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Un TMEM184A codifica costrutto con un tag GFP al carbossi-terminale progettato per l'espressione eucariotica, è stato impiegato in saggi progettati per confermare l'identificazione di TMEM184A come recettore eparina in cellule vascolari.
Quando nuove proteine vengono identificati attraverso l'isolamento e la bioinformatica market basket analysis-based, sono spesso in gran parte indefinita. Gli anticorpi contro peptidi specifici all'interno della sequenza prevista consentono alcuni esperimenti di localizzazione. Tuttavia, spesso non possono essere escluse altre interazioni possibili con gli anticorpi. Questa situazione ha offerto l'opportunità di sviluppare una serie di saggi dipendenti dalla sequenza della proteina. In particolare, un costrutto contenente la sequenza genica accoppiato alla sequenza codificante GFP all'estremità C-terminale della proteina è stata ottenuta e utilizzata per questi scopi. Gli esperimenti per caratterizzare la localizzazione, ligando di affinità, e guadagno di funzione sono stati originariamente progettati e realizzati per confermare l'identificazione di TMEM184A come recettore eparina 1. Inoltre, il costrutto può essere impiegato per studi che riguardano domande topologia di membrana e le interazioni proteina-ligando dettagliate. La presente relazione presenta arange di protocolli sperimentali basati sul costrutto GFP-TMEM184A espresso in cellule vascolari che potrebbe essere facilmente adattato per altre nuove proteine.
L'identificazione di proteine candidate per le funzioni nuove, spesso dipende da protocolli di isolamento di affinità basata seguita da determinazione sequenza parziale. Esempi recenti di nuove proteine identificate sono proteine transmembrana 184A (TMEM184A), un recettore eparina identificato dopo interazioni eparina affinità 1, e TgPH1, una proteina dominio pleckstrin omologia che lega phosphoinositide PI (3,5) P2 2. Altro novel identificazione delle proteine attraverso analisi di sequenza diretta dei peptidi come quello di Vit, et al. che ha usato peptidi transmembrana per identificare i prodotti proteici da geni precedentemente non caratterizzate 3. Allo stesso modo, l'identificazione di nuove sequenze di proteine può essere realizzato utilizzando la bioinformatica alla ricerca di famiglie di proteine precedentemente caratterizzati come l'identificazione di nuove proteine 4TM 4. L'esame delle sequenze di geni della famiglia aquaporin ha alcosì ceduto l'identificazione di nuovi membri caratterizzati da nuove funzioni 5. Dopo l'identificazione, l'analisi della funzione della proteina è tipicamente un passo successivo, che a volte può essere esaminato utilizzando un dosaggio specifico della funzione proteica come nel caso aquaporin.
Quando possibile, la funzione di una proteina di recente identificazione può essere esaminato con particolare enzimatici o simili saggi funzionali in vitro. Poiché molte funzioni delle nuove proteine dipendono complesse interazioni che si verificano solo in cellule intatte o organismi, in vitro non sono sempre efficaci. Tuttavia, i saggi in vivo devono essere progettati in modo tale che essi dipendono dalla sequenza del gene. In coltura cellulare, e / o organismi modello semplici, atterramento in grado di fornire elementi di prova per l'identificazione delle proteine / funzione 6. Con nuove proteine identificate come notato sopra, è spesso insufficiente a battere semplicemente verso il basso una proteina per confermare la funzione, und progettazione di saggi in vivo funzionali che dipendono sequenza genetica diventa importante per la caratterizzazione di nuove proteine.
La recente individuazione di TMEM184A come recettore eparina (che modula la proliferazione in muscolatura liscia vascolare e le risposte infiammatorie nelle cellule endoteliali) mediante cromatografia di affinità e MALDI MS 1, 7 fornito l'opportunità di sviluppare una collezione di saggi dopo atterramento prodotto risultati coerenti con l'identificazione . Una recente revisione ha confermato che l'eparina interagisce specificamente con molti fattori di crescita, i loro recettori, i componenti della matrice extracellulare, recettori di adesione cellulare, e altre proteine 8. Nel sistema vascolare, eparina e proteoglicani eparan solfato (contenente catene eparan solfato di struttura simile a eparina) interagire con diverse centinaia di proteine 9. Per confermare funzionalmente that TMEM184A è stato coinvolto con l'eparina assorbimento e vincolante, sono state sviluppate tecniche che hanno impiegato il costrutto gene per TMEM184A. La presente relazione comprende una raccolta di saggi sulla base di un GFP-TMEM184A costrutto per l'uso nel confermare l'identità di TMEM184A come recettore eparina.
