Un método para probar la eficacia del lavado de manos para la eliminación de patógenos infecciosos emergentes

El lavado de manos es ampliamente recomendado para prevenir la transmisión de enfermedades infecciosas. Sin embargo, hay poca evidencia de que los métodos de lavado de manos sean más eficaces para eliminar patógenos de enfermedades infecciosas. Se desarrolló un método para evaluar la eficacia de los métodos de lavado de manos en la eliminación de microorganismos.

El lavado de manos es ampliamente recomendado para prevenir la transmisión de enfermedades infecciosas. Sin embargo, hay poca evidencia comparable sobre la eficacia de los métodos de lavado de manos en general. Adicionalmente, existe poca evidencia que compara los métodos de lavado de manos para determinar cuáles son los más eficaces para eliminar patógenos infecciosos. Se necesitan investigaciones para aportar pruebas de los diferentes enfoques del lavado de manos que pueden emplearse durante los brotes de enfermedades infecciosas. Aquí se describe un método de laboratorio para evaluar la eficacia de los métodos de lavado de manos en la eliminación de microorganismos de las manos y su persistencia en el agua de enjuague. Las manos de los voluntarios se puntean primero con el organismo de prueba y luego se lavan con cada método de lavado de manos de interés. En general, los microorganismos sustitutivos se utilizan para proteger a los seres humanos de la enfermedad. El número de organismos que permanecen en las manos de los voluntarios después del lavado se prueba usando un método modificado de "jugo de guante": las manos se colocan en guantes con un eluY se lavan para suspender los microorganismos y hacerlos disponibles para su análisis por filtración en membrana (bacterias) o ensayo de placa (virus / bacteriófagos). El agua de enjuague producida por el lavado de manos se recoge directamente para su análisis. La eficacia del lavado de manos se cuantifica comparando el valor de reducción logarítmica entre las muestras tomadas después del lavado de manos y las muestras sin lavado de manos. La persistencia del agua de enjuague se cuantifica comparando muestras de agua de enjuague de varios métodos de lavado de manos con muestras recogidas después de lavarse las manos con agua justa. Aunque este método está limitado por la necesidad de usar organismos sustitutivos para preservar la seguridad de los voluntarios humanos, captura aspectos del lavado de manos que son difíciles de replicar en un estudio in vitro y llena vacíos de investigación sobre la eficacia del lavado de manos y la persistencia de organismos infecciosos en el enjuague agua.

El lavado de manos es ampliamente recomendado para prevenir la propagación de enfermedades, particularmente las transmitidas por vía fecal-oral o aérea, incluyendo enfermedades diarreicas y respiratorias ¹ . Sorprendentemente, hay poca evidencia comparable sobre la eficacia de los métodos de lavado de manos, como el lavado de manos con jabón y agua (HWWS) y con desinfectante de manos a base de alcohol (ABHS), en la eliminación de organismos de las manos. La investigación inicial ha encontrado que la acción mecánica del lavado de manos, en comparación con el método de lavado de manos, puede explicar la mayor parte de la eliminación del organismo ^{2 , 3} . Además, hay poca evidencia comparativa sobre qué método de lavado de manos es más eficaz. En una revisión informal de la literatura, se identificaron 14 estudios que compararon la eficacia del jabón y el desinfectante para las manos en la eliminación de organismos. De estos estudios, cinco encontraron ABHS para ser más eficaz ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8} , siete encontró HWWS a ser más eficaces ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15} , y dos no encontraron diferencias significativas entre los métodos ^{16 , 17} . Estos hallazgos son inconsistentes y no abordan el riesgo continuo de enfermedad por la persistencia de organismos en el agua de enjuague después del lavado de manos. En general, las pruebas sobre la eficacia comparativa de los métodos de lavado de manos para la eliminación de patógenos causantes de enfermedades infecciosas son limitadas.

