Un metodo per testare l'efficacia della lavata a mano per la rimozione di nuovi patogeni infettivi

La lavata a mano è ampiamente raccomandata per prevenire la trasmissione delle malattie infettive. Tuttavia, non vi è alcuna prova su cui i metodi di lavaggio della mano sono più efficaci nella rimozione di patogeni delle malattie infettive. Abbiamo sviluppato un metodo per valutare l'efficacia dei metodi di lavaggio a mano alla rimozione dei microrganismi.

La lavata a mano è ampiamente raccomandata per prevenire la trasmissione delle malattie infettive. Tuttavia, esistono scarse prove comparabili sull'efficacia dei metodi di lavaggio a mano in generale. Inoltre, esistono poche prove che consentono di confrontare i metodi di lavaggio a mano per determinare quali sono i più efficaci per la rimozione di patogeni infettivi. È necessaria la ricerca per fornire prove sui diversi approcci di lavaggio a mano che possono essere utilizzati durante i focolai di malattie infettive. Qui viene descritto un metodo di laboratorio per valutare l'efficacia dei metodi di lavaggio a mano per rimuovere i microrganismi dalle mani e la loro persistenza nell'acqua di risciacquo. Le mani dei volontari sono dapprima forate con l'organismo di prova e poi lavate con ogni metodo di lavaggio a mano d'interesse. In generale, i microrganismi surrogati vengono utilizzati per proteggere i soggetti umani dalla malattia. Il numero di organismi che rimangono sulle mani dei volontari dopo il lavaggio viene testato utilizzando un metodo "succo di guanti" modificato: le mani vengono collocate in guanti con un eluE vengono sciacquati per sospendere i microrganismi e renderli disponibili per l'analisi mediante filtrazione a membrana (batteri) o test di placca (virus / batteriofagi). L'acqua di risciacquo prodotta dalla lavata a mano viene direttamente raccolta per l'analisi. L'efficacia del lavaggio manuale viene quantificata confrontando il valore di riduzione del log tra i campioni prelevati dopo lavaggio a campioni senza lavaggio a mano. La persistenza della risciacquatura dell'acqua è quantificata confrontando i campioni di acqua di risciacquo da vari metodi di lavaggio a mano a campioni prelevati dopo lavaggio a mano con acqua sufficiente. Mentre questo metodo è limitato dalla necessità di utilizzare organismi surrogati per preservare la sicurezza dei volontari umani, raccoglie aspetti di lavaggio a mano che sono difficili da replicare in uno studio in vitro e riempie le lacune di ricerca sull'efficacia della lavaggio e la persistenza degli organismi infettivi in ​​risciacquo acqua.

La lavata a mano è ampiamente raccomandata per prevenire la diffusione delle malattie, in particolare quelle trasmesse dalla via fecale-orale o aerea, comprese le malattie diarrea e respiratoria ¹ . Sorprendentemente, non vi è alcuna prova comparabile sull'efficacia dei metodi di lavaggio a mano, come la lavaggio a mano con sapone e acqua (HWWS) e con il liquido sanitario a base di alcol (ABHS), sulla rimozione di organismi dalle mani. La ricerca iniziale ha scoperto che l'azione meccanica della lavaggio a mano, al contrario del metodo di lavaggio a mano, può rappresentare la maggior parte delle rimozioni dell'organismo ^{2 , 3} . Inoltre, non vi è alcuna prova comparativa su quale metodo di lavaggio a mano è più efficace. In una revisione informale della letteratura, sono stati identificati 14 studi che hanno confrontato l'efficacia del sapone e del sanitizzatore delle mani sulla rimozione degli organismi. Di questi studi, cinque hanno trovato ABHS per essere più efficaci ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8} , sette trovarono HWWS per essere più efficaci ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15} e due non trovarono alcuna differenza significativa tra i metodi ^{16 , 17} . Questi risultati sono incoerenti e non affrontano il rischio continuo di malattia dalla persistenza degli organismi nell'acqua di risciacquo dopo la lavata a mano. Nel complesso, l'evidenza sull'efficacia comparata dei metodi di lavaggio a mano per la rimozione di patogeni causanti malattie infettive è limitata.

