¹. Analisi bioinformatiche talvolta possono prevedere un enzima substrato affine o substrati basate sulla somiglianza agli enzimi caratterizzati, ma convalida sperimentale è ancora necessario. Allo stesso modo, l'affinità di un enzima per la sua overesprimessero e la velocità che esso catalizza la reazione di trasferimento di fosforo e gli effetti della co-fattori, inibitori, o altri effettori enzima devono essere determinati sperimentalmente. Per evitare lo svuotamento del precursore ATP da altri enzimi che consumano ATP presenti nel citoplasma batterico, analisi quantitativa attività richiedono proteina purificata.

Purificazione della proteina di cromatografia di affinità del metallo è stato coperto accuratamente in letteratura^2,3. Tag di istidina composto da residui di istidina consecutivi sei accodati a N - o C-terminale di una proteina ricombinante consentono la rapida purificazione da cromatografia di affinità del metallo^4,5,6. Queste sequenze sono piccole rispetto alle proteine modificano e in genere hanno un effetto minimo sulla funzione della proteina, anche se a volte possono alterare stabilità proteica e/o enzima cinetica^7,8. Istidina Tag presso il N - e C-termini della stessa proteina può avere effetti differenti, che sono difficili da prevedere senza conoscere la struttura della proteina in questione. Tag di istidina sono incorporati in genere durante la clonazione di una proteina ricombinante di progettazione degli iniettori che codificano sei residui di istidina, sia immediatamente il codone di inizio ATG a 3' o immediatamente 5' per il codone di arresto del telaio di lettura aperto. Dopo l'amplificazione, il gene hexahistidine-contenenti è legato in un vettore sotto il controllo di un promotore inducibile ed espressa, in genere in un ceppo di laboratorio di e. coli. La proteina di ricombinazione può quindi essere isolata su una resina di affinità contenente cationi bivalenti immobilizzato (tipicamente nichel o cobalto)⁹. Contaminando native proteine metallo-leganti possa essere rimossi mediante titolazione con imidazolo, che sposta competitivi associata proteina². Infine, la proteina dell'obiettivo è eluita dalla colonna con concentrazioni più elevate di imidazolo. Ci sono diverse fonti commerciali per resine immobilizzato catione del metallo, e i produttori forniscono raccomandazioni per le condizioni di buffer e le concentrazioni dell'imidazolo. Dopo eluizione, proteina può essere analizzata mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), dializzata o usata immediatamente in saggi funzionali.

Ci sono diversi metodi per monitorare indirettamente l'attività della chinasi di idrolisi dell'ATP fosfato legame di accoppiamento a una seconda reazione che rilascia o eccita un fluoroforo o genera chemiluminescenza, ma queste reazioni hanno più parti mobili e possono essere logisticamente impegnativo¹⁰. Il modo più semplice per misurare specificamente l'attività di fosforo-trasferimento è per monitorare direttamente il trasferimento di un gruppo fosfato radioattivo da un commercialmente disponibili γ -³²-P precursore NTP di un substrato non-radioattivi^{11 , 12 , 13}. miscele di substrati radioattivi e i prodotti possono essere separate e quantificate mediante cromatografia su strato sottile (TLC). TLC utilizza la mobilità differenziale di soluti in un dato solvente consentendo il solvente (fase liquida) eseguire la migrazione di azione capillare attraverso una superficie (fase solida) su cui una miscela di soluti è stato adsorbito¹⁴. Soluti che sono piccole e/o mancano di interazioni favorevoli con la fase solida migrerà distanze più lunghe dalla loro posizione iniziale del soluti con pesi molecolari superiori o grande affinità per il solido. Per l'esame di fosforo-trasferimento, moiety fosfato aumentare il peso molecolare delle molecole vengono aggiunti a e aggiungere carica ionica negativa a pH neutro o acido^11,12,14. Questo diminuisce la loro mobilità su una superficie di base quali PEI-cellulosa. Quando sviluppate in tampone fosfato acido di potassio, miscele di mono-, di-, tri-, tetra-e pentaphosphate specie possono essere facilmente separate su PEI-cellulosa, consentendo la quantificazione di ogni specie (Figura 2, figura 3). Tali dosaggi possono essere eseguite utilizzando lisati cellulari contenenti l'enzima di interesse, ma questo include il potenziale per l'attività di altre chinasi e fosfatasi ATPasi generale per vuotare il substrato e/o prodotto. Per una valutazione quantitativa in vitro dell'attività dell'enzima, è necessario purificare l'enzima di interesse.