Esta evidencia limitada ha llevado a la incertidumbre sobre qué métodos son los más apropiados en los ajustes del brote. Por ejemplo, Durante el brote de Ebola Virus Disease (EVD) en África Occidental de 2013 a 2016, varios grandes respuestas internacionales proporcionaron recomendaciones contradictorias para HWWS, ABHS o soluciones al 0,05% de cloro. Médecins Sans Frontières (MSF) recomienda el uso de solución de cloro al 0,05% para el lavado de manos, mientras que la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda HWWS o ABHS (si las manos no están visiblemente sucias). La OMS llega a afirmar que el cloro no debe utilizarse a menos que no haya otras opciones disponibles, ya que es menos eficaz que otros métodos debido a la demanda de cloro ejercida por la piel ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22} . Además, las soluciones de cloro se producen comúnmente a partir de cuatro compuestos de cloro diferentes, incluyendo hipoclorito de alta prueba (HTH), hipoclorito de sodio generado localmente y estabilizado (NaOCl), y sodDicloroisocianurato de ium (NaDCC). Una revisión sistemática encargada por la OMS en respuesta al brote EVD en África Occidental recientemente encontró sólo cuatro estudios que investigan la eficacia comparativa del lavado de manos con cloro ²³ . Estos estudios también produjeron resultados contradictorios, y ninguno de estos estudios utilizó la concentración de cloro recomendada del 0,05% para el lavado de manos o investigó microorganismos similares al virus Ebola ^{10 , 24 , 25 , 26 , 27} . Por lo tanto, no se encontró que las recomendaciones estuvieran basadas en pruebas científicas y no estaba claro cuáles de las recomendaciones eran más eficaces.

Se necesitan más investigaciones para comparar los métodos de lavado de manos para prevenir la propagación de patógenos infecciosos, ya que las intervenciones de lavado de manos son una herramienta importante para prevenir la transmisión de enfermedades epidémicas. Estos hY las recomendaciones de lavado deben basarse en pruebas. Por lo tanto, se desarrolló un método para probar la eficacia del lavado de manos y la persistencia del agua de enjuague, realizada con sustitutos o patógenos no infecciosos2 ^{, 28 , 29} . Se presentan aquí los resultados de la muestra, usando Phi6 como un sustituto del virus Ebola y usando Escherichia coli como un organismo indicador común. En este protocolo se presentan las pruebas de eficacia de lavado de manos y de persistencia del agua de enjuague.

Declaración de Ética: El estudio descrito aquí (en Phi6 y E. coli como sustitutos de Ebola) fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional en Tufts Medical Center y Tufts University Health Sciences Campus (# 12018); La Universidad de Harvard cedió la revisión a la Junta de Revisión Institucional de Tufts.

NOTA: Antes de comenzar este protocolo, deben completarse dos pasos. En primer lugar, se debe identificar y seleccionar una versión suplente o no infecciosa del patógeno a estudiar que sea seguro para usar en sujetos humanos, de nivel de bioseguridad 1 (BSL-1) ³⁰ . Un BSL-1 sustituto o patógeno no infeccioso es necesario para este protocolo, ya que el organismo se utilizará para inocular las manos desnudas de los voluntarios humanos. En segundo lugar, la aprobación de la Junta de Revisión Institucional local para realizar la investigación con sujetos humanos debe obtenerse antes de reclutar voluntarios o comenzar el experimento. Muchos aspectos de este protocolo pueden ajustarse paraE necesidades específicas de las cuestiones de investigación de interés.

1. Reclutar sujetos humanos elegibles

1. Reclutar voluntarios publicando volantes de papel en tablones de anuncios públicos y enviando correos electrónicos a grupos con miembros que puedan estar interesados ​​en participar. Estos anuncios deben incluir el propósito del estudio, la información de contacto y los criterios de elegibilidad.
2. Reúnase con los voluntarios para evaluar la elegibilidad. Confirme que los voluntarios son saludables, entre las edades de 18 y 65 años, y no están actualmente embarazadas o tomando antibióticos y que no tienen daño / trastornos de la piel, alergias conocidas a los lavavajillas o antecedentes de problemas de salud mental relacionados con la higiene.
3. Haga que los voluntarios elegibles lean los formularios de consentimiento. Responda cualquier pregunta que haga y haga que el voluntario y el investigador firmen dos copias del formulario. Conserve un formulario y proporcione uno al voluntario.
4. Administrar una encuesta de base, incluyendo preguntas sobre información demográfica, personaLa historia de las condiciones cutáneas y la información sobre el comportamiento reciente del lavado de manos. Examine las manos para detectar signos de dermatitis, lesiones cutáneas o alteraciones de la línea base de la piel ³¹ .
5. Programe a los voluntarios para dos sesiones de prueba para cada organismo de interés (uno para pruebas con carga de suelo y otro para pruebas sin). Instruya a los voluntarios para que eviten los productos antimicrobianos durante un período de lavado de siete días antes de la prueba para evitar confundir con el uso del producto personal.
   1. Proporcionar a los voluntarios con productos antimicrobianos (champú, acondicionador y jabón) para usar en lugar de sus productos habituales. Proporcionar guantes de vinilo resistente e instruir a los sujetos a usarlos cuando se utilizan productos tales como productos de limpieza de la casa.