Questa prova limitata ha portato all'incertezza circa quali metodi sono più appropriati nelle impostazioni dell'epidemia. Per esempio, Durante l'epidemia di virus di Ebola (EVD) in Africa occidentale dal 2013 al 2016, numerosi intervistati internazionali hanno fornito raccomandazioni contraddittorie per HWWS, ABHS o soluzioni di cloro da 0,05%. Médecins Sans Frontières (MSF) raccomanda l'uso di una soluzione di cloro da 0,05% per la lavata a mano, mentre l'Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) raccomanda HWWS o ABHS (se le mani non sono visibilmente sporche). L'OMS va addirittura affermando che il cloro non deve essere utilizzato a meno che non siano disponibili altre opzioni, perché è meno efficace di altri metodi a causa della domanda di cloro esercitata dalla pelle ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22} . Inoltre, le soluzioni di cloro vengono comunemente prodotte da quattro diversi composti di cloro, tra cui l'ipoclorito ad alta test (HTH), l'ipoclorito di sodio localizzato e stabilizzato (NaOCl) e la sodioIodicloroisocianurato (NaDCC). Una revisione sistematica commissionata dall'OMS in risposta all'epidemia di EVD in Africa occidentale ha recentemente trovato solo quattro studi che indagano sull'efficacia comparativa della lavaggio a mano con cloro ²³ . Questi studi hanno inoltre prodotto risultati conflittuali e nessuno di questi studi ha utilizzato la concentrazione raccomandata di cloro dello 0,05% per la lavata a mano o studiati microorganismi simili al virus Ebola ^{10 , 24 , 25 , 26 , 27} . Pertanto, le raccomandazioni non sono state ritenute basate su prove e non era chiaro quali raccomandazioni erano più efficaci.

Sono necessarie ulteriori ricerche per confrontare gli approcci di lavaggio a mano per prevenire la diffusione degli agenti patogeni, poiché gli interventi di lavaggio a mano sono uno strumento importante per prevenire la trasmissione di malattie epidemiche. Questi hLe raccomandazioni di lavaggio devono essere basate su prove. Pertanto, è stato sviluppato un metodo per testare l'efficacia della lavaggio e la persistenza dell'acqua di risciacquo, eseguita con surrogati o agenti patogeni non infettivi, ^{2 , 28 e 29} . I risultati del campione, utilizzando Phi6 come surrogato per il virus Ebola e utilizzando Escherichia coli come un comune indicatore organismo, sono qui presentati. In questo protocollo viene presentata l'efficacia della lavaggio e il risciacquo delle prove di persistenza dell'acqua.

Dichiarazione di etica: Lo studio qui descritto (su Phi6 ed E. coli come surrogati per Ebola) è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale presso Tufts Medical Center e Tufts University Health Sciences Campus (# 12018); L'Università di Harvard ha ceduto la revisione al consiglio di revisione istituzionale di Tufts.

NOTA: Prima di iniziare questo protocollo, è necessario completare due passaggi. In primo luogo, deve essere identificata e selezionata una versione surrogata o non infettiva del livello 1 di biosicurezza (BSL-1) del patogeno da studiare e sicuro da usare sui soggetti umani. Per questo protocollo è necessario un surrogato BSL-1 o un agente patogeno non infettivo, in quanto l'organismo verrà utilizzato per inoculare le mani nude dei volontari umani. In secondo luogo, l'approvazione del consiglio di revisione istituzionale locale per condurre ricerche con soggetti umani deve essere ottenuta prima di assumere volontari o iniziare l'esperimento. Molti aspetti di questo protocollo possono essere regolati per soddisfare la tSpecifiche esigenze delle questioni di interesse.

1. Assunzione di soggetti umani ammissibili

1. Reclutare i volontari inviando volantini di carta su schede pubbliche e inviando e-mail a gruppi con membri che potrebbero essere interessati a partecipare. Questi annunci dovrebbero includere lo scopo dello studio, le informazioni di contatto ei criteri di ammissibilità.
2. Incontra i volontari per valutare l'idoneità. Confermare che i volontari sono sani, tra i 18 ei 65 anni, e non sono attualmente in gravidanza o prendono antibiotici e che non hanno danni / disturbi della pelle, allergie conosciute agli agenti lavaggio a mano o storia di problemi di salute mentale legati all'igiene.
3. Avere i volontari idonei leggere i moduli di consenso. Rispondi a tutte le domande che fanno e fai che il volontario e l'investigatore firmano due copie del modulo. Conservare una forma e fornire uno al volontario.
4. Amministrare un sondaggio di base, incluse le domande sulle informazioni demografiche, sulla personaLa storia delle condizioni della pelle e le informazioni sul comportamento recente lavaggio. Esaminare le mani per segni di dermatite, lesioni cutanee o anomalie della pelle di base ³¹ .
5. Pianificare i volontari per due sessioni di test per ogni organismo di interesse (uno per test con carico del suolo e uno per test senza). Indica ai volontari di evitare i prodotti antimicrobici per un periodo di lavaggio di sette giorni prima di eseguire test per evitare confusione dall'uso personale del prodotto.
   1. Fornire volontari con prodotti antimicrobici (shampoo, condizionatore e sapone) da usare al posto dei loro prodotti abituali. Fornire guanti in vinile pesanti e istruire i soggetti a indossarli quando si utilizzano prodotti come i prodotti per la pulizia della casa.

