Indagando i dannosi effetti di basso pressione sterilizzazione al Plasma sulla sopravvivenza di Bacillus subtilis spore utilizzando Live Cell microscopia

Questo protocollo illustra i passaggi consecutivi importanti necessari per valutare la pertinenza di monitoraggio parametri di vitalità e processi di riparazione del DNA nel rilancio di spore di Bacillus subtilis dopo il trattamento con plasma a bassa pressione di rilevamento proteine tramite microscopia confocale risolta in tempo e microscopia elettronica di esame di riparazione del DNA marcato con fluorescenza.

Sterilizzazione al plasma è una promettente alternativa ai metodi di sterilizzazione convenzionali per industriali, clinici e fini di volo spaziale. Bassa pressione del plasma (LPP) scarichi contengono un ampio spettro di specie attive, che portare alla rapida inattivazione microbica. Per studiare i meccanismi di sterilizzazione di LPP ed efficienza, usiamo spore di Bacillus subtilis il microrganismo da testare a causa della loro straordinaria resistenza contro procedure di sterilizzazione convenzionali. Descriviamo la produzione di monostrati di spore di Bacillus subtilis , il processo di sterilizzazione di plasma a bassa pressione in un doppio reattore al plasma accoppiato induttivamente, la caratterizzazione della morfologia di spore mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) e la analisi di germinazione e di conseguenza di spore per microscopia di cellule vive. Il principale obiettivo della specie del plasma è materiale genomico (DNA) e riparazione di lesioni al DNA plasma-indotta con il ritorno di spora è cruciale per la sopravvivenza dell'organismo. Qui, studiamo la capacità di germinazione delle spore e il ruolo del DNA di riparazione durante la germinazione delle spore e la conseguenza dopo il trattamento con LPP di rilevamento delle proteine di riparazione di fluorescente etichettati DNA (RecA) con microscopia di fluorescenza confocale risolta nel tempo. Trattati e strati monomolecolari della spora non trattati sono attivati per la germinazione e visualizzati con un microscopio invertito confocale cellule vive nel tempo di seguire la reazione di spore individuali. Le nostre osservazioni rivelano che la frazione di germinazione e superando le spore dipende la durata del LPP-trattamento raggiungendo un minimo dopo 120 s. RecA-YFP fluorescenza (proteina di fluorescenza giallo) è stato rilevato soltanto in poche spore e sviluppato in tutte le superando le cellule con una leggera elevazione in spore LPP-trattati. Inoltre, alcuni dei batteri vegetativi derivato da spore LPP-trattati hanno mostrate un aumento nel citoplasma e tendeva a lyse. I metodi descritti per l'analisi delle singole spore potrebbero essere esemplari per lo studio di altri aspetti della germinazione delle spore e la conseguenza.

Degli obiettivi principali dell'esplorazione dello spazio è la ricerca per le firme di forme di vita e biomolecole su altri corpi planetari e lune nel nostro sistema solare. Il trasferimento di microrganismi o di biomolecole di origine terrestre nelle zone critiche di esplorazione è di particolare rischio per influenzare lo sviluppo e l'integrità delle missioni di vita-rilevazione sui corpi planetari ad esempio Marte ed Europa¹. Le linee guida internazionali di protezione planetaria, fondata da comitato di ricerca spaziale (COSPAR) nel 1967, imporre norme rigorose sulle missioni con equipaggiati e robotiche per altri pianeti, le lune, asteroidi e altri corpi celesti e regolano la pulizia e sterilizzazione di un veicolo spaziale e componenti hardware critici prima di lanciare al fine di eliminare contaminanti microrganismi terrestri ed evitare la contaminazione incrociata di corpi celesti². Nell'ultimo decennio, l'applicazione dei plasmi termici ha guadagnato ampia attenzione nella ricerca biomedica e nutrizionale, così come nel volo spaziale applicazioni^3,4,5. Sterilizzazione al plasma è una promettente alternativa ai metodi di sterilizzazione convenzionali in quanto offre rapida ed efficace inattivazione microbica⁶, pur essendo delicato sensibili e materiali labili al calore. Gli scarichi del plasma contengono una miscela di agenti reattivi come i radicali liberi, particelle cariche, atomi neutri/eccitato, fotoni nell'ultravioletto (UV) e dello spettro ultravioletto vuoto (VUV) che portano alla rapida inattivazione microbica³. In questo studio, usiamo il plasma a bassa pressione generato dal doppio plasma accoppiato induttivamente a bassa pressione (DICP) fonte^7,8 per inattivare le endospore di Bacillus subtilis distribuiti sulla superficie di prova di vetro.