2. Preparar soluciones de lavado de manos comúnmente utilizadas en respuesta a emergencias (jabón, ABHS, soluciones de 0,05% HTH, NaDCC y NaOCl)

NOTA: Las soluciones de cloro pueden ser prep Hasta 12 h antes del experimento, pero se degradará si se almacena> 12 h.

1. Elija y compre un jabón relevante para el contexto para el que se está realizando la prueba.
   NOTA: En la mayoría de los casos, para emergencias de enfermedades infecciosas en el mundo en desarrollo, esto será una barra de jabón.
2. Elija y adquiera una solución de ABHS relevante para el contexto en el que se está realizando la prueba.
   NOTA: El ABHS elegido debe tener un contexto de alcohol etílico mayor o igual al 70% para asegurar la eficacia.
3. Preparar una solución de hipoclorito de calcio al 0,05% (Ca (ClO) ₂ ) añadiendo polvo granular de Ca (ClO) ₂ al agua ultrapura. Determine la cantidad de solución necesaria en función del número de sujetos a ensayar.
   1. Usando la siguiente ecuación, determine la cantidad de polvo necesaria para preparar la cantidad deseada de solución en un volumen dado de agua usando un porcentaje dado de cloro disponible:
      /files/ftp_upload/55604/55604eq1.jpg "/>
      NOTA: El polvo de Ca (ClO) ₂ tiene típicamente 60-80% de cloro disponible.
4. Preparar una disolución de dicloroisocianurato de sodio al 0,05% (NaDCC) añadiendo un polvo de NaDCC granular a agua ultrapura.
   1. Usando la siguiente ecuación, determine la cantidad de polvo necesaria para preparar la cantidad deseada de solución en un volumen dado de agua usando un porcentaje dado de cloro disponible:
      
      NOTA: El polvo de NaDCC tiene típicamente un 50% de cloro disponible.
5. Preparar una solución estabilizada de NaOCl al 0,05% añadiendo solución de hipoclorito sódico a agua ultrapura.
   1. Confirmar la concentración de la solución madre de NaOCl (probablemente 5-8%) utilizando un método de ensayo de titulación de acuerdo con las instrucciones del fabricante ( por ejemplo, titulación iodométrica;Ggested kit).
   2. Utilizando los resultados del método de ensayo, calcule la cantidad de solución a añadir al agua usando la siguiente ecuación:
      
6. Preparar solución de NaOCl estabilizada al 0,05% mediante la adición de solución de hipoclorito de sodio producida con un electroclorinador, agua ultrapura y cloruro de sodio de laboratorio (NaCl) a agua ultrapura.
   1. Preparar una solución de cloro al 1% con agua ultrapura y NaCl, utilizando un electroclorador de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   2. Utilizar un método de ensayo de titulación ( por ejemplo, valoración yodométrica) para confirmar la concentración de la solución madre de NaOCl ³² .
   3. Utilizando los resultados de la prueba, calcule la cantidad de solución a añadir al agua usando la siguiente ecuación:
      
7. Confirmar la c( Por ejemplo, titulación yodométrica) y ajustar las soluciones añadiendo agua o polvo / solución fuente de cloro hasta que se encuentren dentro de un error del 10% de la concentración objetivo (0,045-0,055%).

3. Preparar Organismos y Carga de Suelo y Combinar para Producir el Inoculado

NOTA: En las subsecciones siguientes, E. coli y Phi6 se utilizan como muestras de organismos bacterianos y virales para la descripción de los métodos.

