Indagare Mast Cellula secretoria Granuli; dal Biosintesi a Esocitosi

L'obiettivo del presente protocollo è stato quello di sviluppare un metodo che permetterà analisi di genomica funzionale della secrezione mastociti. Il protocollo si basa sulla valutazione quantitativa del rilascio di un gene reporter fluorescente cotrasfected con il gene di interesse e l'analisi in tempo reale della morfologia del granulo secretorio.

Mastociti (MC) sono cellule secretorie del sistema immunitario che svolgono le loro funzioni fisiologiche e patologiche rilasciando mediatori allergici, infiammatorie e immunomodulanti preformati e di nuova sintesi. Mediatori MCs 'riguardano diversi tessuti e organi che culminano nelle risposte allergiche e immunitarie. La sintesi, lo stoccaggio e il rilascio dei mediatori MC sono altamente regolamentati. I mediatori preformati sono confezionati in granuli secretori citoplasmatici (SG), che si fondono con la membrana plasmatica e rilasciano il loro contenuto per esocitosi regolata. Presentiamo un protocollo, basata sulla co-espressione di un gene di interesse con un gene reporter che si rivolge alla SGS e viene rilasciato in modo regolato fianco dei mediatori endogeni SG. Il protocollo consente di alta risoluzione quattro confocale tridimensionale analisi del MC SGS e il controllo della loro linea temporale dal biogenesi a esocitosi innescato. Così, con questo protocollo per lo screening dei geni di Interest per il loro impatto fenotipica e funzionale permette di decifrare i meccanismi molecolari che regolano la biogenesi e esocitosi del MC SGS e identificare i regolatori coinvolti. In tal modo, dovrebbero essere fornite ulteriori informazioni sui meccanismi cellulari che rappresentano la funzione MCs in salute e malattia.

Mastociti (MC) sono cellule immunitarie che sono più noti per il loro coinvolgimento nelle reazioni allergiche e infiammatorie come l'artrite, l'asma, esofagite eosinofila, dermatite cronica e shock anafilattico ^1,2 così come altre patologie tra cui la malattia coronarica e ^3,5 cancro ^3,4. Inoltre, MCs svolgono un ruolo importante in innata e adattativa, sia in difesa dell'ospite contro i batteri e parassiti e dalla soppressione delle risposte immunitarie, ad esempio inducendo la tolleranza dell'organo trapiantato ^5,6.

MCs provengono dal midollo osseo, lo sviluppo di CD34 + / CD117 + cellule progenitrici pluripotenti ^7. Committed midollo osseo MC progenitori vengono rilasciati nel sangue e migrano nei tessuti periferici localizzative prevalentemente all'interno dei tessuti connettivi e superfici epiteliali ^8. Maturazione e differenziazione terminale vengono poi raggiunti sotto l'influenza of citochine all'interno l'ambiente circostante ^8,9.

MCs possono essere attivati ​​da un allergene (antigene, Ag), il cui incontro portato alla generazione di immunoglobulina E (IgE) tipo anticorpi. Il legame di tale IgE ai recettori FcεRI del MC, seguito da reticolazione di cellula legata IgE upon riesposizione allo stesso Ag, provoca l'aggregazione FcεRI e apertura di una cascata di segnalazione che culmina in degranulazione [recensione in ^10,11] . MCs sono attivati, indipendentemente da IgE, da neuropeptidi ^5,12, le tossine ^13, batterica e antigeni virali ^14,15, un numero di peptidi caricati positivamente collettivamente come secretagoghi di base, le cellule immunitarie e citochine ^{5,13,12,16 , 17.} MCs sono anche attivati ​​da molti dei propri mediatori rilasciati, che amplificano ulteriormente la risposta infiammatoria.