Tetrafosfato di guanosina (ppGpp) e guanosina pentaphosphate (pppGpp) sono ribonucleotide di segnalazione molecole formate dal trasferimento di un pirofosfato di gruppo da un precursore di adenosina trifosfato (ATP) a, rispettivamente, un guanosina difosfato (GDP) o guanosina tetrafosfato (GTP) substrato¹⁵. Questi segnali di singolo ribonucleotide, collettivamente conosciuti come ppGpp (p), mediano una risposta cellulare allo stress ambientale, conosciuta come la risposta rigorosa in diverse specie batteriche^15,16. Conservate due classi di enzimi catalizzano la formazione di (p) ppGpp^15,17 Rel/Spo omologo (RSH) enzimi sono 'lungo' bifunzionale (p) ppGpp sintetasi/idrolasi denominato per la loro somiglianza con le relazioni ed il punto (p) ppGpp metabolica enzimi da Escherichia coli che contengono sintetasi, idrolasi e regolamentazione domini, mentre piccole alarmone sintetasi (SAS) gli enzimi sono breve monofunzionale sintetasi trovati esclusivamente a Gram positivi batteri^{15, 17 , 18}. il batterio gram-positivo sporigeni Clostridium difficile codifica putativi geni RSH e SAS¹⁹. Qui, presentiamo analisi di attività iniziale che confermano che l'enzima di c. difficile RSH è una cataliticamente attiva sintetasi di ppGpp (p).