1. Prepare el microorganismo que se va a utilizar para las pruebas a una concentración superior a 10 x 10 ₈ CFU / mL para las bacterias y superior a 10 x 10 ⁷ PFU / mL para los virus.
   1. Para preparar E. coli , mezclar una cepa no patógena de E. coli sobre placas de agar Luria-Bertani (LB) e incubar a 37 ° C durante 24 h para obtener colonias individuales. Almacenar a 4 ° C.
      NOTA: Esto se puede hacer SeverAl días antes de la experimentación.
      1. Un día antes del comienzo del experimento, recoger una sola colonia de la placa e inocular 10 mL de caldo LB usando un bucle estéril. Incubar durante la noche a 37 ° C con agitación.
      2. En la mañana del experimento, iniciar un cultivo fresco mediante la adición de 1 mL del cultivo durante la noche a 20 mL de caldo LB fresco. Incubar durante aproximadamente 2,5 h para lograr una densidad celular mayor de 10 ⁸ CFU / mL.
      3. Utilizar un espectrofotómetro para estimar la concentración del cultivo.
         NOTA: Utilice un factor de conversión previamente establecido de una curva de estándares para la cepa de E. coli utilizada, asegurando una concentración mayor de 10 ⁸ CFU / mL ³³ . Si la densidad celular no es lo suficientemente alta, devuelva el cultivo a la incubadora y repita la prueba hasta que esté listo.
   2. Confirmar la concentración mediante filtración por membrana ³⁴ .
      NOTA: Realizar diluciones en serie oF el cultivo en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de manera que la solución filtrada produzca un número contable de colonias en la placa (el número exacto dependerá del medio utilizado).
      1. Instalar una llama y un colector de filtración con embudos de filtración estériles y una conexión de vacío. Esterilice los fórceps flameándolos con etanol. Utilícelos para colocar un filtro de 0,45 μm en el colector de filtración, con la rejilla hacia arriba. Humedezca el filtro con una pequeña cantidad de PBS estéril.
      2. Coloque el embudo sobre la base y agregue la solución de la muestra para ser procesada pipeteando o vertiendo directamente sobre el filtro. Enganche el vacío hasta que toda la muestra ha pasado a través de la membrana. Enjuague los lados del embudo con PBS estéril y vuelva a conectar el vacío.
         NOTA: Las muestras deben ser al menos de 100 μL y hasta 100 ml. Si una muestra es menor de 10 mL, agregar aproximadamente 20 mL de PBS al embudo de filtración antes de filtrar para asegurar la filtración uniforme del sampLe
      3. Retire el embudo, esterilice las pinzas con llama y levante el filtro de la base. Coloque el filtro suavemente sobre el agar LB en una placa de Petri, con la rejilla hacia arriba, asegurando que el filtro se encuentre a ras de la superficie. Invertir las placas e incubar durante 24 h a 37 ° C.
      4. Después de 24 h, retirar las placas de la incubadora y contar las colonias de E. coli . Utilice estos datos y el factor de dilución y volumen conocidos de la solución para calcular la concentración de la solución filtrada en CFU / mL.
   3. Propagación Phi6 en Pseudomonas syringae anfitrión utilizando el doble método de superposición de agar ³⁵ .
      1. Añadir 100 μl de suspensión de la reserva de Phi6 y 100 μL de P. syringae durante la noche directamente a 6 ml de agar blando de levadura de caldo nutritivo (NBY) (0,3%). Verterlo en placas con agar duro NBY (1,5%) e incubar durante la noche a 26 ° C. Prepare suficientes placas para producir suficiente inóculo para el experEstimando un rendimiento de aproximadamente 4 ml de suspensión viral por placa.
      2. Al día siguiente, añadir 5 ml de PBS en la parte superior de la capa de agar blando. Dejar a temperatura ambiente durante 4 h, recuperarla con una pipeta y filtrarla con un filtro de 0,45 μm. Almacenar a 4 ° C.
         NOTA: Esta solución servirá como inoculación viral.
   4. Utilice un ensayo de placa para confirmar que la concentración es mayor que 10 ⁷ PFU / mL ³⁵ . Realizar diluciones en serie de la suspensión viral en PBS para que 100 μL produzca un número de placas contable en la placa.
      1. Pipetear 100 μl de una muestra diluida apropiada y 100 μl de cultivo huésped durante la noche directamente en un tubo que contiene 6 ml de agar blando NBY. Verter agar blando sobre agar duro NBY e incubar a 26 ° C durante 24 h.
      2. Al día siguiente, retire las placas de las incubadoras y cuente el número de placas por placa. Utilice estos datos y la dilución conocida faY el volumen de la solución para calcular la concentración de la solución filtrada en PFU / mL.
2. Preparar la carga tripartita del suelo, destinada a imitar el suero humano.
   1. Combine 7,80 mg / mL de albúmina de suero bovino, tripina de 10,92 mg / mL y 2,52 mg / mL de mucina bovina para producir el volumen requerido de carga del suelo. Después de mezclar la carga del suelo, se filtra a través de un filtro de 0,22 μm para esterilizar. Guárdelo a 4 ° C hasta su uso. No esterilice el calor, ya que las proteínas se desnaturalizan.
3. Preparar una solución de NaCl al 0,9% para mezclar el inóculo para condiciones sin carga del suelo.
4. Inmediatamente antes de la prueba, preparar un inóculo compuesto de 68% de suspensión bacteriana o viral y 32% de carga del suelo. Por ejemplo, use 1,02 ml de suspensión bacteriana o viral de los pasos 3.1.1.2 o 3.1.3.2 y 0,48 ml de carga de suelo (paso 3.2.1) o solución de NaCl al 0,9% (etapa 3.3). Remueva o agite suavemente para mezclar.
   NOTA: 1,5 ml de esteSe utilizará inóculo para cada voluntario en cada condición, por lo tanto asegúrese de que el volumen total del inóculo preparado sea suficiente para el número de pruebas previsto.