MCs sono confezionati con granuli di secreto (SGS) che contengono immunomediatori regolamentari, anche amine vasoattive, come l'istamina e la serotonina (in roditori), proteoglicani, proteasi, come chimasi e triptasi, fattore di crescita vascolare endoteliale e diverse citochine e chemochine ^8,9. Questi mediatori sono "pronti a partire" e una volta MCs sono attivati ​​da uno stimolo adeguato, questi mediatori vengono rilasciati dalle cellule di esocitosi regolata (degranulazione) in pochi secondi a minuti ^18,19. Questo evento iniziale è seguita dalla sintesi de novo e il rilascio di una vasta gamma di sostanze biologicamente potenti, tra metaboliti dell'acido arachidonico, più citochine e chemochine ^20,21,22. Rilascio di prodotti di nuova sintesi si verifica indipendentemente dal rilascio SG. Collettivamente, questi mediatori avviare prime e fase tardiva infiammatori e allergici risposte. Pertanto, la comprensione dei meccanismi che rappresentano per l'attivazione e la degranulazione MC sono entrambi di imp teorica e clinicaortance.

La difficoltà di manipolare geneticamente MCs primarie e coltivate ha ostacolato i tentativi di chiarire i meccanismi alla base MC degranulazione, che è rimasto mal risolti. Per ovviare a questo problema abbiamo sviluppato un giornalista saggio basato da co-trasfezione linea cellulare della mucosa mast, rat leucemia basofili (RBL) -2H3 (di seguito denominato RBL) o di midollo osseo derivate MCs (BMMCs) ³⁰ con un gene di interesse e neuropeptide Y (NPY) fusa RFP monomero (MRFP), come SG giornalista.

NPY è stato precedentemente dimostrato di ricapitolare il comportamento dei marcatori SG endogeni in altri sistemi. Inoltre, perché MRFP fluorescenza è pH insensibile, espressione di NPY-MRFP consente la visualizzazione delle SG acidi e valutazione quantitativa di esocitosi utilizzando piastre da 96 pozzetti e un lettore di fluorescenza. Abbiamo dimostrato che NPY-MRFP viene consegnato al SGS acide delle cellule RBL e BMMCs e viene rilasciato dalle cellulein modo regolato lungo il SG carico endogena (cioè, β-esosaminidasi e serotonina) ^{30, 32.} Questo protocollo fornisce una metodologia di imaging-based ad alta risoluzione che permette di geni di screening di interesse per la loro fenotipica e l'impatto funzionale su caratteristiche SG e degranulazione in cellule RBL ^32. In particolare, questo protocollo permette il monitoraggio in tempo reale di MC SGS e quantificazione della loro area o dimensioni del volume, il loro numero, la cinetica di assemblaggio, il loro movimento lungo il citoscheletro cellulare e la loro ultima fusione con la membrana plasmatica in condizioni diverse. Ad esempio, sensibilizzando le cellule con DNP-IgE specifiche e innescando le cellule con un Ag polivalente (DNP coniugato albumina sierica) in diverse perturbazioni (ad esempio, l'abbattimento dei geni di interesse, oltre l'espressione di geni wt o mutanti, o manipolazioni farmacologiche) e confronto alle cellule di controllo.

1. Preparazione di RBL Cellulari Media Cultura

1. Mescolare 500 ml di mezzo modificato Eagle glucosio basso di Dulbecco (DMEM) con 56 ml di siero fetale bovino (questo fa 10% FBS), e poi aggiungere 5,5 ml di penicillina streptomicina (questo fa ~ 1% PEST).
2. Filtrare il mezzo utilizzando 500-1000 ml Bottle-Top Filtri vuoto con 0,22 micron dimensione dei pori e conservare a 4 ° C.