1. Progettazione di un costrutto GFP-proteina
2. Espressione GFP-TMEM184A in cellule vascolari
3. Visualizzazione di GFP-TMEM184A Localizzazione
4. rodamina-eparina Binding e Colocalizzazione con cellule GFP-TMEM184A transfettate
5. Fluorescence Resonance Energy Transfer da GFP-TMEM184A a rodamina-eparina
6. live-cell imaging di rodamina-Heparin Assorbimento
7. Isolamento di GFP-TMEM184A e GFP da cellule in coltura
8. In Vitro Eparina Binding Assay
Mentre, in teoria, trasfezione di DNA qualsiasi costrutto in cellule potrebbe essere realizzato con i reagenti di trasfezione lipofili, relazioni precedenti indicano più efficace trasfezione di GFP costrutti in cellule endoteliali mediante elettroporazione 12. Il protocollo fornito qui realizzato tipicamente GFP-costrutto di espressione in più del 80% delle cellule endoteliali primarie derivate e cellule muscolari lisce utilizzati. Progettazione del costrutto impiegato utilizzato un sistema disponibile in commercio in grado di fornire rapidamente questo costrutto. Il principale destinazione d'uso è stata focalizzata su questioni di localizzazione, quindi, corretta consegna alla membrana, insieme con l'espressione della proteina eucariotica ottimale e la produzione costrutto continuato erano considerazioni principali. Altre considerazioni potrebbero includere: diversa posizione della GFP per proteine diversamente localizzate o proteine con C-terminale che è parte di una regione piegata, la possibilità di wanting per rimuovere la GFP (aggiunta di un sito di scissione della proteasi), e un sito affinità secondario. Quest'ultima fornire modi alternativi di purificazione del costrutto GFP e stabilizzante su una superficie per il saggio di legame. Per confermare pattern di colorazione per i diversi anticorpi commerciali contro TMEM184A, cellule vascolari che esprimono GFP-TMEM184A sono stati confrontati con cellule identiche colorate con gli anticorpi commerciali. La lunghezza di tempo dopo impatti transfezione distribuzione di GFP-TMEM184A, che sembrava accumulare su almeno 72 h. Il periodo di tempo dopo la trasfezione con conseguente espressione ottimale varia dal tipo di cellula e dovrebbe essere ottimizzato per ogni tecnica. Nel corso del tempo, più etichette GFP era nella regione peri-nucleare. A seconda della manipolazione, GFP sbiancamento anche verificato. I risultati hanno indicato GFP-TMEM184A sulla superficie cellulare e in strutture vescicola peri-nucleari e altri simili localizzazioni osservate con TMEM184A colorazione anticorpale (figura 1). Le cellule primarie in Figura 1 sono stati ripresi 24 ore dopo la trasfezione, mentre le cellule A7r5 clonate sono state ripreso 48 ore dopo la trasfezione. La decisione di fissare le cellule GFP transfettate è stato fatto per assicurare che tutte le cellule sono state trattate in modo identico a confrontare la localizzazione. Fissazione probabilmente ridotta superficie cellulare emissione di fluorescenza GFP in una certa misura. Il pattern di colorazione di GFP appariva più simile a quella di anticorpi contro un peptide C-terminale, un risultato logico dato che la GFP è al C-terminale della proteina. Colorazione con un anticorpo diretto contro un peptide nella regione N-terminale era simile, ma sembrava leggermente più concentrata nella regione peri-nucleare. apparenti differenze nella localizzazione con diversi anticorpi potrebbero essere dovute al legame del ligando (possibilmente vicino al C-terminale in questo caso), che potrebbe essere fissato lì e limitare l'accesso degli anticorpi. In alternativa, la N- e C- termini potrebbero essere su lati opposti della membrana. Possibilmente, nuova proteina sintetizzata sarebbe macchia più effectively con un anticorpo relative al proteine modificate traduzionalmente post-. Per confrontare la localizzazione totale GFP-TMEM184A a TMEM184A endogena, colorazione con anticorpi anti GFP fornito un quadro più preciso del totale GFP-TMEM184A che semplicemente l'imaging GFP. Immagini di anti-GFP colorazione anticorpi sono mostrati in figura 5 in cui la tecnica è stata utilizzata anche per valutare topologia membrana.