2. Preparare le soluzioni di lavaggio delle mani comunemente usate in risposta di emergenza (sapone, ABHS, 0,05% HTH, NaDCC e NaOCl Solutions)

NOTA: Le soluzioni di cloro possono essere preparate Fino a 12 ore prima dell'esperimento, ma degraderà se conservato> 12 h.

1. Scegliere e acquistare un sapone rilevante per il contesto per cui vengono eseguiti i test.
   NOTA: nella maggior parte dei casi, per le emergenze delle malattie infettive nel mondo in via di sviluppo, questa sarà una barra di sapone.
2. Scegliere e acquistare una soluzione ABHS pertinente per il contesto per cui vengono eseguiti i test.
   NOTA: L'ABHS scelto dovrebbe avere un contesto di alcool etilico superiore o pari al 70% per garantire l'efficacia.
3. Preparare una soluzione di ipoclorito di calcio (Ca (ClO) ₂ ) del 0,05% con l'aggiunta di granulare Ca (ClO) ₂ per l'ultrapurazione dell'acqua. Determinare la quantità di soluzione necessaria in base al numero di soggetti da testare.
   1. Utilizzando la seguente equazione, determinare la quantità di polvere necessaria per preparare la quantità desiderata di soluzione in un determinato volume di acqua utilizzando un dato percentuale di cloro disponibile:
      /files/ftp_upload/55604/55604eq1.jpg "/>
      NOTA: La polvere di Ca (ClO) ₂ presenta in genere il cloro disponibile al 60-80%.
4. Preparare una soluzione 0,05% di sodio dicloroisocyanurate (NaDCC) aggiungendo una polvere NaDCC granulare per ultrapure l'acqua.
   1. Utilizzando la seguente equazione, determinare la quantità di polvere necessaria per preparare la quantità desiderata di soluzione in un determinato volume di acqua utilizzando un dato percentuale di cloro disponibile:
      
      NOTA: la polvere di NaDCC in genere ha circa il 50% di cloro disponibile.
5. Preparare la soluzione stabile di 0,05% di NaOCl aggiungendo la soluzione di ipoclorito di sodio di riserva ad acqua ultrapure.
   1. Confermare la concentrazione della soluzione di zucchero NaOCl (probabilmente 5-8%) utilizzando un metodo di test di titolazione secondo le istruzioni del produttore ( ad esempio, titolazione iodometrica; vedere l'elenco dei materiali per il suKit ggested).
   2. Utilizzando i risultati del metodo di prova, calcolare la quantità di soluzione da aggiungere all'acqua utilizzando la seguente equazione:
      
6. Preparare la soluzione stabile di 0,05% NaOCl aggiungendo la soluzione di ipoclorito di sodio prodotta utilizzando un elettrochlorinator, acqua ultrapure e un cloruro di sodio di laboratorio (NaCl) all'acqua ultrapure.
   1. Preparare una soluzione al cloro di 1% con acqua e NaCl ultrapure, utilizzando un elettrochinatore secondo le istruzioni del produttore.
   2. Utilizzare un metodo di test di titolazione ( ad esempio, titolazione iodometrica) per confermare la concentrazione della soluzione di scorta di NaOCl ³² .
   3. Utilizzando i risultati del test, calcolare la quantità di soluzione da aggiungere all'acqua utilizzando la seguente equazione:
      
7. Confermare la cLa concentrazione di ciascuna delle soluzioni di lavaggio a mano del cloro usando un metodo di titolazione ( ad esempio, titolazione iodometrica) e regolare le soluzioni aggiungendo polvere / soluzione di origine clorosa o cloro fino a che non rientrino entro un errore del 10% della concentrazione di riferimento (0,045-0,055%).

3. Preparare gli organismi e il carico del suolo e combinare per produrre l'inoculo

NOTA: Nelle sottosezioni seguenti, E. coli e Phi6 sono utilizzati come organismi batterici e virali per la descrizione dei metodi.