1. viscoelastica sovraespressione di una proteina istidina-etichettate

1. Amplificare rsh da c. difficile R20291 DNA genomic.
   1. Utilizzare una polimerasi ad alta fedeltà e seguire le istruzioni del produttore.
   2. Amplificare il c. difficile rsh utilizzando primers
      rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) e
      rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), che introduce un tag hexahistidine C-terminale.
      Nota: Il KpnI e PstI tagliare siti nelle sequenze dell'iniettore sono in grassetto.
   3. Digerire il vettore pMMBneo e il prodotto PCR di rsh-his6 con restrizione Pstl e KpnI tagliato siti a 37 ° C per 45 min.
   4. Purificare il vettore linearizzato e i frammenti PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio e purificazione successiva con un kit di estrazione del gel del DNA.
   5. Misurare l'assorbanza nm 280 (un₂₈₀) del vettore e il prodotto PCR amplificato. Utilizzare l'equazione per determinare la concentrazione di DNA di ogni frammento di DNA.
2. Lega i rsh in pMMBneo per l'espressione.
   1. Combine 25 ng di digerito PMMBneo vettoriale, 125 ng del prodotto del gene di rsh-his6 , 2 μL di tampone di ligasi 10x e 1 μL di DNA ligasi. Utilizzare l'acqua gratuita di nucleasi per regolare il volume totale a 20 μL. Incubare a 16 ° C per 16 h.
      Nota: L'efficacia della legatura dipende dalla dimensione del frammento e deve essere aggiustato in base a protocolli del produttore.
   2. Trasformare il prodotto vettoriale in e. coli DH5-α o un altro ceppo recA - plasmide manutenzione. Selezionare per cellule trasformate su piastre LB con kanamicina di 100 μg/mL e incubare per 16-24 h a 37 ° C.
   3. Prendere quattro colonie dalla piastra di trasformazione (s) e rigare ciascuno su un piatto fresco che contiene 100 kanamicina μg/mL per isolamento del DNA. Incubare le nuove piastre a 37 ° C per 16 – 24 h e selezionare un isolato per l'espressione della proteina successive.
   4. Per confermare il successo legatura della regione di codificazione della proteina intatta rsh , prelevare una Colonia del scelto isolare in 20 μL di acqua, riscaldare a 95 ° C per 10 min e utilizzare come un modello per una PCR conferma utilizzando il primer stesso utilizzato per amplificare il gene.
3. Trasformare il plasmide verificato secondo i protocolli standard di trasformazione per la trasformazione di plasmide batterico di Escherichia coli in e. coli BL21 sistema per la produzione di proteine ad alto rendimento.
4. RSH-His6 espressa in e. coli.
   1. Selezionare una singola colonia di e. coli BL21 trasformato con pMMBneo::rsh e inoculare 2 mL di terreno LB con kanamicina di 50 μg/mL. Incubare a 37 ° C 12 – 16 h mentre si stringono a 250 giri/min.
   2. Inoculare 500 mL di mezzo LB contenente 50 kanamicina μg/mL con 0,5 mL della coltura durante la notte per la crescita delle cellule e l'espressione della proteina.
   3. Incubare la cultura di espressione a 37 ° C e 250 giri/min in un agitatore incubatore fino a quando la densità delle cellule raggiunge un OD₆₀₀ 0,167 a 37 ° C.
   4. Ridurre la temperatura dell'incubatore a 30 ° C e attendere 30 minuti per la temperatura di cultura a goccia.
   5. Inducono l'espressione di RSH aggiungendo isopropilico β-D-thiogalactoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,5 mM. Consentire l'induzione che si terrà durante la notte (per h 16 – 18) a 30 ° C, agitando a 250 giri/min.
   6. A pellet mediante centrifugazione a 3.080 x g per 30 min a 4 ° C.
      Nota: Il pellet possa essere immagazzinato durante la notte a-20 ° C per purificare la proteina bersaglio il giorno seguente senza notevole perdita di resa di proteine o di attività enzimatica.

2. proteina purificazione mediante cromatografia di affinità di nichel

Nota: Continuare direttamente con fasi di purificazione di proteine fornite di seguito dopo aver chiarito il lysate delle cellule. Memorizzazione di chiarito lisato a 4 ° C durante la notte per la purificazione della proteina successive riduce il rendimento della proteina.