2. coltura di cellule RBL

1. Grow cellule RBL in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ a 37 ° C sia in lastre o flaconi. Cellule RBL che stanno crescendo in 10 centimetri piastre devono essere integrati con 10 ml di media e formano monostrato confluente di ~ 10 ⁷ cellule / piastra.
2. Quando lo strato di cellule si avvicina confluenza, replate la coltura ad una densità inferiore.
   1. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra / beuta usando una pipetta pasteur sterile collegata al vuoto.
   2. Sciacquare il monostrato cellulare con preriscaldata (37° C) 0,25% tripsina / EDTA che copre tutta monostrato (il volume dipende dalle dimensioni della piastra di coltura / beuta; 2 ml da 10 cm Piatto). Ciò staccare le cellule.
   3. In alternativa, lavare il monostrato cellulare con tampone fosfato (PBS), togliere la PBS e aggiungere preriscaldata (37 ° C) tripsina / EDTA. Questo passaggio stacca le cellule più veloce.
   4. Posizionare la piastra / beuta in un incubatore a 37 ° C (non più di 10 min).
   5. Ispezionare le cellule sotto il microscopio ottico per controllare se hanno staccato. Se le cellule non si staccano dopo 10 min, picchiettare delicatamente sulla piastra / fiasco.
   6. Aggiungere mezzo alla piastra di coltura / beuta di sospendere le cellule (il volume del mezzo deve essere di almeno 2 volte superiore al volume della soluzione di tripsina).
   7. Agglomerare le cellule per centrifugazione per 3 min a 200 ga 25 ° C.
   8. Risospendere le cellule in medium. Diluire le cellule 01:10 e seminare in un nuovo piatto cultura. Incubare le cellule per 48-72 ore, fino a quando non REACh circa il 90% di confluenza.
   9. Ripetete la stessa procedura (sezione 2.2.1-2.2.8) per un massimo di 3 mesi (30 passaggi).

3. Preparazione di Transfection media.

1. Preparare una soluzione 100 mM di K-Pipes pH 7, soluzione 1 mM di Ca ²⁺ acetato e soluzione 100 mM di acetato di Mg ^2+.
2. Diluire soluzione mM 100 di K-Pipes pH 7 in 20 mM con DMEM media, aggiungere la soluzione 1 mM di Ca ²⁺ acetato ad una concentrazione finale di 10 mM e 100 mM di soluzione di acetato di Mg ²⁺ ad una concentrazione finale di 2 mm.
3. Pesare glutammato potassio e aggiungere alla soluzione ad una concentrazione finale di 128 mM, mescolare bene e mantenere a 4 ° C fino al momento dell'uso. Mantenere le restanti soluzioni (es., K-Tubi, Ca ²⁺ acetato, Mg ²⁺ acetato) a -20 ° C.