1. Preparare l'organismo ad essere utilizzato per il test a una concentrazione superiore a 10 x 10 ₈ CFU / mL per i batteri e superiore a 10 x 10 ⁷ PFU / mL per i virus.
   1. Per preparare E. coli , strizza un ceppo non-patogeno di E. coli sulle piastre agar Luria-Bertani (LB) e incubare a 37 ° C per 24 ore per ottenere singole colonie. Conservare a 4 ° C.
      NOTA: questo può essere fatto severGiorni prima della sperimentazione.
      1. Un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, raccogliere una singola colonia dalla piastra e inoculare 10 ml di brodo LB utilizzando un ciclo sterile. Incubare per una notte a 37 ° C con agitazione.
      2. Nella mattinata dell'esperimento, iniziare una nuova cultura aggiungendo 1 ml della coltura durante la notte a 20 ml di brodo fresco di LB. Incubare per circa 2,5 ore per ottenere una densità cellulare superiore a 10 ⁸ CFU / mL.
      3. Utilizzare uno spettrofotometro per stimare la concentrazione della cultura.
         NOTA: Utilizzare un fattore di conversione stabilito in precedenza da una curva di standard per il ceppo E. coli utilizzato, assicurando una concentrazione superiore a 10 ⁸ CFU / mL ³³ . Se la densità delle cellule non è abbastanza alta, riportare la cultura all'incubatore e riprovare di nuovo fino a quando non sarà pronto.
   2. Confermare la concentrazione utilizzando la filtrazione a membrana ³⁴ .
      NOTA: eseguire le diluizioni seriali oLa coltura in soluzione salina fosfatizzata (PBS) in modo che la soluzione filtrata produrrà un numero contabile di colonie sulla lastra (il numero esatto dipenderà dal mezzo utilizzato).
      1. Impostare una fiamma e un collettore di filtrazione con imbuti filtranti sterili e un collegamento a vuoto. Sterilizzare la pinza fendendo con etanolo. Usalo per posizionare un filtro da 0,45 μm sul collettore di filtrazione, con la griglia rivolta verso l'alto. Bagnare il filtro con una piccola quantità di PBS sterile.
      2. Posizionare l'imbuto sulla base e aggiungere la soluzione di campione da lavorare pipettando o versando direttamente sul filtro. Impegnare il vuoto fino a quando l'intero campione è passato attraverso la membrana. Sciacquare i lati dell'imbuto con PBS sterile e impegnare nuovamente il vuoto.
         NOTA: i campioni devono essere di almeno 100 μL e fino a 100 ml. Se un campione è inferiore a 10 ml, aggiungere circa 20 ml di PBS all'imbuto filtrante prima del filtraggio per assicurare la filtrazione uniforme del campionele.
      3. Rimuovere l'imbuto, sterilizzare a fuoco la pinza e sollevare il filtro dalla base. Posizionare il filtro delicatamente sull'agar LB in un piatto di Petri, con la griglia rivolta verso l'alto, assicurandosi che il filtro si trovi in ​​filo contro la superficie. Invertire le piastre e incubare per 24 h a 37 ° C.
      4. Dopo 24 h, rimuovere le piastre dall'incubatore e contare le colonie E. coli . Utilizzare questi dati e il fattore di diluizione noto e il volume della soluzione per calcolare la concentrazione della soluzione filtrata in CFU / mL.
   3. Propagare Phi6 nell'ospite di Pseudomonas syringae utilizzando il metodo di overlay del doppio agar ³⁵ .
      1. Aggiungere 100 μL di sospensione di stock di Phi6 e 100 μl di P. syringae coltura per overnight direttamente a 6 ml di agar farmaco morbido dietetico (NBY) (0.3%). Versarlo su piastre con agar duro NBY (1,5%) e incubare per una notte a 26 ° C. Preparare piastre sufficienti per produrre inoculo sufficiente per l'esperimentoStimando una resa di circa 4 ml di sospensione virale per piastra.
      2. Il giorno dopo, aggiungere 5 ml di PBS sopra lo strato morbido agar. Lasciarlo a temperatura ambiente per 4 ore, recuperarlo con una pipetta e filtrarlo usando un filtro da 0,45 μm. Conservare a 4 ° C.
         NOTA: Questa soluzione servirà come inoculazione virale.
   4. Utilizzare un dosaggio a placca per confermare che la concentrazione è superiore a 10 ⁷ PFU / mL ³⁵ . Eseguire diluizioni seriali della sospensione virale in PBS in modo che 100 μL produca un numero contabile di placche sulla piastra.
      1. Pipettare 100 μl di un opportuno campione diluito e 100 μl di coltura host host overnight direttamente in un tubo contenente 6 ml di agar agile NBY. Versare agar agar su agar duro NBY e incubare a 26 ° C per 24 h.
      2. Il giorno dopo, togliere le piastre dagli incubatori e contare il numero di placche per piastra. Utilizzare questi dati e la nota diluizione faCtor e volume della soluzione per calcolare la concentrazione della soluzione filtrata in PFU / mL.
2. Preparare il carico del terreno tripartito, destinato a simulare il siero umano.
   1. Combinare 7,80 mg / mL di albumina bovina del siero, 10,92 mg / mL di tryptone e 2,52 mg / mL di mucina bovina per produrre il volume richiesto di carico del suolo. Dopo aver mescolato il carico del suolo, filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 μm per sterilizzare. Conservarlo a 4 ° C fino all'uso. Non scaldare sterilizzare, come le proteine ​​denatureranno.
3. Preparare una soluzione NaCl da 0,9% per miscelare l'inoculato per condizioni senza carico del terreno.
4. Immediatamente prima del test, preparare un inoculo composto da sospensione batterica o virale del 68% e carico del terreno del 32%. Ad esempio, utilizzare 1,02 ml di sospensione batterica o virale da punti 3.1.1.2 o 3.1.3.2 e 0,48 ml di carico del terreno (fase 3.2.1) o soluzione di NaCl dello 0,9% (fase 3.3). Girare o vortex delicatamente per mescolare.
   NOTA: 1,5 ml di questoL'inoculo verrà utilizzato per ogni volontario in ogni condizione, in modo da assicurare che il volume totale dell'inoculo preparato sia sufficiente per il numero di prove previsto.