4. Preparación de Voluntarios para el Experimento

NOTA: Determine el organismo y la condición de carga del suelo a ser probado en ese día. Los mismos voluntarios pueden ser usados ​​para probar condiciones múltiples, pero cada voluntario sólo debe ser sometido a una ronda de pruebas dentro de un período de 48 h.

1. Antes de comenzar las pruebas, confirme que los voluntarios siguen siendo elegibles verificando verbalmente que se han adherido al período de lavado antimicrobiano de 7 días y confirmando visualmente que no han desarrollado roturas o anomalías en su piel.
2. Utilizando un generador de números aleatorios, asignar a cada voluntario para usar su mano derecha o izquierda para el muestreo en este día de la prueba. Asigne un orden en el que se realizarán las condiciones de lavado de manos.
   NOTA: ParaPor ejemplo, ABHS puede ser asignado # 3 y se realizará tercero.
3. Realizar un "lavado de limpieza" una vez al comienzo de la prueba para quitar la piel de la suciedad y los aceites de modo que cada prueba posterior se lleva a cabo en condiciones equivalentes.
   1. Para hacer un lavado de limpieza, siga cada paso del experimento (sección 5, más adelante), usando un inoculo en blanco (caldo LB o PBS solamente) y tomando una muestra sin lavar las manos.