4. Trasfezione delle cellule RBL

1. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra / beuta utilizzando unsterile pipetta pasteur collegata al vuoto.
2. Sciacquare il monostrato cellulare con preriscaldata (37 ° C) tripsina / EDTA che dovrebbe coprire l'intero monostrato. Posizionare la piastra / beuta in un incubatore a 37 ° C (non più di 10 min). Controllare se le cellule hanno staccato con il microscopio ottico.
3. Aggiungere mezzo alla piastra di coltura / beuta di sospendere le cellule (il volume dei media dovrebbe essere di almeno 2-grande più del volume della soluzione tripsina).
4. Contare il numero di cellulare utilizzando emocitometro.
5. Pellet 1,5 × 10 ⁷ cellule mediante centrifugazione per 3 min a 200 xg a 25 ° C. Eliminare il surnatante e aggiungere 280 ml di media trasfezione. Trasferire la miscela di reazione in 4 millimetri cuvetta.
6. Aggiungere 20 mg di NPY-MRFP plasmide e uno di 30 microgrammi di plasmide di controllo vuota o un plasmide testato. Il volume finale della miscela di reazione deve essere di 300 microlitri.
7. Porre immediatamente in ghiaccio per 10 min. Pulire la cuvetta dall'acqua residua e proceed di elettroporazione a 300 V per 9 msec.
8. Per le misure di esocitosi, replate immediatamente le cellule in 24 e piastre di coltura dei tessuti contenenti 300 ml di media. Aggiungere 8 ml di miscela di reazione (4 × 10 ⁵ cellule) a ciascun pozzetto. Aggiungi cellule 4 × 10 ⁵ non trasfettate per pozzi addizionali per il controllo. Preparare sufficienti pozzetti per avere almeno pozzetti duplicati per ogni trattamento per ogni trasfezione.
9. Per la microscopia lasso di tempo, replate immediatamente le cellule in un sistema coverglass borosilicato camera 8-pozzetti contenenti 80 microlitri di media. Aggiungere 1,5 ml di miscela di reazione (7,5 × 10 ⁴ cellule) per ciascuna camera. (Prova per evitare di utilizzare le camere a bordo del coprioggetti, le camere al centro della coprioggetti sono più facili da immagine).
   NOTA: È importante sottolineare che non tutte le cellule di risposta a un trigger e, occasionalmente, la microscopia time-lapse è abrogata a causa della perdita di concentrazione e deriva della borosi camera 8-benesistema coprioggetti licate. Pertanto, preparare almeno 8 camere per ogni trattamento per ogni trasfezione.
10. Per sensibilizzare le cellule per FcεRI attivazione mediata, aggiungere 1 mg / ml di topo DNP monoclonale specifico IgE ai media (incubare le cellule con IgE per almeno 2 ore).
11. Dopo 18-24 ore di utilizzare un microscopio a fluorescenza per confermare che le cellule esprimono i plasmidi. I eccitazione e di emissione di fluorescenza MRFP sono: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-MRFP dovrebbe apparire in strutture vescicolari che corrispondono ai SG. Se il secondo gene di interesse è fuso a un tag fluorescente utilizzare un microscopio a fluorescenza per confermare la co-espressione di due plasmidi alle stesse cellule. Ad esempio, se il gene testato è fuso con GFP, le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di fluorescenza GFP sono: λEx 488, λEm 507 nm. La proteina GFP tag dovrebbe apparire le stesse cellule che esprimono NPY-MRFP.
12. Per misure esocitosi procedere to punto 5 e per la microscopia lasso di tempo, procedere al punto 6.

5. Misura NPY-MRFP Esocitosi

1. Preparazione del tampone di Tyrode:
   1. Preparare una soluzione di 54 mM KCl, 20 mM MgCl _2, 2.74 M NaCl e 8 mm NaH ₂ PO ₄ in DDW. Mescolare bene e conservare a 4 ° C. Questo passo è per la preparazione di 20x tampone Tyrode.
   2. Preparare una soluzione di 20 mM Hepes pH 7, 1.8 mM CaCl _2, 1 mg / ml BSA, 5.6 mM glucosio e da 1 a 20 diluizione Tyrode 20x in DDW e mescolare bene. Questo passo è per la preparazione di 1x tampone Tyrode.
   3. Aliquota del buffer 1x Tyrode e conservare a -20 ° C. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.
2. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra 24 pozzetti e lavare 3 volte con tampone di Tyrode. Preparare le cellule stimolate con l'aggiunta di 200 microlitri di buffer Tyrode per controllare i pozzi.
3. Preparare 10 ml / pozzetto di 20X concentrata attivazione reagente [(ad esempio 1.000 ng / ml DNP-BSA o DNP-HSA (Ag), 200 mM Ca ²⁺ ionoforo (A23187 esempio), e una combinazione di 20 mM Ca ²⁺ ionoforo e 1000 nM 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetato (TPA)]. Se i reagenti sono conservati in DMSO, diluire i reagenti in 20x concentrazione in tampone di Tyrode contenente 1% DMSO. Incubare a 37 ° C per 30 min.
4. Rimuovere il surnatante di ciascun pozzetto con attenzione ad una piastra da 96 pozzetti, disporli sul ghiaccio ed evitare dalla luce. (I surnatanti contengono il peptide chimerico NPY-MRFP che è stato rilasciato dalle cellule).
5. Aggiungere 200 microlitri tampone di Tyrode contenente 0,5% Triton X-100 in ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 10 min. (Questo passaggio è importante per la preparazione di lisati cellulari contenenti la restante NPY-MRFP che non è stato rilasciato dalle cellule). Raccogliere i lisati cellulari e versare in un piatto ben 96, disporli sul ghiaccio e di evitare la luce.
6. Misurare la fluorescenza dei supernatanti cellulari e lisati cellulari utilizzando un flza lettore di piastra, con un 590-, 20 nm di larghezza di banda di eccitazione filtro e 635-filtro emissione di larghezza di banda di 35 nm.
7. Calcolare la percentuale di NPY-MRFP rilasciato:
   NOTA: La misura lettore di fluorescenza unità fluorescenza arbitrarie (AFU). AFU valori dipendono dalla macchina e la sua sensibilità e l'efficienza di trasfezione.
   1. Impostare l'autofluorescenza delle cellule RBL nontransfected come vuoti. Dividere il AFU di ogni surnatante alla fluorescenza totale (AFU dei surnatanti + AFU della corrispondente lisato) e moltiplicare per 100.