Batteri Gram-positivi della famiglia Bacillaceae sono ampiamente distribuiti in habitat naturali del suolo, sedimenti e aria così come in ambienti insoliti come in camera pulita e la stazione spaziale internazionale^{9,10 ,11}. La caratteristica più distinta del genere Bacillus è la capacità di formare endospores dormienti altamente resistente (in appresso denominato "spore") per sopravvivere in condizioni sfavorevoli, ad esempio svuotamento nutriente¹². Le spore sono generalmente molto più resistenti rispetto ai loro omologhi di cellula vegetativa per una varietà di trattamenti e stress ambientali, tra cui calore, UV, raggi gamma, essiccazione, rottura meccanica e prodotti chimici tossici, quali forti ossidanti o pH-cambiando agenti (recensiti in riferimenti^13,14) e sono quindi gli oggetti ideali per verificare l'efficienza dei metodi di inattivazione microbica. Poiché il DNA di genomic è il principale bersaglio del trattamento al plasma dei batteri^15,16, la riparazione di lesioni del DNA indotte da plasma (es. doppio filamento di DNA si rompe) su Spora revival è cruciale per la sopravvivenza di batteri^{13, 17}.

Quindi, studiamo la capacità di germinazione delle spore e il ruolo della riparazione del DNA durante la germinazione delle spore e la conseguenza dopo aver trattato le spore con plasma a bassa pressione dell'argon di seguenti spore individuali e riparare loro espressione di DNA marcato con fluorescenza proteina RecA con microscopia di fluorescenza confocale risolta nel tempo. Noi diamo una passo per passo le istruzioni del preparato di Bacillus subtilis spore negli strati monomolecolari per il raggiungimento di risultati di test riproducibili, il trattamento di monostrati di spora con plasma a bassa pressione per la sterilizzazione, la preparazione delle spore del plasma trattato per la valutazione ultrastrutturale mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia di tensione delle cellule a livello di singoli spore in concerto con il DNA attivo di monitoraggio processi che avvengono all'interno della cellula in risposta al trattamento al plasma di riparazione.

1. produzione di Spore di bacillus subtilis e purificazione

1. Per la produzione di spore, trasferire una cultura overnight di 5ml delle rispettive Bacillus subtilis ceppo, completato con gli antibiotici adatti, per mezzo di sporulazione a Schaeffer liquido 200 mL duplice-forza (per litro di brodo nutritivo di 16G, KCl 2 g, 0,5 g MgSO ₄* 7 H₂O, 2 mL 1 M Ca (NO₃)₂, 2mL 0,1 M MnCl₂ * • 4 H₂O, 2 mL 1 mM FeSO₄, 2mL 50% (p/v) glucosio¹⁸) e coltivarlo con vigorosa aerazione a 37 ° C per 72 h o fino a > 95% della cultura ha sporulate. Vengono utilizzate le spore dei seguenti ceppi: Bacillus subtilis PY79 (wild type) b. subtilis PY79ΔrecA:: neo (carente di proteine di riparazione del DNA RecA) b. subtilis PY79 recA-yfp:: gatto (RecA fuso con giallo proteina fluorescente [YFP]¹⁹).
2. Spore di prelievo mediante centrifugazione per 15 min a 3.000 x g in provette da 50 mL e purificare i campioni di passaggi ripetuti lavaggi (fino a 15 volte) utilizzando sterile distillata H₂O e controllo per lo stato di purezza e germinazione da microscopia di contrasto di fase. Assicurarsi che le sospensioni di spore consistono fuori fase-brillante spore (> 99%) e sono privi di cellule vegetative (canne), spore germinate (aspetto nero / grigio) e detriti cellulari, altrimenti ulteriori esperimenti di microscopia possono essere disturbati. Lavare il campione fino a purezza desiderato è raggiunto.
3. Determinato il titolo di spora di placcatura fuori 50 µ l di 10 volte diluizioni seriali su LB-agar (cioè: uso 30 µ l di campione + 270 µ l acqua sterile per un 01:10 diluizione. Prendere 30 µ l dalla diluizione di particolare a 270 µ l H₂O per una diluizione di 1: 100 e così via) per calcolare il CFU (unità formanti colonia) e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. Dopo la determinazione CFU, regolare il campione per 10⁹ spore / mL di concentrazione o diluizione con acqua sterile.

