Misurazione della temperatura corpo del mouse utilizzando il termometro a infrarossi durante passiva anafilassi sistemica e la valutazione di allergia alimentare

Qui vi presentiamo un nuovo metodo per misurare con precisione le differenze di temperatura del corpo in passivo anafilassi sistemica (PSA) e modelli di mouse allergia alimentare utilizzando un termometro a infrarossi. Questa procedura è stata duplicata con precisione nei precedenti risultati di PSA.

Misurazione di temperatura del corpo del mouse è di fondamentale importanza per indagare le allergie e sintomi di reazioni anafilattiche. Sonde rettali per letture di temperatura è comune, e hanno dimostrati di essere preciso e prezioso in questo senso. Tuttavia, questo metodo di misurazione della temperatura richiede i topi di essere anestetizzato per inserire la sonda senza pregiudizio per l'animale. Questo limita la capacità di osservare altri fenotipi del mouse contemporaneamente. Al fine di indagare altri fenotipi durante la misurazione della temperatura, sonde rettali non sono ideali, e un altro metodo è desiderato. Qui, presentiamo un metodo non invasivo di misurazione della temperatura che rinuncia il requisito per l'anestesia del mouse mantenendo affidabilità pari alle sonde rettali nella misurazione della temperatura corporea. Usiamo un termometro a infrarossi che rileva la temperatura del corpo a compresa tra 2 e 150 mm. Questo metodo di misurazione di temperatura del corpo è riuscito a replicare in modo affidabile le tendenze di cambiamento di temperatura durante gli esperimenti di anafilassi sistema passivo in topi. Indichiamo che la temperatura del corpo è circa 2,0 ° C inferiore a misurazioni di sonda rettale, ma il grado di abbassamento della temperatura segue lo stesso andamento. Inoltre, usiamo la stessa tecnica per osservare i topi in un modello di allergia alimentare per valutare i livelli di temperatura e attività contemporaneamente.

Misurazione della temperatura corporea è stata una parte essenziale del monitoraggio degli effetti dei sintomi di reazioni anafilattiche in animale modelli^1,2. Differenze di temperatura sono stati tradizionalmente misurate da termometri sonda rettale in topi^3,4. Con queste misure, gli investigatori hanno ritratto in modo affidabile le differenze di temperatura tra variabili; Tuttavia, questo metodo è una procedura che richiede tempo e causa l'afflizione ai topi, che possono aumentare la temperatura interna del corpo. Sonda rettale può anche causare lacerazioni e infezione della mucosa³. Inoltre, i topi dovrebbero essere anestetizzati per umanamente inserire la sonda rettale per misurare la temperatura³. Si tratta di un processo lento, e vieta la misurazione delle temperature successive entro un breve periodo di tempo. Inoltre, topi attività fenotipi non possono essere osservati durante questo tempo fino a quando l'anestetico è portato completamente fuori, che è un altro processo che richiede tempo. Più recentemente, altri metodi affidabili per misurare la temperatura corporea sono usate Tag transponder infrarosso passivo impiantato per via sottocutanea o trasmettitori radio che includono un sensore di temperatura^3,5,6. Anche se essi vengono riconosciuti da alcuni ricercatori come la pratica ideale, questi metodi non sono ampiamente utilizzati a causa di alti costi iniziali e l'afflizione di topi, dovuto l'impianto chirurgico di un sensore di temperatura sotto la pelle o un'altra parte del corpo.

Al fine di dimostrare che una differenza di temperatura è una riflessione accurata dei sintomi in un modello di malattia^1,2, topi devono essere sveglio durante la misurazione di temperatura ed essere in grado di tornare alla loro normale attività fenotipica immediatamente prima e dopo la misurazione. A tal fine, abbiamo cercato un metodo con cui questo potrebbe essere realizzato.

Il nostro obiettivo era di preciso ed economico misurare temperatura corporea del mouse, senza la necessità di anestesia e senza restrizioni all'attività, per consentire l'osservazione dei fenotipi comportamentali durante e dopo il tempo di misurazione della temperatura. Per raggiungere questo obiettivo, era evidente che una tecnica meno invasiva rispetto alla temperatura rettale standard sonde è stato richiesta. Termometri a infrarossi sono stati utilizzati per decenni nella medicina clinica, soprattutto in pediatria, per ottenere letture accurate della temperatura. È stato un metodo alternativo che ha permesso ai medici di rapidamente e con precisione ottenere misure di temperatura in infanti ed in bambini disordinati che sono attivamente mobili. Abbiamo implementato questa stessa tecnica in topi e hanno sviluppato un metodo efficace per ottenere temperature senza anestesia. D'importanza, ci indicano che questo metodo è in grado di replicare i risultati di anafilassi sistemica passiva affermata sui cambiamenti di temperatura, essendo anche in grado di osservare l'attività del mouse durante la misurazione. Inoltre, usiamo lo stesso metodo per valutare le temperature del corpo di cibo-allergica topi, mentre contemporaneamente indaga su altri sintomi, per dimostrare che la temperatura corporea è infatti una riflessione accurata del livello di attività e fenotipo complessiva della mouse.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato di uso dell'Istituto La Jolla e cura degli animali per l'allergia e immunologia.