6. Time-lapse Microscopia di Esocitosi

1. Seed 7.5 × 10 ⁴ della transfettate cellule / camera in un sistema coprioggetti borosilicato camera 8 pozzetti. Dopo 18-24 ore, rimuovere il terreno di coltura dalle camere e lavare 3 volte con tampone di Tyrode
2. Aggiungere 72 ml di tampone di Tyrode per ciascuna camera. Diluire i reagenti attivanti nel buffer Tyrode a 10x concentrazione.
3. Utilizzare un microscopio a fluorescenza confocale dotato di una camera riscaldata (37 ° C) e CO ₂ di controllo (4,8%) e un obiettivo 40X o 63X. Accendere i sistemi microscopio: lampada al mercurio, computer, e laser. Assicurarsi che la camera riscaldata è alla giusta temperatura prima di avviare l'esperimento.
4. Posizionare la camera nella camera riscaldata e assicurarsi che la camera sia installato correttamente e stabile.
5. Accendere la luce di fluorescenza secondo il fluoroforo pertinente e visualizzare le cellule transfettate. Spegnere fluorescenza volta una cellula di interesse nel settore al fine di minimizzare il candeggio e citotossicità. È importante che questo campo conterrà circa 2-3 cellule trasfettate. Le cellule transfettate devono essere ben distribuite ma non si toccano.
6. Regolare la potenza del laser (a seconda del microscopio) per ridurre il rumore e sovrasaturazione nonché la tossicità, e impostare il guadagno e offset per modificare il rapporto segnale-rumore. Scansione veloce oder per minimizzare la durata di esposizione laser (media 2).
7. Regolare le dimensioni pinhole ad un massimo, questo consente diminuendo la potenza del laser e mantenere immagini focalizzate per un lungo periodo di tempo. Se lo si desidera, impostare i parametri per lo stack Z per ricostruire l'immagine tridimensionale, regolare la dimensione foro stenopeico di 1 unità arioso (AU), che dà il meglio rapporto segnale rumore e acquisire la scansione successiva di bidimensionali fette ottica confocale in -axes z con fette ottici ≤0.7 micron.
8. Impostare l'intervallo di tempo tra ogni acquisizione di 15-30 sec e la durata totale di acquisizione per 15 min e cominciare ad acquisire immagini. Dopo 5 minuti di pausa acquisizione della serie storica. Aggiungere 8 ml di trigger 10x e continuare immediatamente l'acquisizione.
9. Salvare le immagini, eseguire deconvoluzione utilizzando un software deconvoluzione e ricostruire le pile di immagini tridimensionali e di un filmato utilizzando software Imaris.