2. preparazione del campione di Aerosol-depositati Bacillus subtilis spore

Nota: Accumulo e sovrapposizione delle spore potrebbe portare a effetti di ombreggiamento durante il trattamento, che si traduce nella cinetica di inattivazione falsificati. Per ridurre al minimo questo problema, è necessario preparare i campioni spora di un aerosol-deposizione tecnica²⁰. Brevemente, controllare l'ugello di due-sostanza di alta precisione con un timer elettrico che regola la velocità di trasmissione liquido in concerto con il flusso del gas di trasporto pressurizzato (qui N₂). Disperdere il campione liquido iniettato attraverso l'ugello di uscita utilizzando il flusso di gas di azoto.

1. Posizionare un porta-campioni in forma di scorrevoli microscopici sterilizzati (per la cinetica di sopravvivenza) o rotondo 25 mm coprioggetti (per rilevamento fluorescente della riparazione del DNA processi/cLSM; microscopia a scansione laser confocale) all'interno dell'aerosol ad azionamento elettrico unità di spruzzatura in allineamento con l'ugello. La concentrazione di spore utilizzato deve corrispondere a un centuplo della concentrazione finale desiderata.
2. Trasferire 1 mL della cultura spora in all'ingresso del fluido di ugello e avviare il processo di spruzzatura di 0,1 s ad una pressione di 1,3 bar. La sospensione di spore spruzzato (1 x 10⁷) forma una pellicola sottile sul vetrino al microscopio che si asciuga rapidamente in pochi secondi per formare un monostrato di spora uniformemente distribuito. Conservare i vettori di campione trattato in un contenitore sterile a temperatura ambiente.

3. bassa pressione trattamento al Plasma

1. Preparare il sistema al plasma per il trattamento di campioni biologici e far funzionare il sistema a 5 Pa con plasma di argon a 500 W per 5 min. In questo modo, tutte le superfici del sistema sono pulite e riscaldate. Questo riduce attaccare delle molecole dall'aria ambiente, cioè azoto, ossigeno e acqua, mentre il sistema di ventilazione. Dopo il pretrattamento del sistema, sfogare la camera e posizionare i campioni con cura nel centro del recipiente del reattore con l'aiuto di vetro rack.
2. Utilizzare almeno tre replicati biologici. Chiudere la camera ed evacuare sotto 2 PA. in seguito, riempire il gas di processo nella camera. Regolare la pressione del sistema a 5 PA.
3. Dopo il tempo di processo definito, spegnere l'alimentazione di energia elettrica e gas e sfiatare accuratamente l'impianto per evitare che soffia i campioni dal portacampioni. Dopo ventilazione, rimuovere i campioni e i campioni per il parametro successivo nel sistema. Per non trattato al plasma controlli espongono campioni a vuoto solo (5 Pa) in presenza di gas di processo equivalente al tempo più lungo del plasma applicata.

4. il recupero e la valutazione della sopravvivenza di Spore

1. Preparare una soluzione di autoclavato 10% acetato polivinilico (PVA) e coprono il porta-campioni accuratamente con circa 500 µ l e lasciarli asciugare all'aria per 4 h. Strip off lo strato di PVA essiccato (ora contenente il campione di spora) utilizzando pinze sterili e trasferirlo in un mL 2 provetta di reazione. Aggiungere 1 mL di acqua sterile per il tubo e sciogliere lo strato PVA tramite vortex. Questa procedura porta a > 95% di recupero di spore e non influisce la loro capacità di germinazione²¹.
2. In serie di diluire il campione alle 01:10 in acqua sterile in una piastra a 96 pozzetti (cioè 270 µ l sterile H₂O + diluizione del campione/ex 30 µ l). Piastra di 50 µ l di ciascuna diluizione su agar nutriente brodo di Lisogenesi (LB), incubare le piastre a 37 ° C durante la notte ed enumerare il numero di colonie coltivate (CFU).