1. Purificare la proteina con 1 mL di resina nichel-Nitriloacetic acido (Ni-NTA) su una colonna di gravità.
   1. Il giorno prima di utilizzare, equilibrare la colonna durante la notte a 4 ° C con 2 mL di tampone di equilibrazione (10 mM Tris-HCl pH 7.79, 300 mM NaCl, 50mm NaH₂PO₄, lisozima di 0,5 mg/mL, 5 mM MgCl₂, imidazolo di 10 mM, 0.25 mM DTT, sulfonil fenilmetano 5 mM fluoruro (PMSF), 10% glicerolo).
   2. Il giorno seguente portare la colonna da 4 ° C a RT prima di caricare il chiarificato lisato e lasciate stare per ~ 2 – 3 h.
      Nota: Portare la colonna all'equilibrio termico è fondamentale per evitare bolle d'aria che formano all'interno della colonna.
   3. Risospendere il pellet ottenuto nel passaggio 1.3.6 il tampone di lisi (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50mm NaH₂PO₄, 10% glicerolo, lisozima di 0,5 mg/mL, imidazolo di 10 mM, 0.25 mM DTT e 5 mM PMSF).
   4. Sonicare cellule sul ghiaccio per intervalli di 8 x 10 s, pausa 30 s tra gli impulsi.
   5. Chiarire il lisato mediante centrifugazione a 3.080 x g per 30 min a 4 ° C, utilizzando una microcentrifuga.
   6. Preparare lisato con volumi uguali di tampone di lisi quindi applicare il preparato chiarito lisato alla colonna e raccogliere il flusso continuo.
   7. Riapplicare lisato chiarificato flusso-attraverso la colonna e raccogliere il passaggio secondario.
   8. Lavare la colonna con tampone di lavaggio 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50mm NaH₂PO₄, imidazolo di 30 mM, 10% glicerolo). Raccogliere il flusso continuo.
      Nota: L'inclusione di 5 mM MgCl₂ nei buffer di lavaggio e di eluizione è importante per l'attività enzimatica della proteina purificata.
   9. Lavare la colonna con tampone di lavaggio 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50mm NaH₂PO₄ e imidazolo di 50 mM). Raccogliere il flusso continuo.
   10. Applicare 2 mL di tampone di eluizione (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 50mm NaH₂PO₄, 10% glicerolo e imidazolo 75 mM). Raccogliere flusso continuo in due frazioni di 1 mL ciascuno.
       Nota: La colonna dopo questo passaggio possa essere memorizzata nel buffer di equilibrazione a 4 ° C se la stessa proteina sarà purificata nell'analisi della purificazione successiva. La colonna può essere utilizzata fino a 3 volte se conservati correttamente.
2. Valutare le frazioni di colonna per la purezza da SDS-PAGE.
   1. Per valutare qualitativamente la purificazione della proteina, eseguire 20 aliquote del μL di tutte le frazioni di colonna su un gel di poliacrilammide del 4% / 10% per 60 min a 170 V.
   2. Macchia il gel con blue di Coomassie 0,1% a temperatura ambiente per 5 h, oscilla delicatamente su un rocker di benchtop.
   3. Decolorare il gel in metanolo al 40%, 10% di acido acetico glaciale durante la notte a temperatura ambiente, a dondolo su un rocker di benchtop.
      Nota: Un gel rappresentativo è raffigurato nella Figura 1.
3. Dializzare eluire frazione 2 durante la notte a 4 ° C.
   1. Dializzare contro il buffer di dialisi (15,7 mM Tris-HCl (pH 7.6), 471,9 mM NaCl, 15,69 mM MgCl₂, 1,57 mM DTT, 1,5 mM PMSF e 15,7% glicerolo) con un rapporto di 200: 1 utilizza un dispositivo di dialisi 1 mL con un limite di peso molecolare 20 kDa (MWCO).
   2. Determinare la concentrazione di proteina dializzati campione misurando l'assorbanza a 280 nm e utilizzando l'estinzione molare calcolato coefficiente 82085 M^-1cm^{-1 20}.
   3. Memorizzare 5 aliquote del μL del campione della proteina dializzati in aliquote a-80 ° C fino all'utilizzo.