L'utilizzo di un ligando fluorescente (rodamina-eparina) facilitato valutazione di co-localizzazione di ligando e recettore nel tempo, e le due etichette ha permesso di effettuare l'imaging dal vivo (Figura 2 e Film 1). Figura 2C è stato ripreso eccitando la GFP a 405 nm, ma la cattura delle emissioni dalla rodamina (immagini centrale). GFP eccitazione è limitata a 405 nm rendimento emissione limitata pure, ma questo ha impedito l'eccitazione di rodamina e un segnale FRET falso. Allo stesso modo, il FRET-InducEd emissione rodamina era debole. Nei controlli con l'espressione GFP-TMEM184A, ma non rodamina-eparina, e altri con solo rodamina-eparina non vi era alcuna emissione rodamina con 405 nm di eccitazione. In seguito, GFP totale (immagini a sinistra) e rodamina totale (immagini giuste) sono stati misurati utilizzando lunghezze d'onda standard di eccitazione / emissione per ogni fluoroforo. I dati in C supportano ulteriormente la co-localizzazione del legante e la GFP-TMEM184A. uptake Rhodamine-eparina in RAOEC richiesto di incubazione più lungo rispetto alle cellule A7r5. Nessuna prova per FRET è stata osservata nelle cellule senza rodamina-eparina o nelle cellule untransfected. Un esperimento ideale dovrebbe includere un'altra superficie GFP-costrutto che non dovrebbe avere alcuna co-localizzazione con il ligando.
Acquisizione o recupero della funzione potrebbe anche essere realizzato con costrutti GFP-proteici e rodamina-eparina. Questo ha fornito l'opportunità di utilizzare GFP come prova per il livello di espressione e di ligando cooperazionelocalizzazione e di quantificare le interazioni. In particolare, l'assorbimento eparina è stata aumentata a GFP-TMEM184A costrutto-transfettate cellule A7r5 (Figura 3). Cellule knockdown stabili che occupano molto limitata rodamina-eparina sono stati prodotti 1, e questi fornito un sistema in cui è stato possibile valutare guadagno di funzione. Trasfezione di GFP-TMEM184A costrutto provocato cellule che potrebbero ancora internalizzare rodamina-eparina a livello delle cellule wild-type o sopra (Figura 3). Va notato che l'immagine "no eparina" è di cellule smontabili stabili, che non esprimono GFP come reporter per il costrutto knockdown. Sfondo fluorescenza era maggiore in queste cellule, come osservato nell'immagine mostrata.
È tipicamente utile usare recettore isolato per la determinazione del ligando specificità per diminuire la probabilità di altre proteine che interagiscono con il ligando. L'uso di un GFP-Protein costrutto fornisce un vantaggio significativo in proposito il tag GFP può servire come maniglia per l'isolamento della proteina ed evita possibili interazioni di anticorpi o altri reagenti di affinità con le proteine addizionali. GFP può essere espresso anche in popolazioni di cellule identiche e isolato utilizzando la stessa procedura GFP affinità. Questo fornisce una proteina di controllo per studi di interazione ligando. Nel sistema TMEM184A, la GFP-TMEM184A isolato utilizzando una procedura di affinità anticorpale anti-GFP provocato specifico, eparina legame saturabile, mentre la GFP controllo non ha vincola gli eparina (Figura 4).