5. vivere microscopia cellulare e il monitoraggio dei processi di riparazione del DNA in germinazione di spore

1. Per esperimenti di germinazione, preparare il blocco di un LB-agar 1 mm spessore 1,5%, facendo bollire 700 µ l medium e dispensare in una capsula di Petri sterile microscopia. Dopo 10 min, tagliare un 8 x 8 mm x 1 platorello mm LB-agar con un bisturi sterile e trasferire l'agar con attenzione sopra i monostrati di spore che si riposano su lamelle di vetro di 25 mm.
   Nota: Questo passaggio è fondamentale per la visualizzazione dei singole spore e consentire seguendo la loro reazione, verso l'attivazione di germinazione indotta da agar nutriente. Così, il LB-agar serve a due scopi, (1) per fissare le spore in superficie, che evita la rilocalizzazione lungo la superficie e fuori fuoco ottico e (2) per attivare la spora per la germinazione.
2. Dopo aver percorso il campione con agar, trasferire il vetrino coprioggetti rapidamente in una camera di imaging e il microscopio i campioni con un microscopio a scansione laser confocale automatizzato con ottica invertita utilizzando un 63 X / 1.3 aereo apocromatico obiettivo a immersione in olio.
3. Eseguire la formazione immagine di fluorescenza (YFP) con un'eccitazione lunghezza d'onda di 514 nm ed emissione può essere rilevato tra 520 e 560 nm.
   1. Registrare immagini di campo chiaro nella scansione modalità utilizzando uno dei moltiplicatori di foto (percorso di luce trasmessa).
   2. Registrazione time-lapse serie con una potenza del laser del 2,6% e impostare l'apertura confocale a 5 unità arioso e a una frequenza di campionamento di 1 fotogramma al 30 s da 0 h a 5 h, a seconda dell'esperimento. È della nota particolare che alte dosi di monocromatico laser illuminazione a 514 nm completamente inibire la germinazione (Figura 1A, B).
4. Conservare i campioni a 37 ° C (umidità dell'aria ambiente) in una fase di riscaldamento durante l'intero processo di imaging. Utilizzare almeno tre replicati biologici per ogni condizione. In caso di aggregazione di spora, distribuzione multistrato spora o contaminazione da particelle di polvere, il blocco del trattamento al plasma ("shadowing") potrebbe verificarsi e attivare la germinazione delle spore ombreggiate (Figura 1C, D).

Figura 1: potenziali problemi osservati durante la microscopia a fluorescenza confocale tensione delle cellule di plasma trattato spore. (A, B) Inibizione della germinazione delle spore da alte dosi di monocromatico (514 nm) illuminazione del laser. (A) Panoramica (3 x 3 fotogrammi cucite) di b. subtilis (LAS72, RecA-YFP) spore 180 min dopo l'inizio della germinazione. Il telaio in mezzo è stato esposto a intervalli di 30 s ad alte dosi di luce laser (514 nm, potenza 70% laser), considerando che le regioni circostanti (= fotogrammi) non erano illuminate (immagine unita di campo chiaro canale e fluorescenza RecA-YFP; ordinato erano strutture causati dall'utilizzo di piatti con una griglia impresso 500 µm di imaging a 35 mm). (B) dimostra un 4 X vista ingrandita del confine tra la regione illuminato e non illuminati, mostrando che le spore, che sono stati esposti a dosi elevate di illuminazione laser monocromatico non ha fatto germogliare e crescere, mentre spore regioni non illuminato ripristino completamente ai batteri vegetativi esprimendo la fluorescenza brillante di RecA-YFP (segnale verde). (C, D) Spore coperto da particelle contaminanti o strati multipli di spore (frecce) sembra proteggere sottostante spore da inattivazione mediante trattamento al plasma e consentire loro germinazione e la conseguenza ("effetto di shadowing"). Spore (C) sono state trattate al plasma per 60 s e imaged 180 min dopo l'inizio della germinazione o (D) per 120 s e ripreso dopo 240 min Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. microscopia elettronica (SEM)

1. Utilizzare microscopia elettronica per fornire informazioni ultrastrutturali su morfologia superficiale delle spore del plasma trattato rispetto ai comandi non trattati. Cappotto di monostrati di spora secchi sulle lamelle con oro-palladio (3 nm) utilizzando un velo polverizza. Utilizzare un microscopio elettronico a scansione emissione di campo per i campioni, operati a 5 kV tensione di accelerazione tra cui un rivelatore di elettroni secondari in-lente per rivelare il contrasto di topografia di imaging.