3. proteine attività analisi mediante cromatografia su strato sottile

1. Preparare la piastra di cromatografia di strato sottile.
   1. Prima di eseguire la reazione, preparare polyethyleneimine (PEI)-piastrine di cellulosa mediante lavaggio con acqua deionizzata. Posizionare le piastre in una camera di vetro con doppia acqua distillata ad una profondità di cm ~0.5.
   2. Lasciare acqua a migrare verso la parte superiore della piastra.
      Nota: I piatti di lavaggio non è strettamente necessario, come piastre possono essere utilizzati senza di essa, ma lavaggio aumentare la chiarezza delle immagini risultanti. I piatti di lavaggio in due direzioni perpendicolari ulteriormente garantisce che eventuali contaminanti presenti nella resina sono isolati in un angolo della piastra (Figura 2).
   3. Portare le piastre nella camera di vetro e lasciare su una cremagliera di benchtop per asciugare durante la notte (12 – 18 h).
   4. Contrassegnare le piastre asciutte 2,0 cm da un bordo con una matita morbida per indicare dove i campioni saranno applicati per TLC. Per 2 campioni μL, applicare i campioni non meno di 1,0 cm di distanza (Figura 2).
      Nota: Questo consente la netta separazione tra posto adiacente, che è fondamentale per la quantificazione del segnale. Come la resina di cellulosa non è graffiato, piccoli segni di matita sulla superficie non interferirà con solvente migrazione.
   5. Durante la pianificazione di esperimenti, sempre lasciare uno spot su ogni piatto inutilizzati.
      Nota: Ciò fornirà una corsia vuota per la quantificazione del campione (Figura 2). Un piatto di 20cm TLC avrà spazio per 19 punti.
2. Enzymaktivitätsbestimmung
   1. Preparare una miscela di buffer 5x contenente 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), acetato di ammonio di 25 mM, 10 mM KCl, 1 millimetro DTT e 0,6 mM ATP.
      Nota: Questo mix può essere preparato in grandi quantità e congelato in 10 aliquote del μL per un uso successivo. Non sottoporre mix a più cicli di gelo-disgelo.
   2. Preparare le reazioni individuali contenenti 3 μM RSH, mix di 1 x buffer, 0,6 mM PIL, 1,2 mM MgCl₂. Aggiungere 1,0 μCi γ -³²P-ATP per 10 μL di reazione e utilizzare acqua gratuita nucleasi per portare la reazione fino a un volume desiderato. Aggiungere il RSH dopo gli altri componenti sono stati mescolati, come l'aggiunta di RSH alla miscela del nucleotide-contenente avvia il dosaggio dell'attività enzimatica.
      Nota: Volume di reazione finale dipenderà il numero di punti temporali campionate. Per campionare 2 μL/timepoint, assemblare 10 μL di miscela di reazione per ogni 4 punti temporali.
   3. Per controllare per idrolisi dell'ATP da contaminanti attività nucleasi, assemblare una reazione μL 10 non contenente nessuna proteina e viene quindi incubato in parallelo. Spot 2 campioni μL a t = 0 e alla fine dell'esperimento per garantire che ATP non era idrolizzato in assenza di proteina.
   4. Rimuovere immediatamente con l'aggiunta di RSH, 2 μL e individuarlo sulla piastra di PEI-cellulosa etichettata come la t = 0 min campione.
   5. Incubare la reazione a 37 ° C, rimozione 2 aliquote del μL timepoints desiderata.
      Nota: L'attività enzimatica cesserà quando il campione è adsorbito sulla piastra di cellulosa. Attendere 10 – 30 min dopo l'ultimo posto è aggiunto alla piastra prima di sviluppo per garantire completa adsorbimento ed essiccazione del campione.
3. Cromatografia su strato sottile
   1. Riempire la camera di cromatografia con 1,5 M 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,64) ad una profondità di 0,5 cm.
      Nota: Il volume necessario sarà dipendono dalle dimensioni del serbatoio cromatografia. Qualsiasi contenitore di vetro con un basso livello che è sufficientemente ampia per consentire l'inserimento della piastra TLC senza flessione può essere utilizzato come un tank di sviluppo con l'aggiunta di una copertura. La piastra di TLC può essere tagliata in strisce più stretti con un battistrada pulito per consentire lo sviluppo in un becher di vetro rivestito in film plastico.
   2. Immergere il bordo inferiore della piastra in solvente. Consentire il solvente migrare nella parte superiore della piastra (~ 90 min).
      Nota: Mentre solvente migrazione verrà interrotta nella parte superiore della piastra e campioni non verranno perso o correre insieme durante un'immersione più lunga, piastre dovrebbero non essere lasciati in solvente durante la notte. Immersioni più di 4 ore possono causare la resina staccare dalla piastra di appoggio e causare la perdita del segnale.
   3. Rimuovere la piastra dal serbatoio di cromatografia e posizionarlo su un benchtop stendino.
   4. Lasciare asciugare la piastra all'aria durante la notte.
      Nota: Essiccazione può essere accelerato tramite l'uso di un asciugacapelli. Secchezza può essere valutata dal colore della resina, che si scurisce quando è bagnato e ritorno al colore di una piastra inutilizzato quando è completamente asciutto.
   5. Dopo che il piatto è asciutto, avvolgere la piastra in pellicola di plastica per evitare il trasferimento di materiale radioattivo per la cassetta di imaging e analizzare mediante autoradiografia (Figura 3).
4. Analisi dei dati
   1. Esporre la piastra di PEI-cellulosa contenente le reazioni separate su una videocassetta phosphorimager per 4 h a temperatura ambiente.
      Nota: Questa è l'esposizione sufficiente per produrre un'immagine molto chiara utilizzando le concentrazioni indicate di fresco γ -³²P-ATP. Se vengono utilizzati gli importi più bassi di substrato radiomarcato, tempo di esposizione può essere aumentata a 12-16 h.
   2. Immagine della cassetta su un phosphorimager.
   3. Utilizzando software di imaging con un'interfaccia utente grafica, disegnare regioni di interesse (ROI) selezionando Rettangolo disegnare e utilizzando il mouse per disegnare ROIs rettangolare intorno uno spot di lane e l'ATP e ppGpp intero contenuto all'interno di quella corsia (Figura 3 ).
   4. Utilizzare i comandi selezionare, copiare e incollare (o corrispondenti comandi basati sul software di imaging utilizzato) per disegnare ROIs identici all'interno le altre corsie per garantire che il ROIs sono misurando il segnale all'interno di aree identiche in ogni corsia. Sono ROIs da una corsia di inutilizzati, per essere utilizzati come spazi vuoti.
   5. Utilizzando il analizzare | Strumenti | ROI Manager | Aggiungi comandi del software di imaging, selezionare tutti i ROIs disegnata sul piatto cellulosa PEI.
   6. Utilizzando il analizzare | Impostare misure | Misura comandi, quantificare l'intensità del segnale all'interno di ogni ROI ed esportare le misurazioni come un foglio di calcolo (Figura 3). Sottrarre i valori vuoti di ROI da segnali sperimentali.
   7. Calcolare quale percentuale del segnale tranciate all'interno di ogni corsia è imputabile all'ATP e ppGpp utilizzando le formule
      Nota: ROIs può essere disegnata e quantificata utilizzando software commerciali compatibile con il phosphorimager o liberamente disponibile software ImageJ (National Institutes of Health).