Tipicamente, i tag GFP su costrutti sono collocati ad una estremità di una proteina. La posizione C-terminale facilita il traffico di proteine corretto ad una membrana. Pertanto, la disponibilità di GFP su un particolare lato di una membrana può fornire evidenza specifica topologia di una proteina di membrana se piegatura e topologia non sonolready noto. Semplice colorazione immunofluorescenza con anticorpi contro GFP (come in figura 5) può fornire la prova della località GFP basati sull'accesso anticorpo in cellule non permeabilizzate. Gli anticorpi anti-GFP riconoscono GFP anche se sbiancato. Immunofluorescenza mostrato nella Figura 5 suggerisce significativa colorazione anti-GFP senza permeabilizzazione delle cellule GFP-TMEM184A trasfettate comprovanti preliminare che la GFP a livello della membrana plasmatica è extracellulare. Chiaramente, la proteina intracellulare in vescicole anche si dovesse macchiare nelle cellule permeabilizzate. Immagini FRET in Figura 2C sono coerenti con questa topologia proposto.
Figura 1: GFP-TEMEM184A Localizzazione in cellule conferma TMEM184A localizzazione determinato mediante immunofluorescenza. A) BAOECs trasfettate con GFP-TMEM184A sono stati fissati con il 4% PFA. cellule Nontransfected state evase con metanolo (MeOH) fixing ghiacciata e permeabilizzazione o 4% PFA seguita da Triton X-100 permeabilizzazione (come indicato). Le cellule sono state colorate nontransfected utilizzando un anticorpo contro un peptide C-terminale da TMEM184A (CTD) o un peptide N-terminale da TMEM184A (NTD) e un anticorpo anti-coniglio secondaria taggati con TRITC. B) Esempi di clonato (A7r5) e BAOSMC) cellule muscolari lisce primarie (sono stati elaborati in modo simile. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging di GFP-TMEM184A con rodamina-eparina. A) A7r5s elettroporate con GFP-TMEM184A sono stati trattati con 100 mg / ml rodamina-eparina per lai tempi indicati e poi fissate con 4% PFA. Le immagini sono rappresentative di due esperimenti separati. B) le cellule A7r5 sono state trasfettate con GFP-TMEM184A e rodamina-eparina è stato aggiunto con immediato immagini dal vivo. fotogrammi selezionati del film sono mostrati con una barra verticale bianca che indica la localizzazione iniziale di una vescicola GFP-rivestito contenente rodamina-eparina. L'etichetta GFP e rodamina si muovono insieme. Barre di scala = 2 micron. C) RAOECs trattati come in A sono stati ripresi per la fluorescenza di risonanza di trasferimento di energia eccitando a 405 (GFP, per FRET) e confrontati con le impostazioni standard, vedere protocollo 3.5. Pannello A, ed i due punti di tempo in B, sono stati originariamente pubblicati nel Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. 1. Copyright l'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare. Clicca qui per view una versione più grande di questa figura.
Figura 3: GFP-TMEM184A Trasfezione Fornisce guadagno di funzione. A) significativamente più bassi livelli di rodamina-eparina sono visti nelle cellule atterramento stabili A7r5 rispetto al wild-type A7r5s, vedere immagini di esempio. L'immagine "no eparina" è di cellule smontabili stabili che esprimono GFP come marcatore della presenza costrutto. Barre di scala = 10 micron. B) La trasfezione di GFP-TMEM184A in entrambi wild-type e le cellule atterramento stabili aumenta in modo significativo il segnale di rodamina-eparina in queste cellule sulla base di analisi di più di 50 cellule / condizione in tre esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano SEM. p <0,0001 sulla base di un test di Tukey. Questo dato è stato originariamente pubblicato nel Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. 1. Copyright l'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Isolated GFP-TMEM184A Legante eparina. GFP-TMEM184A o GFP è stato isolato e destinati a piastre saggio avidina rivestite. Fluoresceina eparina è stato aggiunto in concentrazioni da 0,056 nmol attraverso 1.111 nmol. Eparina vincolato è stata determinata misurando emissione a 519 nm. GFP-TMEM184A (quadrati). Controllo GFP (cerchi). Questo dato è stato originariamente pubblicato nel Journal of Biological Chemistry. Pugh, RP, et al. 1. Copyright l'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare. _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: GFP-TMEM184A e membrana topologia. cellule trasfettate GFP-TMEM184A erano o fissate con 4% PFA (alto) o fissate con 4% PFA e permeabilizzate con Triton X-100 (in basso). Le cellule sono state colorate in modo identico con anti-GFP anticorpi primari e anticorpi secondari Cy3-etichetta. Barre di scala = 10 micron. Due diversi esperimenti sono mostrati. Secondari celle solo-colorate hanno mostrato essenzialmente non colorazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
PLOAD / 55053 / movie.mp4 "target =" _ blank "> Film 1:.. Live-imaging GFP-TMEM184A con rodamina-eparina (clic destro per il download) cellule A7r5 sono stati trattati come in Figura 2B Il film illustra la GFP TMEM184A e vescicole rodamina-eparina in alto si muovono insieme. versioni colore separati in aggiunta alla versione risultante dalla fusione del film sono mostrati. la vescicola con GFP e contenente rodamina è cerchiato.