7. analisi dei dati

1. Determinare la sopravvivenza di spora dal quoziente N/N₀, dove N è la media CFU dei campioni trattati e N₀ rappresenta la media CFU dei comandi non trattati sottovuoto. Tracciare l'inattivazione spora di trattamento del plasma dell'argon in funzione del tempo (in secondi). Tutti i dati si esprime come medie e deviazioni standard (n = 3).
2. Analizzare le immagini ottenute da formazione immagine di tensione delle cellule usando il software di imaging. Quantificare la percentuale di germinazione delle spore e superando dopo trattamento al plasma, conteggio spore in rappresentante fotogrammi all'inizio dell'esperimento, così come dopo 4 h. Per la determinazione del significato nelle analisi di sopravvivenza di spora, utilizzare One-way ANOVA-test (analisi della varianza) con software statistici). Valori di P < 0,05 sono considerati come statisticamente significativo.

Sopravvivenza del plasma-trattati Bacillus subtilis spore

Trattamento al plasma delle spore di b. subtilis utilizzati in questo studio indicano una diminuzione nella sopravvivenza all'aumentare della durata del trattamento al plasma (Figura 2). Spore del ceppo esprimendo il recA-gene fuso a YFP ha mostrato le curve di sopravvivenza simili a spore del ceppo wild-type, che indica che la modificazione genetica non ha effetti significativi sulla vitalità batterica. Spore del ceppo RecA-carenti presentano una maggiore sensibilità verso il trattamento del plasma rispetto alle spore del ceppo wild-type, dimostrando che la presenza del gene RecA sta riducendo plasma-indotta perdita di vitalità. Soprattutto a breve trattamento al plasma di 15 s (P <0,003) e 30 s (P < 0,004) causano una diminuzione significativa della vitalità in ceppi di RecA-carenti rispetto al wild-type e RecA-YFP ceppi. Dopo 90 s di trattamento al plasma, la vitalità di tutti i ceppi è ridotto di circa tre ordini di grandezza.

Figura 2: Sopravvivenza di b. subtilis spore da ceppi diversi dopo il trattamento con plasma di argon a bassa pressione. Sopravvivenza (media CFU di plasma trattato spore/media CFU di spore trattate sottovuoto; barre di errore rappresentano la deviazione standard) viene tracciata contro la durata del trattamento al plasma. PY79 (wild-type; circoli chiusi), LAS72 (RecA-YFP; cerchi grigi) e LAS24 (ΔrecA; aprire cerchi). Analisi statistica ha mostrato nessuna differenza significativa nella sopravvivenza di spora tra PY79 (non modificato RecA) e LAS72 (RecA-YFP-fusion).

Analisi ultrastrutturale delle spore del plasma-trattati da SEM

Per avere un'idea dell'impatto morfologico del plasma trattamento su spore, microscopia elettronica (SEM) era usato per analizzare la morfologia superficiale delle spore del plasma trattato rispetto ai trattati con vuoto spore (controllo). La superficie esterna delle spore di Bacillus subtilis rivelano caratteristiche longitudinale dorsale-come le strutture che sono costantemente visibili in tutti i trattati e non trattate spore (Figura 3). Trattamento al plasma fino a 30 s non induce nessun cambiamento significativo della morfologia superficiale spora rispetto al controllo (Figura 3A-C). Aumento della durata del trattamento al plasma (60-240 s) porta ad una superficie più granulare di spora (Figura 3D-F) e piccole crepe e fenditure possono essere osservate in spore trattate per 120 o 240 s. Inoltre, piccoli globuli derivano su superfici di spora (120 240 trattamenti di s, Figura 3E, Fe s), che è causato da materiale edito dal cappotto, corteccia o dall'interno nucleo²². Questi globuli coprono l'intera spora e possono essere trovati sulle strutture a forma di vena, nonché su superfici intermedie.