7. Analisi immagine

1. Importare i dati dalle immagini della serie tempo deconvoluto che sono stati ottenuti con il microscopio confocale a software Imaris. Questo software legge più di 40 file microscopia. Se il software non è in grado di leggere i file; convertire i file in file TIF e di importazione.
2. Per aggiungere punti di tempo alla fine di una serie di dati aperta premete Modifica -> Aggiungi Punti Tempo e importare i nuovi set di dati.
3. Creare la superficie del canale MRFP usando l'opzione wizard di superficie. Scegliere l'algoritmo di default. Scegliere il canale di NPY-MRFP. Segnare l'opzione smoothing per ridurre il rumore. Per evitare la perdita di piccoli dettagli riducono livello dell'area dettaglio 0,05 micron.
4. Impostare la soglia di intensità. Viene visualizzato Nuovo superficie grigia. Vai su "Impostazioni" e cambiare lo stile da "Punto centrale" a "Surface".
5. Vai alla scheda statistica nelle proprietà dell'oggetto selezionato, selezionare la scheda dettagliata e il valore specifico such come intensità di fluorescenza, volume, ecc
6. Rivedere i dati e verificare che i valori siano compatibili con le immagini. Per esempio, due o più granuli adiacenti possono essere misurate come uno granello grande. Per quantificare la dimensione media dei granuli dividere la dimensione dei granuli uniti al numero effettivo di granuli.
7. Esportare i set di dati desiderati in file Excel e analizzare i dati.

A causa della bassa efficienza di trasfezione di MC, manipolazioni genetiche è improbabile che lasciare un impatto sulle letture di secrezione media misurate dai mediatori endogeni SGS. Tuttavia, stabilendo completa co-espressione del gene reporter NPY-MRFP e il plasmide co-trasfettato nelle stesse cellule, monitoraggio dei risultati NPY-MRFP nel monitoraggio esclusivamente popolazione cellulare che esprime il gene di interesse. Pertanto, il vantaggio di questo test rispetto ai metodi convenzionali è la capacità di controllare selettivamente le cellule geneticamente manipolate (Figura 1).

Infatti, da questo test abbiamo proiettato i geni che regolano il traffico vescicolare tra cui NSF solubile del recettore proteina attacco (militare) proteine ​​[sensibili fusione N-etilmaleimmide] e 44 membri della famiglia Rab GTPasi. Abbiamo identificato i geni che regolano SGsize, numero, la composizione del carico e esocitosi ^23.

We identificato 30 Rabs che alterati (cioè, inibire o stimolare) esocitosi in cellule RBL stimolate da una Ag o dalla combinazione di un Ca ²⁺ ionoforo e l'estere del forbolo TPA (Ion / TPA) ^23. Confocale ha rivelato insidie ​​e Rabs che hanno causato fenotipi drammatici che alterano la morfologia delle cellule o SGS ^30,32. Confocale di queste proteine ​​ha rivelato 8 insidie ​​e Rabs che hanno causato fenotipi drammatici sulle cellule o del SG morfologia ^30,32. Usando questo protocollo abbiamo potuto tracciare singoli SGS e effettuare misure delle loro dimensioni, intensità di fluorescenza, il loro movimento e esocitosi. Ad esempio, abbiamo identificato Rab5 come regolatore di SG biogenesi ^30. Rab5 è stato identificato come il principale regolatore di endocitosi e endosomiale fusion ^24. Abbiamo dimostrato che la co-espressione di (CN) mutanti costitutivamente negativi PIL bloccato delle isoforme endogeno espresse Rab5 (Rab5A, Rab5B e Rab5C) o expression di Rab5A / B / C di targeting shRNAs, ha ridotto significativamente le dimensioni SGS 'con un concomitante aumento del loro numero ^30. Al contrario, l'espressione di un GTP-locked, costitutivamente attivo (CA) Rab5A mutante (Rab5A Q79L, qui: "CA Rab5A"), che è noto per facilitare la fusione omotipica di endosomi precoci (SEO) ^24, ha portato alla formazione di gigante vescicole Rab5A-decorato, che abbiamo identificato come SG in base al contenuto del secretoria cargo NPY-MRFP e la serotonina, e la loro capacità di esocitosi in modo regolamentato ^30.