5. Procedimiento Experimental

1. Para probar el pH de la piel de cada voluntario (para controlar la variación), coloque una sonda de pH de piel plana en la superficie de la palma y el espacio entre el puntero y los dedos del medio. Asegúrese de que el electrodo esté plano contra la piel. Registre la lectura del pH.
2. Pica las manos.
   1. Pida a los voluntarios que junten ambas manos. Pique las manos con 1,5 ml de la inoculación cuidadosamente pipeteando 750 μL lentamente en cada palma.
   2. Haga que los voluntarios se froten suavemente las manos hasta que todas las superficies de la mano estén recubiertas con el inoculante mientras se sujetan las manos a la menor fricción posible.
   3. Haga que los voluntarios mantengan las manos quietas y alejadas de su cuerpo durante 30 s adicionales para permitir que el inoculado se seque. El inoculado puede no secarse completamente.
3. Lavar las manos.
   1. Para todos los pasos de lavado siguientes, capture el agua de enjuague de las manos en una bolsa de recogida de muestras grande. Añadir 4,5 ml de una solución de tiosulfato sódico al 12% a la bolsa para neutralizar el cloro en contacto y procesar en 2 h.
      NOTA: Se debe agregar tiosulfato sódico a todas las muestras (incluso aquellas sin cloro) para controlar cualquier impacto que pueda tener en el organismo.
   2. Después de la inoculación (sección 5.2), lávese las manos con el siguiente método en el orden indicado.
      1. Para el control A, no realice un paso de lavado de manos y vaya directamente al paso5.5.
      2. Para el Control B, lavar las manos con agua puramente pura a temperatura ambiente (aproximadamente 21 ° C) a través de un embudo con un caudal conocido.
         NOTA: Aquí se utilizó un caudal de 1,5 L / my 500 ml de agua.
      3. Para lavarse las manos con jabón, humedezca las manos con 10 mL de agua ultrapura. Haga que los voluntarios ensucien sus manos con jabón y luego se frotan las manos juntas durante 20 s adicionales. Enjuague sus manos vertiendo 500 mL de agua ultrapura a temperatura ambiente a través de un embudo a un caudal de 1,5 L / m.
      4. Para todas las soluciones de cloro ( por ejemplo, ABHS, HTH, NaDCC y NaOCl), vierta 200 ml de solución de cloro a través de un embudo a un caudal de 1,5 L / my haga que el voluntario se frote bien las manos.
4. Enjuague manualmente utilizando un procedimiento de jugo de guante modificado.
   1. Después del lavado de manos, coloque inmediatamente la mano de cada voluntario ( es decir, la mano (derecha o izquierda) seleccionada para testiNg en la etapa 4.2) en una bolsa de muestra que contiene 75 ml de eluyente ( por ejemplo, PBS) hasta la muñeca. Sostenga firmemente la parte superior de la bolsa alrededor de la muñeca.
      NOTA: Utilice un eluyente para el muestreo que contenga suficiente tiosulfato sódico para neutralizar cualquier cloro utilizado para el lavado de manos. El PBS es un eluyente de uso común que es apropiado para muchos organismos.
   2. Haga que los voluntarios se froten suavemente la mano en la solución durante 30 s, teniendo cuidado de alcanzar entre los dedos y debajo de las uñas. Masajear la mano desde fuera de la bolsa suavemente durante 30 s para asegurarse de que toda la mano se enjuaga a fondo en el eluyente, todo el camino hasta la muñeca.
   3. Sellar la bolsa y procesarla de acuerdo con el ensayo apropiado, descrito en la sección 6, en 2 h.
5. Descontaminación.
   1. Antes de repetir el proceso con cada método de lavado de manos, haga que los voluntarios se laven bien las manos en un fregadero con jabón y agua tibia. Rocíe el voluntarioRs 'manos con etanol 70% hasta que se recubren en ambos lados. Deje que se sequen.
   2. Repita todos los pasos de la sección 5 para cada condición de lavado de manos, sólo usando la mano seleccionada al azar en el paso 4.2 ( Figura 1 ).

6. Cuantificación

1. Realizar ensayos apropiados para el organismo de elección ( por ejemplo, filtración por membrana para bacterias o ensayo de placa para virus, descrito anteriormente en las secciones 3.1.2 y 3.1.4, respectivamente).
2. Después de contar las placas, registre la UFC / mL estimada o PFU / mL para cada prueba para los análisis (secciones 3.1.2 y 3.1.4).

7. Análisis

1. Utilizando los resultados del paso 6.2, calcule el valor de reducción logarítmica de los organismos en las manos, para cada organismo y estado de carga del suelo y para cada sujeto y método de lavado de manos.
   1. Para la eficacia del lavado de manos, compare la concentración de bacterias / virus en cada Lavar las manos con el control A (sin lavar las manos). Para la persistencia del agua de enjuague, compare cada muestra de agua de enjuague con el control B (lavado con agua solamente). Utilice la siguiente fórmula estándar:
      Reducción del registro (lavado de manos ) =
      Reducción del registro (agua de enjuague ) =
      NOTA: La reducción del registro también puede expresarse como log ₁₀ (sin lavar las manos) - log ₁₀ (con lavado de manos)
2. Utilizar un análisis de varianza de medidas repetidas unidireccionales (ANOVA) para evaluar las diferencias significativas en los valores de reducción logarítmica calculados entre métodos de lavado de manos y una prueba de HSD de Tukey posterior a los modelos significativos para evaluar pares de diferencias significativas (p <0,05)Ef "> 36.
   1. Antes de ejecutar el ANOVA, evaluar cada conjunto de datos de esfericidad ( por ejemplo, utilizando la prueba de Bartlett). Aplicar una corrección ( por ejemplo, la corrección de Greenhouse-Geisser) cuando la prueba indica que la esfericidad fue violada [ ^37] .