Figura 3: SEM di spore di Bacillus subtilis (LAS72, RecA-YFP) spruzzato su vetrini coprioggetti dopo trattamento al plasma a bassa pressione. Spore esposti per solo il vuoto e non al plasma (controllo) sono mostrate in (A). (B-F) Spore che sono state trattate al plasma con aumento della durata (15, 30, 60, 120 e 240 s). Spore che sono state trattate al plasma 60 s o appaiono più più granulare alla loro superficie di controllo spore o spore che sono state trattate al plasma per 15 e 30 s. crepe e fenditure (frecce bianche) sono visibili sulla superficie delle spore del plasma-trattati per 120 o 240 s. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Vivere microscopia delle cellule di plasma-trattati Bacillus subtilis spore

Microscopia di cellule vive di far rivivere le spore da ceppi di b. subtilis esprimenti la proteina di fluorescenza-etichettati riparazione RecA (RecA-YFP) viene eseguita al fine di analizzare la capacità di germinazione e l'espressione di RecA-YFP di spore individuali in risposta al trattamento al plasma. Qui, usiamo risolta in tempo scansione laser confocale per seguire la germinazione, crescita e progressione in stato vegetativo di plasma-trattati spore (Figura 4) per quanto riguarda problemi potenzialmente noti ad esempio lo shadowing effetti o il inibizione della germinazione di alte dosi di illuminazione laser monocromatica (Figura 1). Spore esposte al vuoto (controllo, Figura 4A-C), presentano alcuni segnali fluorescenti durante primi Stati di rinascita di spora (0 - 65 min, non mostrato). Quando si formano cellule vegetative e prime cellule iniziano a dividersi, è osservato un aumento nell'intensità di fluorescenza, molto probabilmente a causa di accumulo di RecA-YFP, ≥ 65 min. Tutte queste cellule harbor un segnale di fluorescenza accumulato in almeno una posizione all'interno di ogni cellula. Quasi tutte le spore (98 ± 2%; 589 ± 14, n = 4) trattati con vuoto come un controllo germinare e sviluppare una morfologia delle cellule a forma di bastoncino con una lunghezza piuttosto uniforme delle singole celle (Figura 4B-C). A differenza di spore nei controlli vuoto, spore trattati per 15 s con plasma già mostrano una ridotta facoltà germinativa di meno di 75 ± 4% (197 ± 8 spore, n = 3, Figura 4D-F), che indica che il trattamento al plasma induce il danno in spore dormienti, che impedisce la germinazione. Inoltre, la morfologia delle cellule di superando è diversa dalla morfologia delle cellule nei controlli. Le cellule crescono sia nei coni retinici estesamente lunghi (più tempo rispetto al controllo) o rimangono piccole e bastone nel cappotto spora (Figura 4G-io). Inoltre, più cellule allungate lisare con l'aumento della dimensione della cella (teste di freccia bianca, Figura 4F). Segnali di fluorescenza di RecA-YFP all'interno delle cellule sembrano essere leggermente aumentato in confronto dei segnali nelle cellule di controllo (Figura 4C, F), ma nessuna differenza significativa può essere osservata (non mostrata). Spore che sono stati al plasma trattati per 30 s germinare fino a 25 ± 6% (99 ± 4 spore, n = 3) e cellule vegetative in particolare sono in ritardo nella crescita in confronto al controllo spore e spore dopo 15 s di trattamento al plasma. Cellule vegetative sono piuttosto piccole e a forma di bastoncino, ma variano in lunghezza (Figura 4G-io). Tuttavia, possono lisare cellule di tutte le dimensioni durante tempi di incubazione più lunghi come visto per i campioni dopo 15 s di trattamento al plasma. Dopo 60 s di trattamento al plasma meno di 2 ± 2% (8 ± 8 spore, n = 3) spore sono in grado di formare cellule vegetative (Figura 4J-L). Le spore che vengono al plasma-trattati per 90, 120 o 240 s può essere analizzata, ma mostrano alcuna escrescenza o qualsiasi cambiamento nei livelli di fluorescenza di RecA-YFP (non mostrato).