4. Preparare i volontari per l'esperimento

NOTA: Determinare l'organismo e la condizione di carico del suolo da testare in quel giorno. Gli stessi volontari possono essere usati per testare molteplici condizioni, ma ogni volontario deve essere sottoposto ad un solo ciclo di test entro un periodo di 48 ore.

1. Prima di iniziare i test, confermare che i volontari rimangono idonei verbalmente verificando che essi hanno aderito al periodo di lavaggio antimicrobico a 7 giorni e confermando visivamente che non hanno sviluppato alcuna interruzione o anomalie sulla loro pelle.
2. Utilizzando un generatore di numeri casuali, assegnare a ciascun volontario di utilizzare la loro mano destra o sinistra per il campionamento in questo giorno di test. Assegnare un ordine in cui vengono eseguite le condizioni di lavaggio della mano.
   NOTA: perAd esempio, ABHS può essere assegnato # 3 e verrà eseguito terzo.
3. Eseguire un "lavaggio di pulizia" una volta all'inizio della prova per togliere la pelle di sporco e oli in modo che ogni test successivo sia condotto in condizioni equivalenti.
   1. Per eseguire un lavaggio di pulizia, eseguire ogni passaggio dell'esperimento (sezione 5), utilizzando un inoculato vuoto (solo brodo LB o PBS) e prelevando un campione senza lavaggio a mano.