Aquí, el protocolo ( Figura 1 ] se completó con 18 voluntarios, que fueron cada uno de los ensayos utilizando tanto E. coli y Phi6. Se encontraron diferencias significativas entre los resultados de lavado de manos con E. coli con y sin carga de suelo y Phi6 con carga de suelo ( Figura 2 y Figura 3 ). Para E. coli sin carga del suelo, el lavado de manos con HTH, NaDCC y NaOCl estabilizado resultaron en reducciones logarítmicas significativamente mayores que el lavado de manos solo con agua (F (6,102) = 2,72, p = 0,034). Con la carga del suelo, HTH resultó en una reducción logarítmica significativamente mayor de E. coli que sólo agua, HWWS y ABHS (F (6.102) = 3.94, p <0.001). No hubo diferencias significativas entre los métodos de Phi6 sin carga de suelo (F (6,66) = 2,04, p = 0,073). Sin embargo, para Phi6 con carga de suelo (F (6.102) = 7.01, p <0.001), el agua solaMenor que el ABHS o el NaOCl estabilizado y el HWWS en una mayor reducción logarítmica que el ABHS, el NaOCl estabilizado y el NaOCl generado. HTH también tuvo una mayor reducción logarítmica que ABHS y NaOCl estabilizado, y el NaDCC dio lugar a una mayor reducción logarítmica que NaOCl estabilizado y ABHS. Si bien HTH realizado más consistentemente bien a través de las condiciones, se advierte contra la sobre interpretación de los resultados significativos, ya que muchos intervalos de confianza fueron grandes, que van desde menos de 0,5 log a más de 1,5 log de reducción en muchos casos.

En el agua de enjuague, el cloro resultó en una reducción logarítmica significativamente mayor de E. coli que persistía en el agua de enjuague que HWWS (sin carga de suelo, F (4,68) = 331,7, p <0,001; ) = 162,44, p <0,001) ( Figura 4 ). Este mismo patrón se encontró en Phi6 sin carga de suelo ((F (4,43) = 8,95, P <0,001), con todas las soluciones de cloro resultando enUna reducción notablemente mayor de Phi6 en agua de enjuague que HWWS. No hubo diferencias significativas en la persistencia en el agua de enjuague con Phi6 y carga del suelo ((F (4,67) = 3,35, p = 0,071) ( Figura 5 ).

Figura 1: Visión general del experimento. Los cinco pasos que se llevan a cabo para cada ronda de lavado de manos incluyen: 1) pruebas de pH, 2) inoculación de las manos, 3) lavado de manos, 4) lavado de manos y 5) descontaminación de las manos para cada una de las ocho condiciones ensayadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resolución de lavado de manos de E. coli Ults. En comparación con ningún lavado de manos, los métodos de lavado de manos probados resultaron en una reducción promedio de log en E. coli de 1,94-3,01 sin carga de suelo y 2,18-3,34 con carga de suelo. El lavado de manos con agua demostró la menor reducción en E. coli en ambas condiciones (1,94 y 2,18 log). El lavado de manos con NaDCC resultó en la mayor reducción sin carga del suelo (3,01), y HTH resultó en la mayor reducción con la carga del suelo (3,34). En los gráficos, la línea representa el porcentaje de reducción en los organismos, y las barras de error representan el error estándar de la reducción del registro. Ctrl B, control B; HWWS, lavado de manos con jabón; ABHS, desinfectante para manos a base de alcohol; HTH, hipoclorito de alta prueba; NaDCC, dicloroisocianurato sódico; St NaOCl, hipoclorito sódico estabilizado; Gen NaOCl, generó hipoclorito de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Resultados del enjuague manual con E. coli . En comparación con el lavado de las manos con agua solamente, la reducción promedio del registro de E. coli que permanecía en el agua de enjuague fue de 0,28-4,77 sin carga de suelo y 0,21-4,49 con carga de suelo. Tanto con y sin carga de suelo, la menor reducción se encontró en el lavado de manos con jabón (0,28 y 0,21). Las mayores reducciones se observaron con NaOCl estabilizado y generado sin carga de suelo (4,77) y HTH y con NaOCl generado con carga de suelo. En las tablas, la línea representa el porcentaje de reducción en los organismos, y las barras de error representan los sTandard error de log reducción. HWWS, lavado de manos con jabón; ABHS, desinfectante para manos a base de alcohol; HTH, hipoclorito de alta prueba; NaDCC, dicloroisocianurato sódico; St NaOCl, hipoclorito sódico estabilizado; Gen NaOCl, generó hipoclorito de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Resultados del enjuague manual Phi6. En comparación con el lavado de las manos con agua solamente, la reducción promedio del registro de Phi6 restante en el agua de enjuague fue de 1,26-2,02 sin carga de suelo y 1,30-2,20 con carga de suelo. Con la carga del suelo, la menor reducción se encontró en el lavado de manos con jabón (1.26). Sin carga de suelo, HTH resultó en la menor reducción (2,02). Las mayores reducciones se observaron con y sin carga de suelo con NaDCC(2,02 y 2,20). En los gráficos, la línea representa el porcentaje de reducción en los organismos, y las barras de error representan el error estándar de la reducción del registro. HWWS, lavado de manos con jabón; ABHS, desinfectante para manos a base de alcohol; HTH, hipoclorito de alta prueba; NaDCC, dicloroisocianurato sódico; St NaOCl, hipoclorito sódico estabilizado; Gen NaOCl, generó hipoclorito de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