1. misurazione di temperatura del corpo Mouse durante amputate

1. Posizionare il mouse in una scatola di induzione di anestesia. Anestetizzare tramite flusso di 1 L/min di ossigeno con isoflurano 5%.
   Nota: Amputate è confermata quando il mouse smette di movimento volontario ed è stato immobile per più di 30 s. in alternativa, la frequenza respiratoria di monitor, e una volta topi stanno respirando a 1 respiro per ogni 2 s o più, viene confermata amputate.
2. Tenere il mouse per la nuca con un dito indice e pollice e tenere la coda con un dito mignolo al fine di esporre la parte inferiore dell'addome.
3. Posizionare il sensore del termometro a infrarossi sotto l'addome più basso tenendo il mouse con il suo corpo parallelo al suolo.
   Nota: La superficie esterna piana del termometro (non la superficie del sensore) dovrebbe essere circa 2 – 5 mm di distanza dalla superficie dell'addome. Questa replica risultati delle temperature misurate mentre topi non sono anestetizzati (descritto nella sezione 2). È importante determinare il sito di destinazione dell'addome. Che mira tra due capezzoli superiore consente risultati coerenti.
4. Tenere premuto il grilletto per misurare la temperatura. Garantire la tenuta stabile del mouse e termometro.

2. Mouse misurazione di temperatura del corpo senza anestesia

1. Sollevare il mouse entro la metà della coda.
2. Esporre l'addome del mouse.
   1. Consentire il mouse per tenere di una superficie di retti, come il labbro di una gabbia aperta o gabbia-top con le zampe anteriori.
      Nota: Questo permette il mouse allungare il suo corpo superiore ed esporre l'addome.
   2. In alternativa, permette il mouse per mantenere il bordo superiore dritto, del termometro e mettere il mouse a sedersi sulla superficie esterna piana del termometro con suo addome appena sopra il sensore a infrarossi.
      Nota: In qualsiasi momento che le zampe posteriori sono a riposo sulla superficie del termometro, assicurarsi che i piedi non ostruiscano il sensore dalla superficie addominale. Termometri con piede ostruzione misurerà una temperatura inferiore a quella dell'addome.
3. Tenere premuto il grilletto per misurare la temperatura.
   Nota: Topi tendono a muoversi; prendersi cura in misura costantemente la stessa posizione del corpo prendendo le misure di temperatura quando i topi sono relativamente meno mobili.

3. passivo anafilassi sistemica⁷

1. Giorno 0: Sensibilizzare con l'immunoglobulina E (IgE).
   1. Preparare 200 µ l (per topo) di IgE anti--dinitrophenyl (DNP) ad una concentrazione di 100 µ g/mL in PBS.
   2. Intraperitonealmente iniettare 200 µ l di IgE anti--dinitrophenyl (DNP) preparato solo in passo 3.1.1 o PBS (solo PBS è il controllo negativo). Utilizzare un ago da 26 G per iniezione. Eseguire le iniezioni solo laterale alla linea mediana, approssimativamente fra i due capezzoli più inferiori.
2. Giorno 1: Indurre anafilassi con DNP-HSA.
   1. Preparare 100 µ l (per topo) di DNP-HSA ad una concentrazione di 10 mg/mL a 0,9% NaCl.
   2. Anestetizzare i topi come descritto al punto 1.1.
   3. Misurare la temperatura corporea utilizzando la tecnica descritta nel passaggio 1.
   4. Iniettare per via endovenosa 100 µ l di DNP-HSA preparata al punto 3.2.1. Utilizzare un ago 30g per iniezione. Eseguire le iniezioni il seno venoso retroorbital. Inserire l'ago sul lato mediale dell'occhio un angolo poco profondo, con l'obiettivo dietro l'occhio.
   5. Dopo l'iniezione, posizionare i topi in gabbie individuali. Garantire che i topi recupero dall'anestesia. Osservare che si risvegliano e diventano volontariamente mobile.
   6. Misurare la temperatura corporea con il termometro a raggi infrarossi e osservare la loro attività ogni 10 min per 70 min.