5. Procedura sperimentale

1. Per testare il pH della pelle di ogni volontario (per controllare la variazione), posizionare una sonda pH della pelle a punta piatta sulla superficie della superficie palmare e lo spazio tra il puntatore e le dita medie. Assicurarsi che l'elettrodo sia piatto contro la pelle. Registrare la lettura del pH.
2. Spike le mani.
   1. Avere i volontari tazza entrambe le mani insieme. Spingere le mani con 1,5 ml dell'inoculo accuratamente pipettando 750 μL lentamente in ogni palmo.
   2. I volontari devono strofinare delicatamente le mani insieme fino a quando tutte le superfici della mano sono rivestite con l'inoculazione sottoponendo le mani a un minimo di attrito possibile.
   3. Avere i volontari tenere le mani ancora e lontano dal loro corpo per altri 30 secondi per consentire l'inoculazione ad asciugare. L'inoculato non può asciugare completamente.
3. Lavare le mani.
   1. Per tutti i seguenti passi di lavaggio, catturare l'acqua di risciacquo dalle mani in una grande borsa di raccolta del campione. Aggiungere 4,5 ml di una soluzione di tiosolfato di sodio al 12% alla sacca per neutralizzare il cloro in contatto e procedere entro 2 ore.
      NOTA: il tiosolfato di sodio dovrebbe essere aggiunto a tutti i campioni (anche quelli senza cloro) per controllare qualsiasi impatto che possa avere sull'organismo.
   2. Dopo l'inoculazione (sezione 5.2), lavare le mani con il metodo successivo nell'ordine indicato.
      1. Per il controllo A, non eseguire un passaggio lavaggio manuale e passare direttamente al passaggio5.5.
      2. Per il controllo B, lavare le mani con solo acqua ultrapure a temperatura ambiente (circa 21 ° C) attraverso un imbuto con una portata nota.
         NOTA: Qui è stata utilizzata una portata di 1,5 L / m e 500 mL di acqua.
      3. Per la lavata a mano con sapone bagnare le mani con 10 ml di acqua ultrapure. Avere i volontari schiuma le mani con sapone e poi strofinare le mani per altri 20 secondi. Sciacquare le mani versando 500 ml di acqua ultrapure a temperatura ambiente attraverso un imbuto a una portata di 1,5 L / m.
      4. Per tutte le soluzioni di cloro ( ad es. ABHS, HTH, NaDCC e NaOCl) versate 200 ml di soluzione di cloro attraverso un imbuto a una portata di 1,5 L / m e lasciare che il volontario strofinasse le mani.
4. Lavare a mano utilizzando una procedura succo di guanti modificato.
   1. Dopo la lavata a mano, mettere immediatamente la mano di ciascun volontario ( cioè la mano (destra o sinistra) selezionata per il testNel punto 4.2) in un sacchetto di campione contenente 75 mL di eluente ( ad esempio, PBS) fino al polso. Tenere la parte superiore della borsa stretto intorno al polso.
      NOTA: utilizzare un eluente per il campionamento che contiene sufficiente tiosolfato di sodio per neutralizzare qualsiasi cloro usato per la lavata a mano. PBS è un eluente comunemente usato per molti organismi.
   2. I volontari devono strofinare delicatamente la loro mano nella soluzione per 30 s, facendo attenzione a raggiungere tra le dita e sotto le unghie. Massaggiare la mano dall'esterno della borsa dolcemente per 30 secondi per assicurare che tutta la mano venga sciacquata completamente nell'elurante, fino al polso.
   3. Sigillare il sacchetto e lavorarlo secondo il dosaggio appropriato, descritto nella sezione 6, entro 2 ore.
5. Decontaminazione.
   1. Prima di ripetere il processo con ogni metodo di lavaggio a mano, i volontari devono lavare le mani in un lavandino con sapone e acqua calda. Spruzzare il volontarioRs con il 70% di etanolo finché non sono rivestiti su entrambi i lati. Lasciarli asciugare.
   2. Ripetere tutti i passaggi della sezione 5 per ogni condizione di lavaggio della mano, solo utilizzando la mano selezionata a caso nella fase 4.2 ( Figura 1 ).

6. Quantificazione

1. Eseguire saggi appropriati per l'organismo scelta ( ad es., Filtrazione a membrana per batteri o analisi delle placche per i virus, descritta in precedenza nelle sezioni 3.1.2 e 3.1.4).
2. Dopo aver contato le piastre, registrare la stimata CFU / mL o PFU / mL per ogni prova delle analisi (sezioni 3.1.2 e 3.1.4).

7. Analisi

1. Utilizzando i risultati della fase 6.2, calcolare il valore di riduzione del log degli organismi sulle mani, per ogni organismo e lo stato di carico del suolo e per ogni soggetto e metodo di lavaggio a mano.
   1. Per l'efficacia del lavaggio a mano, confrontare la concentrazione di batteri / virus in ciascuno Il lavaggio del lavaggio del campione per controllare A (nessun lavaggio a mano). Per la persistenza dell'acqua di risciacquo, confrontare ogni campione dell'acqua di risciacquo per controllare B (lavaggio solo con acqua). Utilizza la seguente formula standard:
      Riduzione del registro (lavaggio a mano ) =
      Riduzione registro (acqua risciacquata ) =
      NOTA: la riduzione del registro può anche essere espressa come log ₁₀ (senza lavaggio a mano) - log ₁₀ (con lavaggio a mano)
2. Utilizzare un'analisi di varianza ripetuta in una sola misura (ANOVA) per valutare le differenze significative nei valori di riduzione del log calcolati tra i metodi di lavaggio e un test HSD di Tukey post-hoc per modelli significativi per valutare in coppia le differenze significative (p <0.05)Ef "> 36.
   1. Prima di eseguire l'ANOVA, valutare ogni set di dati per la sfericità ( ad esempio, utilizzando il test di Bartlett). Applicare una correzione ( ad esempio, la correzione di Greenhouse-Geisser) quando il test indica che la sfericità è stata violata ³⁷ .