I protocolli qui riportati sono stati progettati per fornire la prova di conferma per l'identificazione di TMEM184A come recettore eparina in cellule vascolari 1. tecniche Knockdown sono abitualmente utilizzati come uno meccanismo per confermare l'identificazione di nuove proteine. Tuttavia, qualche perdita funzionale dopo atterramento non è tipicamente una prova sufficiente che una proteina candidato è effettivamente il recettore corretta (o altra proteina funzionale). E 'anche importante avere la prova che la proteina candidato presenta effettivamente la funzione. L'impiego di un costrutto per un nuovo gene contrassegnati con GFP permette guadagno di esperimenti di funzioni e facilita l'isolamento della proteina GFP contrassegnati sulla base di affinità. Elettroporazione impiegato in questo protocollo facilitato molto elevata efficienza di trasfezione del costrutto (superiore al 80% delle cellule esprimeva il costrutto). Tuttavia, altri meccanismi di transfezione potrebbero essere utilizzati se l'elettroporazione non è disponibile o non desiderato. Ci sono diversi vantaggi per la selezione di un costrutto GFP-tagged per la conferma di una funzione nuova proteina. Innanzitutto, la GFP serve come reporter di espressione genica e trasfezione e permette iperespressione da controllare attraverso GFP se una linea cellulare, senza espressione della proteina non è disponibile. In secondo luogo, il tag GFP fornisce uno strumento per la purificazione della proteina che non dipende né affinità legante o di anticorpi contro peptidi. In terzo luogo, il tag GFP fornisce uno strumento per esaminare la localizzazione immunofluorescenza complesso visualizzati utilizzando anticorpi generati contro peptidi unici nella sequenza proteina bersaglio per determinare se il prodotto del gene reale è simile localizzato.
Guadagno di test funzionali con costrutti genici vengono utilizzati per una serie di scopi, tra cui high-throughput screening per l'identificazione della funzione nuova proteina 13. Idealmente, il guadagno di saggi di funzione sarebbe impiegare un ben studiato clonato li cellularene che non esprime il gene in questione (le cellule devono ancora esprimere cooperare prodotti genici che permettono la funzione del gene di nuova espressione). Quando si utilizza uno specifico costrutto GFP-contrassegnati come nel presente test, è fondamentale utilizzare cellule in cui la GFP-proteina può funzionare. Così, la scelta delle cellule dipende dalla funzione e, probabilmente, dal tipo cellulare in cui la funzione si verificherebbe normalmente per assicurare proteine cooperanti sono presenti. GFP-tagging consente un ulteriore modo di funzione di controllo nel caso in cui la fluorescenza della proteina GFP-tag può essere seguito come parte di un saggio funzionale (ad esempio, vedi figure 2 e 3). Un limite di questi studi sarebbe se GFP altera in qualche modo la funzione delle proteine. Collegando il GFP al C-terminale della proteina, un gran numero di proteine sono già state studiate senza alterazione funzionale apparente, ma tale possibilità esiste.