4. Mouse modello di cibo allergia^8,9

Nota: Lo schema elettrico è mostrato in Figura 2.

1. Giorno 0: Sensibilizzare i topi con ovuli/allume.
   1. Preparare 100 µ l (per topo) di OVA (0,5 mg/mL) e allume (10 mg/mL) insieme in PBS. Vortice sull'impostazione bassa per 30 min.
   2. Anestetizzare i topi come descritto al punto 1.1.
   3. Utilizzando un ago da 26 G, intraperitonealmente iniettare ogni mouse con 100 µ l della miscela OVA/allume preparata al punto 4.1.1.
      Nota: Vortice la miscela di ovuli/allume ancora una volta, brevemente prima di ogni iniezione, al meglio garantire una miscela omogeneizzata. Vedere il punto 3.1.3 per i dettagli sul sito di iniezione.
   4. Dopo l'iniezione, topi posto indietro nelle loro gabbie originale. Garantire che i topi recupero dall'anestesia. Osservare che si risvegliano e diventano volontariamente mobile.
2. Giorno 14: Eseguire una seconda sensibilizzazione con ovuli/allume.
   1. Ripetere i passaggi da 4.1.1, 4.1.2 e 4.1.3.
3. Giorni 28-46: sfidare i topi con ovuli ogni altro giorno.
   1. Preparare 100 µ l (per topo) di OVA ad una concentrazione di 250 mg/mL in PBS.
      Nota: La miscela deve avvenire tramite dolcemente dondolandosi avanti e indietro a mano piuttosto che con un vortice per ridurre al minimo la formazione di bolle.
      1. Se usando gli inibitori di allergia alimentare, preparare l' inibitori⁹. Preparare 100 µ l (per topo) di inibitore ad una concentrazione di 1 mg/mL in PBS. Questo permette una consegna di 100 µ g di inibitore per ogni mouse.
         Nota: Non superare 100 µ l di inibitore per topo, come i topi sono solo in grado di gestire 200 µ l di volume totale mediante sonda gastrica durante il giorno una sfida. In 100 µ l sono necessari per la sfida di OVA pure, 100 µ l è il massimo volume per l'utilizzo dell'inibitore raccomandato.
   2. Anestetizzare i topi come descritto al punto 1.1.
   3. Oralmente mediante sonda gastrica ogni mouse con 100 µ l della soluzione OVA (25 mg di ovuli in 100 µ l di PBS gavaged per topo) che è stata preparata al punto 4.3.1.
      1. Se usando gli inibitori, utilizzano le stesse tecniche descritte di seguito per l'alimentazione mediante sonda gastrica di inibitore (o controllo PBS) preparata al punto 4.3.1.1 30 minuti prima della sfida di ovuli. Dopo 30 min, passare al passaggio successivo.
      2. Utilizzare un ago sonda gastrica con una siringa da 1 mL. Prendere 100 µ l di ovuli nella siringa.
      3. Inserire l'ago in bocca; quindi, puntando l'ago verso il lato sinistro o destro della gola, far scorrere delicatamente l'ago attraverso l'esofago. Iniettare 100 µ l di ovuli.
         Nota: Per assicurarsi che l'ago non è nella trachea, osservare attivo di respirazione prima di iniettare il OVA. L'inserimento dell'ago sarà anche essere resistito all'inizio se ha inserito la trachea anziché l'esofago.
   4. Posizionare i topi nelle loro gabbie individuali. Per l'osservazione facile della qualità delle feci, utilizzare gabbie senza biancheria da letto.
   5. Garantire il recupero dall'anestesia. Osservare che i topi risvegliano e diventano volontariamente mobili.
   6. Misurare la temperatura corporea dei topi a punti temporali 10, 20, 40 e 60 min utilizzando la tecnica descritta nella sezione 2.