Figura 4: Confocale laser-scanner live microscopia delle cellule di b. subtilis spore da un ceppo esprimendo RecA-YFP dopo trattamento al plasma e l'inizio della germinazione. Le spore sono state seguite nel tempo (una sola immagine per ogni 30 s) e immagini per tempo-punti 0, 2 e 4 h sono indicate. (A-C) Spore trattati con vuoto solo e non con il plasma (controllo) germinano e crescono a cellule vegetative (B) ed entrare in fase di crescita esponenziale (C). (D-L) Spore trattate per durata differente con il plasma di argon a bassa pressione mostrano differenze significative nella loro conseguenza rispetto alle spore del controllo (Vedi testo per maggiori dettagli). Trattamento di s (D-F), 15 (le frecce bianche rappresentano cellule vegetative, che recentemente lisato), (G-io) 30 s trattamento (teste di freccia nera visualizzare cellule vegetative, che erano piccole e bastone nel cappotto spora) e (J-L), 60 s dopo il tempo di recupero di spora 0 h, 2h e 4h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sterilizzazione di superfici con bassa temperatura, plasma a bassa pressione è una promettente alternativa alle procedure di sterilizzazione piuttosto convenzionali come il trattamento con radiazioni ionizzanti radiazioni, sostanze chimiche (ad es. gas come H₂O₂ o ossido di etilene) o calore secco e umido²³. Metodi di sterilizzazione ordinaria principalmente forniscono un'efficace sterilizzazione, ma essi sono noti per influenzare il materiale trattato e rappresentano un potenziale rischio per l'operatore. Plasma a bassa pressione offre una rapida ed omogenea inattivazione biologica utilizzando la composizione di diversi componenti come fotoni UV, elettroni liberi, ioni e usciti atomi o molecole (es. ROS). Di conseguenza, LPP può essere applicato a corrosione e calore - materiali sensibili, quali polimeri termoplastici per impianti, strumenti elettronici o 3D-strutture complesse. Nel presente documento abbiamo dimostrare l'applicazione di un sistema di test, in cui monostrati di spruzzato Bacillus subtilis spore²⁰ sono trattati in un reattore al plasma a bassa pressione particolare che è stato descritto recentemente nel dettaglio⁷. L'esame al microscopio del campo chiaro delle spore trattate al plasma può essere sufficiente per ottenere una stima complessiva dell'efficienza di sterilizzazione. Tuttavia, siamo interessati a destinazione i meccanismi di fondo di plasma a bassa pressione e la sua influenza sull'inattivazione di spora a livello molecolare. In combinazione con microscopia di fluorescenza-tracking ci permette di mettere in luce i dettagli di questa particolare risposta molecolare in spore del plasma-trattati e potenzialmente darci le comprensioni nel meccanismo di inattivazione fondamentali del plasma a bassa pressione.

Qui, ci concentriamo sull'analisi dell'efficienza di trattamento al plasma ed effetti mediante microscopia in tensione delle cellule, che permette di seguito spore individuale dopo l'inizio della germinazione. Sorprendentemente, questo particolare approccio rivela un paio di nuovi risultati che non possono essere forniti misurando la rivitalizzazione della popolazione intera spora utilizzando la determinazione del numero delle cellule o CFU. Prima di tutto, il trattamento al plasma di spore non riguarda solo la capacità di conseguenza in maniera dose-dipendente, come previsto dalla misura della sopravvivenza di determinazione di CFUs, ma anche la morfologia delle cellule vegetative, che spesso si sviluppano grandi canne Impossibile a setti di forma secondo la corretta divisione cellulare insieme a piccole cellule che attacca in spora (15 s di trattamento al plasma) o cellule ad una lunghezza ridotta (30 s di trattamento al plasma). Osservazioni delle cellule con lunghezza ridotta ha mostrato nessun recupero alla lunghezza delle cellule normali intervalli di tempo successivi. Inoltre, live cell imaging rivela che la maggior parte delle cellule morfologicamente alterate lisare alle fasi successive di osservazione. Questo significa che danni acquisiti dalle spore durante il trattamento al plasma sono efficaci solo in fasi successive della rivitalizzazione di spora, presumibilmente a causa di danno del DNA e che il macchinario utilizzato per la germinazione e la conseguenza è più robusto nei confronti di sterilizzazione al plasma rispetto i macchinari necessari per la crescita vegetativa. Notevolmente, espressione della proteina del DNA-riparazione RecA sembra essere bassa e quasi assente in spore e si sviluppa durante la fase vegetativa e la conseguenza, come indicato da un aumento di fluorescenza di RecA-YFP¹⁷. Tuttavia, anche una leggermente aumentata espressione di RecA in numero le spore del plasma-trattati, rispetto alle spore di controllo, non aiuta a salvare la vitalità delle cellule quantitativamente, perché la maggior parte delle cellule lisare o scoppiano dopo escrescenza, soprattutto dopo più di 3 ore di incubazione. Questo effetto può essere visualizzato utilizzando cellule vive film dalle immagini di lasso di tempo di spore germinate. Non possiamo escludere che questo effetto è sottovalutato dalla condizione particolare coltivazione dove le cellule sono costretti in un monostrato utilizzando un sottile overlay di agar.