Radioisotopicaleganti lly etichettati sono stati spesso utilizzati per studiare legarsi alle cellule intatte 11 ligando. Tuttavia, tali test non consentono semplice determinazione della posizione ligando dopo il legame, né facilitare il confronto di ligando e recettore insieme come nella presente relazione. Un costrutto GFP offre anche ulteriori opportunità di esaminare una proteina di membrana etichettato come qui. A causa della posizione C-terminale del tag GFP, è possibile esaminare la posizione del tag GFP nelle cellule trasfettate durante un test. Immunofluorescenza usando anticorpi GFP permette il confronto di GFP accessibili agli anticorpi con e senza permeabilizzazione (Figura 5). Ulteriori applicazioni della GFP-TMEM184A sfruttano dell'imaging GFP come la colocalizzazione con rodamina-eparina (Figura 2). Impiegando FRET per consentire le emissioni da GFP per eccitare l'rodamina-eparina, come mostrato nella 2C offre un modo interessante per valutare Tra vincolante e intracellularefficking. Inoltre, FRET dati indicano che GFP è abbastanza vicino (entro 10 nm) per la rodamina-ligando per il trasferimento di eccitazione. La prova che tale trasferimento da GFP ad un ligando opere è stato pubblicato per l'ormone paratiroideo taggati con tetrametil-rodamina 14. tecnologia alternativa FRET (fotometabolismo e / o schemi di imaging computer guidato) possono anche essere impiegati per analisi più complessa di quanto mostrato qui come esempio. Allo stesso modo, le interazioni di altre proteine con il candidato potrebbe essere esaminati utilizzando FRET con tag fluorescenti ottimizzati per FRET come nel sistema EGFP / mCherry riportata da Albertazzi et al. 15 e il CFP / YFP e GFP coppie utilizzati negli studi del canale del potassio di Wang e colleghi 16. Molte nuove molecole fluorescenti piccoli vengono progettati, ad esempio 17. Queste molecole aumenterà il numero di casi in cui Fret interazioni tra le proteine GFP-tagged e Fleganti luorescent possono essere esaminati. Gli studi futuri possono coinvolgere anche le modifiche al gene bersaglio, permettendo il costrutto per determinare gli aspetti specifici di sequenza di funzione del gene. Una limitazione di proteine di membrana GFP-tag è quando il C-terminale della proteina è normalmente all'interno. In tali casi, FRET saggi con leganti idrosolubili fluorescenti possono non essere possibile. Tuttavia, meccanismi alternativi di collocare GFP altrove nel costrutto potrebbe essere ancora possibile per alcune tali proteine, e gli altri saggi qui riportati potrebbero ancora essere impiegati.
Oltre alla funzione di localizzazione, e in vivo interazioni ligando, una proteina GFP-tag può essere isolato utilizzando un anticorpo anti-GFP e la proteina isolata utilizzato per esaminare la funzione impiegando saggi in vitro dove la GFP permette un isolamento imparziale della proteina e un controllo relativamente isolato (GFP gratuito). Insieme questi test in grado di fornire una forte prova complementare necessaria per dimostrare °le funzioni della proteina candidato come ipotizzato.
Inoltre, perché GFP è resistente a meno modificato con siti che si estendono dalla struttura compatta 18 proteasi, limitata trattamento proteasi di celle deve rilasciare GFP extracellulare. La scissione della proteasi si verificherebbe nella proteina a cui è attaccato GFP o in una regione linkage progettato. Il prodotto rilasciato sarebbe GFP con un'estensione N-terminale alla sequenza GFP. Tripsina non dovrebbe rilasciare GFP se il C-terminale della proteina a cui è attaccato GFP è intracellulare. Un'analisi preliminare dei potenziali prodotti potrebbe suggerire un chiaro modello peso molecolare con una proteina GFP-tagged rilasciato dalla tripsina. Per molte proteine di membrana, tali tecniche si tradurrebbe in chiara evidenza per la topologia della membrana dal rilascio di GFP, o la loro mancanza.
Insieme, i saggi specifici presentati e / o proposte in questo rapporto fornire un'ampia campionatura di tecniche tcappello può essere impiegato per esaminare nuove proteine partendo da un costrutto fluorescente etichettato. Tali costrutti possono essere facilmente ottenuti commercialmente. L'opportunità di usarli per una vasta gamma di tecniche che li rende economicamente fattibile anche per piccoli laboratori su budget limitati.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
Paraformaldehyde (PFA, methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96-well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
Black 96-well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in Figure 1 |
GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in Figure 5 |
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) | Minimal cross-reactivity to minimize any nonspecific staining. |
CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
Live imaging 35-mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm - C | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line | Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10x solution |
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