Anafilassi sistemica passiva: per iniezione iv, 10 settimana vecchi topi BALB/c femminili sono stati anestetizzati. Prima dell'iniezione, abbiamo misurato la loro temperatura corporea (Video 1) come descritto nel passaggio 1. La figura 1 Mostra l'andamento della temperatura di entrambe le popolazioni dopo iniezione iv. Il mouse di IgE sensibilizzati ha mostrato un calo di temperatura massima di 3,0 ° C a 20 min, mentre il mouse di controllo PBS ha avuto un calo massimo di 1,1 ° C a 20 min⁷. Inoltre, durante questo processo, punteggi di attività sono stati valutati basato sulla mobilità di ogni mouse. Topi sono stati osservati prima senza qualsiasi agitazione. Quindi, sono stati osservati con agitazione introducendo mano del valutatore nella gabbia e un contatto morbido con il mouse. Basato sulle loro reazioni, i topi sono valutati e valutati su una scala da 1 a 3. Un punteggio pari a 1 indica un mouse che è immobile o minimamente mobile con e senza agitazione; un punteggio pari a 2 indica un topo che è immobile senza agitazione ed è mobile con agitazione senza fare movimenti rapidi evasivi; e un punteggio pari a 3 indica un topo che è mobile o immobile senza agitazione e mobile con agitazione e rende rapidi movimenti evasivi. Video 2 e 3 forniscono esempi dei due gruppi che esemplificano i metodi di misurazione di temperatura, nonché le misure di livello di attività corrispondenti. Utilizzo del termometro a infrarossi ammessi per misure di temperatura senza anestesia, che a sua volta ha permesso per la valutazione del fenotipo comportamentale prima, durante e dopo la misurazione della temperatura; al contrario, una sonda rettale tradizionale richiederebbe l'anestesia e pertanto esclude qualsiasi valutazione comportamentale entro alcuni minuti che circondano le misurazioni di temperatura.

Modello murino di cibo allergia⁸: lo schema elettrico del modello del topo è illustrato nella Figura 2. I topi sono topi BALB/c femminili di età 8-10 settimane di età al momento della sensibilizzazione. Topi sono stati osservati a 10, 20, 40 e 60 min dopo ogni sfida per temperatura corporea e l'attività. Un risultato rappresentativo è illustrato nella Figura 3 del cambiamento di temperatura durante la sfida 7. I topi hanno mostrato un calo di temperatura massima a 10 min; di conseguenza, le temperature di 10 min sono state utilizzate per correlare con le temperature del corpo ai livelli di attività 10 min (con il punteggio sulla base dei criteri sopra rappresentati). Temperatura e Punteggio di attività goccia ha mostrato una correlazione statisticamente significativa (Figura 4). Come accennato nella sezione passivo anafilassi sistemica, osservazioni comportamentali sono state eseguite a causa della mancanza di anestesia, e il termometro a infrarossi è stato utilizzato. Al contrario, sonde rettali sarebbero prevenire eventuali osservazioni comportamentali o valutazioni durante il tempo di misurazione della temperatura. Qualsiasi momento quella temperatura e altre attività fenotipi devono essere registrati, è essenziale utilizzare un sistema di misurazione della temperatura che non richiede anestesia.

Figura 1 : Anafilassi sistemica passivo in topi BALB/c. Due topi sono stati iniettati con IgE anti-DNP il giorno 0 di ip, quindi iv iniettati con salino normale o DNP-HSA il giorno 1. La temperatura corporea è stata misurata utilizzando un termometro a infrarossi prima dell'iniezione e ogni 10 min dopo l'iniezione per un minimo di 70 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Disegno schematico cibo allergia del mouse modello. Il giorno 0, topi BALB/c sono stati sensibilizzati ip con ovuli e allume e anche il giorno 14. Il giorno 28, 30 min prima di ogni sfida, topi gavaged oralmente con controllo PBS o un inibitore di allergia alimentare (fattore di rilascio istamina HRF-2CArecombinant con suoi due cisteine scambiati con alanine)⁹. Topi sono stati poi sfidati ig con 25 mg di ovuli. Le sfide sono state eseguite ogni altro giorno per 9 sfide. Topi sono stati osservati per la misurazione di temperatura del corpo e attività segnando a 10, 20, 40 e 60 min dopo la sfida. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Modello di allergia alimentare nei topi BALB/c. Variazione di temperatura dopo il 7 ° sfida di OVA è stata monitorata da termometro a infrarossi. I risultati tipici sono mostrati da almeno quattro esperimenti indipendenti (* *, p < 0.01 tra PBS e 2CA trattamenti di test t di Student; ns: non significativo). Barre di errore = SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Correlazione tra attività e temperatura a 10 min in esperimenti di allergia alimentare. I risultati riflettono le misurazioni ottenute dai 4 insiemi distinti di esperimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: misurazione della temperatura del corpo mentre topi sono anestetizzati. Misure di temperatura del corpo di topi possono essere assunto con o senza anestesia. Per le misure coerenti, è essenziale puntare sempre il termometro nella stessa posizione del corpo. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 2: livello di attività a 40 min dopo l'iniezione di DNP-HSA iv. Topi sono osservati senza agitazione inizialmente, poi con agitazione. Basato sulle loro reazioni, i topi sono stati valutati e segnati su una scala di attività da 1 a 3. Il mouse a sinistra (topo anti-DNP sensibilizzati) viene assegnato un punteggio pari a 1, mentre il mouse a destra (PBS controllo del mouse) viene assegnato un punteggio di 3. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 3: corpo di misurazione della temperatura a 40 min dopo l'iniezione di DNP-HSA iv. Questa figura dimostra la capacità del termometro a infrarossi con precisione e non invadente misura temperatura corporea senza amputate. Inoltre, i punteggi di attività ha dimostrati nel Video 2 riflettono il grado di abbassamento della temperatura misurata in questo video. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Video 4: errori nella lettura di hind temperatura zampa ostruzione del sensore. Questo video dimostra la differenza di temperatura con e senza il piede all'interno della circonferenza del sensore. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Il protocollo descritto è stato istituito con l'obiettivo di misurare la temperatura corporea senza l'uso dell'anestesia. Nonostante la sua relativa facilità con quale temperatura letture possono essere ottenute, ci sono diversi avvertimenti che ospitare questa tecnica, oltre agli effetti più evidenti come la gestione dello stress e presenza di differenti temperature.