Presentiamo un metodo per la purificazione di affinità di una sintetasi di ppGpp (p) da Clostridium difficile e la valutazione della sua attività enzimatica. Figura 1 dimostra la purificazione della proteina mediante cromatografia di affinità del metallo. La seconda frazione di eluizione (E2) da questa purificazione è stata dializzata e utilizzata per il dosaggio dell'attività enzimatica. Figura 2 in dettaglio i passi necessari per preparare e svolgere le analisi pyrophosphotransferase di cromatografia su strato sottile. La figura 3 illustra come dati da questi esperimenti sono quantificati con l'accento sulla tranciatura appropriato e conversione dell'intensità del segnale alle percentuali. In Figura 4A, presentiamo un rappresentante autoradiograph TLC di un'analisi di sintetasi di ppGpp (p) usando RSH purificata, una sintetasi di ppGpp di c. difficile (p). L'iniziale posizione spot, ppGpp e macchie di ATP sono chiaramente visibili su autoradiograph, come è il fronte del solvente che è visibile, perché contiene tracce di fosfato inorganico radioattivo. Molecole con più acido fosforico moiety esibiscono meno mobilità dalla posizione spot iniziale, come hanno maggiore peso molecolare e carica ionica negativa; Questo ostacola la loro mobilità su base PEI-cellulosa. Il corso di 120 min a 37 ° C, ppGpp accumulo e deplezione di ATP sono trascurabili nelle reazioni carente dell'enzima sintetasi, mentre sia deplezione di ATP e l'accumulazione di ppGpp sono prontamente apparenti in presenza di RSH Figura 4A). Figura 4B Mostra i segnali assoluti di ATP e ppGpp da quattro esperimenti. Figura 4 Mostra gli stessi dati come Figura 4B con i segnali assoluti convertiti in percentuali del segnale radioattivo totale. Ciò minimizza imprecisioni a causa di errore di pipettaggio e/o decadimento radioattivo e permette di dati da esperimenti effettuati in giorni diversi da mettere in comune senza introdurre incertezza ai dati.