Un altro risultato dell'analisi di microscopia diretta delle cellule è che contaminazioni del particolato (ad es. particelle di polvere, altre spore) sulla superficie dello strato monomolecolare spora possono mettere al riparo le spore sottostanti dagli effetti offensivi del plasma. In tali casi anche di più-trattamento al plasma sembra essere inefficiente. Poiché tali contaminazioni sono difficili da evitare completamente, strategie alternative di trattamento al plasma devono essere testate, come l'utilizzo di rotazione planetaria durante il trattamento al plasma in combinazione con estesa durata del trattamento. L'analisi al SEM indica che il cappotto di spora è perforato con aumento della durata del trattamento al plasma che è in linea con la teoria del plasma-mediata effetti sulla questione^22,24. Un tempo di esposizione prolungata (> 240 s) al plasma potrebbe anche perforare le particelle contaminanti e così può danneggiare e inattivare le spore sottostante.

Il protocollo presentato per microscopia di cellule vive di germinazione delle spore e la conseguenza può essere adatto per altri studi pure. Che coprono le spore con un sottile strato di agar costringe le spore in un distinto piano ottico e limita il movimento laterale. Entrambi gli effetti garantiscono che le spore e cellule numero rimangano entro la cornice selezionata di imaging. Approcci simili sono state descritte prima²⁵ ma forniscono che minore flessibilità rispetto al metodo descritto qui che permette di scegliere qualsiasi porta-campioni (ad es. una lastra di vetro, vetrino coprioggetto o capsula di Petri). Nelle nostre mani altri batteri vegetativi potrebbero essere analizzati da microscopia diretta cella utilizzando il metodo di agar-rivestimento). In ogni caso, esperimenti di controllo attenti dovrebbe essere eseguiti per valutare possibili effetti di danno della foto durante live cell imaging, perché abbiamo osservato che alte dosi di luce monocromatica laser completamente inibiscano la germinazione delle spore. Oltre a ridurre il tempo di illuminazione, cioè aumentando gli intervalli di osservazione, questo fenomeno può essere prevenuto riducendo l'intensità del laser e/o apertura del diaframma confocale (pinhole).

In sintesi, tra le tecniche utilizzate per lo studio di efficienza di trattamento al plasma nel modello di spruzzo Bacillus subtilis monostrati di spora, cellula viva microscopia fornisce approfondimenti unici di eventi cellulari durante il revival di spora e offre la possibilità per analizzare la dinamica di fluorescenza-etichettato proteine. Inoltre, la preparazione del campione particolare, cioè la copertura delle spore con un sottile strato di agar, potrebbe essere paradigmatico per l'imaging di altri microrganismi da microscopia di cellule vive.

Conflitti di interesse non dichiarati.

Gli autori ringraziano Andrea Schröder per la sua eccellente assistenza tecnica durante le parti di questo lavoro e Nikea J. Ulrich per la sua assistenza durante le riprese video. Vorremmo anche ringraziare Lyle A. Simmons per la sua generosa donazione dei ceppi di Bacillus subtilis : LAS72 e LAS24. Questo lavoro è stato supportato in parti da sovvenzioni dalla Fondazione di ricerca tedesca (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) a PA (AW 7/3-1) e RM (MO 2023/2-1) e DLR concedere DLR-FuW-Projekt ISS vita, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (a Giulio, M.R. e R.M.). F.M.F. è stata sostenuta da una borsa di studio di dottorato di ricerca dell'Helmholtz spazio Life Sciences Research School (SpaceLife) presso il centro aerospaziale tedesco (DLR) a Colonia, in Germania, che è stato finanziato dall'Associazione Helmholtz (Helmholtz-Gemeinschaft) per un periodo di sei anni ( Grant No. VH-Ko-300) e ha ricevuto fondi supplementari da DLR, tra cui il Comitato esecutivo aerospaziale e l'Istituto di medicina aerospaziale. I risultati di questo studio saranno tra la tesi di dottorato di Felix M. Fuchs.