In primo luogo, al fine di mantenere costante la temperatura letture in tutto l'esperimento, la posizione dove viene misurata la temperatura deve essere predeterminata utilizzando limiti anatomici, e gli investigatori devono essere in grado di replicare la misurazione del corpo ha detto posizione. Fissando le zampe anteriori del mouse su una superficie di retti, come il labbro di una gabbia o il bordo del termometro, l'addome è prontamente esposto al sensore a infrarossi del termometro. Generalmente, l'addome è una grande superficie che permette una certa flessibilità per ottenere risultati coerenti. Inoltre, l'addome ha capelli sparser rispetto alla superficie dorsale del mouse e pertanto consente una lettura più accurata della temperatura di corpo.

In secondo luogo, zampe posteriori devono sempre essere monitorate quando misurare la temperatura. Quando il termometro è vicino l'addome, i topi tendono a mettere i piedi sul termometro stesso. Quando i piedi o le dita dei piedi è all'interno della circonferenza del sensore, la lettura della temperatura può essere inferiore a quello dell'addome, come dimostrato nel Video 4. È importante consentire il mouse a cavallo con i piedi su entrambi i lati del sensore, mantenendo la circonferenza priva di parti del corpo o oggetti oltre la superficie addominale.

In terzo luogo, le superfici addominale di topi non possono essere bagnate quando si eseguono le misure. Una superficie bagnata altererà la capacità di termometro per misurare la temperatura con precisione; solitamente, la temperatura misurata sarà inferiore al valore effettivo. Questo problema può essere evitato mantenendo i topi in gabbie con biancheria fresca nel corso del periodo d'osservazione. Questo garantisce anche che la secchezza della superficie addominale è standardizzata ogni volta che le temperature sono misurate.

Infine, termometri a infrarossi hanno un margine di errore maggiore rispetto a sonde rettali, anche se solo leggermente. Il margine di errore per le misure con sonde rettali è ± 0,1 ° C, mentre per i termometri a infrarossi, è di ± 0,2 ° C. Questo margine di errore era minimo rispetto per le differenze globali nell'abbassamento della temperatura tra popolazioni nell'esperimento PSA. Ancora più importante, un progetto che richiede una differenza sottile come ± 0,1 ° C possono anche prevedere altri margine di errore problemi, indipendentemente dal fatto se un termometro a infrarossi o sonda rettale viene utilizzato. Durante la preparazione del presente protocollo, esso aveva anche dimostrato che c'è una molto buona correlazione tra temperature core corpo misurata dal transponder impiantabile temperatura e temperature superficiali del corpo misurate con i termometri ad infrarossi durante ipotermia indotta da lipopolisaccaride⁶.

Goccia di temperatura nel modello di allergia alimentare utilizzato non era stata osservata precedentemente^8,10. Lo standard per la valutazione era stato precedentemente per determinare la gravità del fenotipo diarrea segnando; Tuttavia, questo metodo mancava obiettività. Utilizzando il termometro a infrarossi, abbiamo mostrato quella temperatura sottile gocce potrebbero essere rilevati. Quindi eravamo in grado di correlare questi con livelli di attività, come i topi non sono stati anestetizzati durante la procedura. Questo metodo consente un veloce, accurato, facile da usare, non invasivo e poco costoso modo misurare la temperatura corporea nei topi pur essendo in grado di osservare altri fenotipi che altrimenti sarebbero saltati se topi sono anestetizzati per misurazioni di sonda rettale.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Assegni di ricerca in Kawakami lab è stato sostenuto dal NIH: R01 AR064418-01A1, R01 HL124283-01, R21 AI 115534-01 e R41AI124734-01.