Figura 1: nichel purificazione di affinità di RSH. Un macchiato di Coomassie SDS-PAGE gel mostrando lisato (L) e centrifugato lisato (CL) di indotto BL21 pMMB::rsh-his6 così come il flusso continuo (FT), 1 (W1) di lavare, lavare 2 e frazioni di eluizione (E1 ed E2) dopo purificazione di affinità di nichel. La frazione di E2 è stata dializzata e utilizzata per successivi saggi enzimatici. Pesi molecolari dei campioni di formato della proteina sono mostrati sulla destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: preparazione di piatti di TLC. (A) piastre vengono lavate in una dimensione posizionando il bordo inferiore in acqua (blu). Eseguire la migrazione di contaminanti (gialli) nella parte superiore della piastra con il solvente. (B) dopo che un piatto è asciugato completamente, è bagnata in una seconda dimensione ruotandola di 90 ° rispetto al primo lavaggio e consentendo nuovamente acqua migrare nella parte superiore della piastra. (C) dopo il lavaggio, ogni contaminanti vengono isolati in un angolo della piastra. La resina di una piastra di TLC lavata può essere contrassegnata delicatamente con una matita morbida per indicare dove devono essere individuati i campioni. Per 2 campioni μL, un minimo di 1 cm tra spot garantirà separazione del campione adeguata. I campioni sono macchiati 2cm dal 'basso' della piastra. Dopo l'applicazione di esempio, solvente è consentita l'esecuzione per il 'top', dove tutti gli agenti inquinanti saranno stati isolati dai risciacqui con acqua. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: quantificazione del segnale. Regioni di interesse (ROI) definendo il totale, ATP e ppGpp segnale sono indicati per una corsia vuota e una corsia di sperimentale. L'intensità del segnale all'interno di ogni ROI in bianco viene sottratto dal valore sperimentale, e i segnali di ATP e ppGpp vengono normalizzati per il segnale totale utilizzando le equazioni indicate per presentare la percentuale del segnale radioattivo totale imputabile all'ATP e ppGpp. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Autoradiograph di un piatto rappresentativo di TLC: (A) questa immagine mostra il fronte del solvente, ATP, ppGpp e posizioni spot iniziale di una reazione effettuata utilizzando purificato c. difficile RSH. Una reazione di controllo non contenente nessuna proteina (p.n.) consente quantificazione uncatalyzed di idrolisi dell'ATP, mentre una corsia vuota consente Quantificazione accurata del segnale. (B) intensità segnale assoluto dell'ATP e ppGpp durante 120 minuti di incubazione con c. difficile RSH. Vengono mostrati i mezzi e le deviazioni standard dei quattro esperimenti indipendenti. (C), gli stessi dati da (B) con il ppGpp segnale presentato come una percentuale del segnale radioattivo totale. accumulo di ppGpp in nessuna proteina (p.n.) reazione del controllo è evidenziato in nero. Vengono mostrati i mezzi e le deviazioni standard dei due esperimenti indipendenti con due ripetizioni tecniche ogni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Qui segnaliamo la purificazione della sua etichetta RSH da c. difficile e presentare un metodo per la quantificazione di attività mediante cromatografia su strato sottile radiomarcato. Questo metodo è stato utilizzato in precedenza per valutare l'attività di enzimi ciclasi diguanylate da c. difficile, come pure della sintetasi di ppGpp (p), ciclasi del nucleotide, chinasi ed enzimi fosfodiesterasi da altri organismi^{11,12 ,13,21}. Mentre il metodo non è romanzo, è ampiamente applicabile a molti tipi di test, e speriamo che i ricercatori potranno reperire la relativa presentazione in formato video disponibile.