Qui, il protocollo ( Figura 1 ) è stato completato con 18 volontari, che sono stati testati sia con E. coli che Phi6. Differenze significative sono state riscontrate tra i risultati di lavaggio a mano con E. coli sia con e senza carico del suolo e Phi6 con carico del suolo ( Figura 2 e Figura 3 ). Per E. coli senza carico del suolo, la lavata a mano con HTH, NaDCC e NaOCl stabilizzata ha portato ad una riduzione significativa di log rispetto alla lavaggio a mano solo con acqua (F (6,102) = 2,72, p = 0,034). Con il carico del suolo, HTH ha portato ad una riduzione significativa di log di E. coli rispetto all'acqua solo, HWWS e ABHS (F (6,102) = 3,94, p <0,001). Non esisteva alcuna differenza significativa tra i metodi per Phi6 senza carico del suolo (F (6,66) = 2,04, p = 0,073). Tuttavia, per Phi6 con carico del suolo (F (6,102) = 7,01, p <0,001), l'acqua da sola ha prodotto un greRiduzione del log di ABHS o stabilizzato NaOCl e HWWS in una riduzione più grande di log di ABHS, stabilizzato NaOCl e generato NaOCl. HTH aveva anche una riduzione più grande di log rispetto a ABHS e stabilizzato NaOCl, e NaDCC ha portato ad una riduzione maggiore del log rispetto a NaOCl e ABHS stabilizzati. Mentre HTH è stato eseguito in modo più coerente nelle condizioni, avremmo cautela nei confronti dell'eccessiva interpretazione di risultati significativi, in quanto molti intervalli di confidenza sono stati grandi, che vanno da meno di 0,5 log a più di 1,5 log reduction in molti casi.

Nell'acqua di risciacquo, il cloro ha determinato una riduzione significativa di log di E. coli persistente nell'acqua di risciacquo rispetto a HWWS (senza carico del suolo, F (4,68) = 331,7, p <0,001; con carico del terreno, F (4,68 ) = 162,44, p <0,001) ( Figura 4 ). Questo stesso modello è stato trovato in Phi6 senza carico del suolo ((F (4,43) = 8,95, P <0,001), con tutte le soluzioni di cloro con conseguenteUna riduzione nettamente maggiore di Phi6 nell'acqua di risciacquo che HWWS. Non esistono differenze significative nella persistenza nell'acqua di risciacquo con Phi6 e carico del terreno ((F (4,67) = 3,35, p = 0,071) ( Figura 5 ).

Figura 1: Panoramica sull'esperimento. Le cinque fasi intraprese per ciascun ciclo di lavaggio a mano comprendono: 1) test di pH, 2) inoculazione delle mani, 3) lavaggio a mano, 4) lavaggio delle mani e 5) decontaminazione delle mani per ognuna delle otto condizioni esaminate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: lavaggio a mano di E. coli ULT. Rispetto a nessun lavaggio a mano, i metodi di lavaggio a mano hanno provocato una riduzione media di log in E. coli di 1,94-3,01 senza carico del suolo e 2,18-3,34 con carico del suolo. La lavata a mano con acqua ha dimostrato la minima riduzione di E. coli in entrambe le condizioni (1,94 e 2,18 log). La lavata a mano con NaDCC ha determinato la massima riduzione senza carico del terreno (3,01) e HTH ha portato la più grande riduzione con carico del terreno (3,34). Nei grafici, la riga rappresenta la riduzione percentuale degli organismi e le barre di errore rappresentano l'errore standard della riduzione del registro. Ctrl B, controllo B; HWWS, lavaggio a mano con sapone; ABHS, sanitizzatore manuale a base di alcool; HTH, ipoclorito ad alta prova; NaDCC, sodio dicloroisocianurato; St NaOCl, ipoclorito sodico stabilizzato; Gen NaOCl, generò ipoclorito di sodio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: risultati di risciacquo a mano di E. coli . Rispetto al lavaggio a mano solo con acqua, la riduzione media del tronco di E. coli rimanente nell'acqua di risciacquo è stata di 0,28-4,77 senza carico del suolo e 0,21-4,49 con carico del terreno. Sia con e senza carico del suolo, la più piccola riduzione è stata trovata nella lavaggio a mano con sapone (0,28 e 0,21). Le maggiori riduzioni sono state osservate con NaOCl stabilizzato e generato senza carico del suolo (entrambi 4.77) e con HTH e generato NaOCl con carico del terreno. Nei grafici, la riga rappresenta la percentuale di riduzione degli organismi e le barre di errore rappresentano le sErrore tandard della riduzione del registro. HWWS, lavaggio a mano con sapone; ABHS, sanitizzatore manuale a base di alcool; HTH, ipoclorito ad alta prova; NaDCC, sodio dicloroisocianurato; St NaOCl, ipoclorito sodico stabilizzato; Gen NaOCl, generò ipoclorito di sodio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: risultati di risciacquo a mano di Phi6. Rispetto al lavaggio a mano solo con acqua, la riduzione media di log del Phi6 rimanente nell'acqua di risciacquo è stata di 1,26-2,02 senza carico del suolo e 1,30-2,20 con carico del terreno. Con il carico del suolo, la riduzione minima è stata trovata nella lavaggio a mano con sapone (1,26). Senza carico del terreno, HTH ha portato alla riduzione minima (2,02). Le maggiori riduzioni sono state osservate con e senza carico del suolo con NaDCC(2,02 e 2,20). Nei grafici, la riga rappresenta la riduzione percentuale degli organismi e le barre di errore rappresentano l'errore standard della riduzione del registro. HWWS, lavaggio a mano con sapone; ABHS, sanitizzatore manuale a base di alcool; HTH, ipoclorito ad alta prova; NaDCC, sodio dicloroisocianurato; St NaOCl, ipoclorito sodico stabilizzato; Gen NaOCl, generò ipoclorito di sodio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