The method described here provides an approach for testing handwashing efficacy in a controlled laboratory setting. This method highlights the use of human volunteers and surrogate, non-infectious organisms. Using the method, it was possible to demonstrate differences in: 1) the efficacy of handwashing methods and 2) organism persistence in rinse water. The purpose of presenting this protocol is to provide a general framework that can be adapted to test a wide range of surrogate organisms and handwashing methods relevant to infectious disease.

During the use of the method, two key data quality recommendations were noted as important. First, the inoculate must be applied both as similarly as possible across the rounds of testing and in a manner, that minimizes loss. This is to ensure that sufficient inoculate is applied to the hands to allow for statistically significant results. Second, be sure to complete the "cleansing wash" step, in which the protocol is performed without handwashing prior to testing, as previous work has shown that there are likely to be significant differences between a first wash and subsequent washes, but not between subsequent washes performed after a cleansing round²⁹. Additionally, this step clears residual hand contamination, which would interfere with results.

The main limitation of this protocol is that it can be uncomfortable for volunteers. During each round of testing, which lasted about 2 h, volunteers' hands became cold. Some volunteers reported mild pain from their hands being constantly wet. Additionally, after a few rounds of testing, volunteers' hands became supersaturated, no longer fully drying between rounds. Although the randomization of the order of handwashing methods for each volunteer accounted for supersaturation, it is possible that the supersaturation could act as a confounding or modifying factor in this type of testing. To address this limitation, it is recommended that volunteers are appraised of this risk during consent disclosures and are reminded of their right to drop out of the study at any time. Volunteers should not undergo testing for more than 2 h per day to allow time for the hands to return to a baseline state and to minimize discomfort. A second limitation is the need to use a surrogate organism or non-infectious variant of a pathogenic organism to protect the health of volunteers. This might cause concern about the generalizability of results. However, for some pathogenic organisms (such as the Ebola virus), this limitation cannot be ethically overcome. Care must be taken during surrogate organism selection. Lastly, this is a laboratory study on efficacy. Results may only translate to effective disease prevention in real-word contexts where handwashing methods are made accessible to those in need and are used properly and consistently.

This protocol draws on previous work on handwashing efficacy but attempts to streamline methods and emphasizes the use of human hands (rather than surrogate surfaces) for testing. Additionally, rinse water is a transmission risk that had previously not been assessed. Existing studies on handwashing efficacy vary in methodology, leading to non-comparable data. We hope that standardized protocols for conducting handwashing method comparisons will encourage comparable and replicable results. Previous work has demonstrated that in vitro testing on surrogate surfaces such as pig skin, where, for example, the actual Ebola virus could be used, produced results that do not match those found after testing on human hands³⁸. Therefore, a method using human hands and surrogate or non-infectious organisms is currently the best available approach to estimate handwashing efficacy and rinse water persistence for infectious microorganisms.

Handwashing is critical to prevent disease transmission. However, there is a lack of evidence on the comparative efficacy of handwashing methods that are commonly recommended. This protocol can be used to generate evidence about handwashing efficacy and rinse water persistence. This is especially important for infectious diseases with the potential to cause large outbreaks, such as the Ebola virus. We hope that other researchers will find this protocol useful to generate much-needed additional evidence on handwashing method efficacy and rinse water persistence that will assist in developing recommendations to reduce the transmission of infectious diseases.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Esta labor contó con el apoyo de la Agencia de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacional, Oficina de Asistencia para Desastres en el Extranjero (AID-OFDA-A-15-00026). Marlene Wolfe recibió el apoyo de la National Science Foundation (subvención 0966093).