Le fasi più critiche all'interno del protocollo sono la purificazione della proteina (misure 2.1.3–2.1.10), preparazione di reazione per cromatografia su strato sottile (passaggio 2.2-2.3) e analisi dei dati (punto 3.4). Abbiamo trovato le seguenti modifiche per essere particolarmente utile: l'aggiunta di MgCl₂ per il buffer utilizzato per la purificazione di nichel colonna (misure 2.1.3–2.1.10) è fondamentale per l'attività enzimatica della proteina purificata e la presentazione della dati relativi all'attività dell'enzima come % ppGpp prodotto piuttosto di assoluta ppGpp prodotto garantisce che i dati raccolti in giorni diversi, con differenti di γ -³²P-ATP sono coerenti. Questo metodo è accessibile a qualsiasi gruppo di ricerca con accesso a un phosphorimager, e l'analisi dei dati è molto semplice. Di quantificazione del phosphotransfer attività come una percentuale del ³²P convertito in ppGpp, assicuriamo la riproducibilità dei dati. Perché volumi di reazione molto piccole sono macchiati sulle piastre di PEI-cellulosa, c'è un potenziale significativo di pipettaggio lievi imprecisioni per introdurre un errore significativo della quantità assoluta di γ -³²P-ATP o ³²P-ppGpp in una corsia specificata la piastra di TLC, ma la distribuzione del segnale radioattivo tra le forme possibili è indipendente dal segnale totale presente. Inoltre, il segnale radioattivo totale in una corsia dato può dipendono dall'età del γ -³²P-ATP utilizzato nell'esperimento. ³² P ha un'emivita di 14,3 giorni, quindi saggi indipendenti effettuati diversi giorni di distanza possono mostrare differenze sostanziali nel totale segnale radioattivo rilevato ma la quantità relativa di radiomarcato ATP e ppGpp dipende solo da attività enzimatica. Presentazione dei dati come 'percentuale ppGpp' piuttosto che assoluto ppGpp segnale impedisce l'introduzione di rumore casuale di pipettaggio errore o decadimento radioattivo. Questo è illustrato tramite le differenze fra Figura 4B e 4 C. Sia visualizzare i mezzi e le deviazioni standard dei dati dagli stessi quattro esperimenti, ma i dati nella Figura 4 sono stati normalizzati al segnale radioattivo totale.

Abbiamo determinato che l'enzima di c. difficile RSH è un funzionale ppGpp sintetasi in vitro, in grado di rapida pyrophosphotransfer da un phosphodonor di ATP e un accettore di PIL. Questa reazione dipende dal magnesio, che coordina l'ATP e l'associazione di guanosina da RSH famiglia enzimi²². Abbiamo modificato i protocolli del produttore per cromatografia di affinità di nichel includere 5 mM MgCl₂ nella lisi e wash buffer come pure l'eluizione del buffer perché abbiamo trovato che la purificazione in assenza di magnesio è dannosa per il attività enzimatica della proteina purificata. Questo suggerisce che gli ioni di magnesio possono svolgere un ruolo non catalitico in struttura della proteina in assenza di associazione del nucleotide di stabilizzazione, ma ulteriore caratterizzazione strutturale sarà necessario confermare questo.

A nostra conoscenza, questo lavoro è il primo rapporto pubblicato della sintesi di ppGpp a c. difficile e indica che questo organismo è probabile che utilizzano una risposta rigorosa ppGpp-mediata (p) per sopravvivere stress extracellulare. (metabolismo di ppGpp p) è stata segnalata mai prima in questo importante patogeno umano. Dato che la risposta rigorosa è implicata nella persistenza in molti altri agenti patogeni, è probabile che la segnalazione ppGpp-mediated (p) può svolgere un ruolo nella tolleranza a stress elevato delle cellule di c. difficile e l'alto tasso di ricorrenza di c. difficile infezione^23,24,25.

Gli autori dichiarano senza concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Questo lavoro è stato finanziato dal NIAID 1K22AI118929-01. EBP è stata sostenuta da una sovvenzione di programma estate Research Fellowship dall'Office of Research presso Old Dominion University, Norfolk, Virginia, USA.