The method described here provides an approach for testing handwashing efficacy in a controlled laboratory setting. This method highlights the use of human volunteers and surrogate, non-infectious organisms. Using the method, it was possible to demonstrate differences in: 1) the efficacy of handwashing methods and 2) organism persistence in rinse water. The purpose of presenting this protocol is to provide a general framework that can be adapted to test a wide range of surrogate organisms and handwashing methods relevant to infectious disease.

During the use of the method, two key data quality recommendations were noted as important. First, the inoculate must be applied both as similarly as possible across the rounds of testing and in a manner, that minimizes loss. This is to ensure that sufficient inoculate is applied to the hands to allow for statistically significant results. Second, be sure to complete the "cleansing wash" step, in which the protocol is performed without handwashing prior to testing, as previous work has shown that there are likely to be significant differences between a first wash and subsequent washes, but not between subsequent washes performed after a cleansing round²⁹. Additionally, this step clears residual hand contamination, which would interfere with results.

The main limitation of this protocol is that it can be uncomfortable for volunteers. During each round of testing, which lasted about 2 h, volunteers' hands became cold. Some volunteers reported mild pain from their hands being constantly wet. Additionally, after a few rounds of testing, volunteers' hands became supersaturated, no longer fully drying between rounds. Although the randomization of the order of handwashing methods for each volunteer accounted for supersaturation, it is possible that the supersaturation could act as a confounding or modifying factor in this type of testing. To address this limitation, it is recommended that volunteers are appraised of this risk during consent disclosures and are reminded of their right to drop out of the study at any time. Volunteers should not undergo testing for more than 2 h per day to allow time for the hands to return to a baseline state and to minimize discomfort. A second limitation is the need to use a surrogate organism or non-infectious variant of a pathogenic organism to protect the health of volunteers. This might cause concern about the generalizability of results. However, for some pathogenic organisms (such as the Ebola virus), this limitation cannot be ethically overcome. Care must be taken during surrogate organism selection. Lastly, this is a laboratory study on efficacy. Results may only translate to effective disease prevention in real-word contexts where handwashing methods are made accessible to those in need and are used properly and consistently.

This protocol draws on previous work on handwashing efficacy but attempts to streamline methods and emphasizes the use of human hands (rather than surrogate surfaces) for testing. Additionally, rinse water is a transmission risk that had previously not been assessed. Existing studies on handwashing efficacy vary in methodology, leading to non-comparable data. We hope that standardized protocols for conducting handwashing method comparisons will encourage comparable and replicable results. Previous work has demonstrated that in vitro testing on surrogate surfaces such as pig skin, where, for example, the actual Ebola virus could be used, produced results that do not match those found after testing on human hands³⁸. Therefore, a method using human hands and surrogate or non-infectious organisms is currently the best available approach to estimate handwashing efficacy and rinse water persistence for infectious microorganisms.

Handwashing is critical to prevent disease transmission. However, there is a lack of evidence on the comparative efficacy of handwashing methods that are commonly recommended. This protocol can be used to generate evidence about handwashing efficacy and rinse water persistence. This is especially important for infectious diseases with the potential to cause large outbreaks, such as the Ebola virus. We hope that other researchers will find this protocol useful to generate much-needed additional evidence on handwashing method efficacy and rinse water persistence that will assist in developing recommendations to reduce the transmission of infectious diseases.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agenzia degli Stati Uniti per lo Sviluppo Internazionale, Ufficio di Assistenza Estera Del Disastro (AID-OFDA-A-15-00026). Marlene Wolfe è stata sostenuta dalla National Science Foundation (sovvenzione 0966093).