Figura 2 mostra le analisi morfometriche del NPY-MRFP contenenti SGS. Il volume medio SGs in cellule che esprimono Rab5A CA raggiunto il valore di 44 micron ^3, che era> 20 volte maggiore del volume medio di SGS nel controllo-GFP cellule esprimenti mentre il loro numero è stato ridotto di 20 volte (Figura 2A). La relazione inversatra il numero e le dimensioni dei SGs (Figura 2A) ha suggerito che l'allargamento Rab5-mediata del SGs comporta la loro fusione omotipica. Il gigante NPY-MRFP contenenti SG formate da CA Rab5A microscopio confocale permette l'imaging di cellule viventi in una ad alta risoluzione che consente il monitoraggio SGS in dettagli che non potevano essere possibile altrimenti. Ad esempio, abbiamo rilevato Rab5A in fusione SG insieme strutture più piccole sparse tra il gigante SG, probabilmente corrispondenti a endosomi (Figura 2b). Inoltre, abbiamo dimostrato che Rab5 transitoriamente e preferibilmente associati con lo SGS di nuova formazione che suggeriscono che l'associazione selettiva e transitoria delle Rab5A con nuova formazione SGS è compatibile con un apparato fusogenica in cui solo granuli appena generati hanno la capacità di fondersi con altri SG ^30.

La figura 3 mostra le immagini time-lapse rappresentativi di MC gigante SG che si sono formate per l'espressione di CARab5A e la cinetica di esocitosi nella risoluzione di un singolo SG dopo stimolazione. Durante MC esocitosi, SGS si muovono verso e si fondono con la membrana plasmatica. Come conseguenza il carico secretoria viene rilasciato dalle cellule nello spazio extracellulare. In questo sistema sperimentale, NPY-MRFP viene rilasciata dalle cellule e trova nelle cellule surnatanti. La fluorescenza di NPY-MRFP nei sovranatanti di cellule può essere misurata con un lettore di fluorescenza. Tuttavia, poiché NPY-MRFP è diluito nei sopranatanti suo segnale di fluorescenza può non essere rilevato o visualizzate al microscopio a fluorescenza. Il rilascio di NPY-MRFP dai granuli durante risultati esocitosi in una diminuzione rapida e drammatica in NPY-MRFP intensità di fluorescenza e ritiro del NPY-MRFP contenenti SGS e la loro disappearance.Therefore, imaging cellulare dal vivo di cellule e misure di NPY stimolate fluorescenza -mRFP o NPY-MRFP dimensioni contenente SG forniscono valutazioni accurate delle cinetiche di esocitosi disingoli granuli. Figura 3B mostra le intensità di fluorescenza di SG dopo stimolando le cellule con un Ca ²⁺ ionofori. SGS subiscono esocitosi a tempi diversi (ad esempio, 2, 3, 6, e 11 min di stimolazione postale), mentre l'intensità di fluorescenza di un singolo SG che non fonde con la membrana plasmatica è rimasta costante.

Figura 1:. Illustrazione delle principali fasi del protocollo RBL cellule sono cotrasfettate con NPY-MRFP e un secondo gene di interesse o corrispondente di controllo plasmide e subito seminate su vetrini, 8 pozzetti sistema coverglass borosilicato camera o piastre a 96 pozzetti. Il giorno dopo, Immagini della NPY-MRFP contenenti SGS di riposo e le cellule attivate vengono acquisiti mediante microscopia confocale (A). Inoltre, esocitosi di Resting e innescato cellsis quantificato misurando il rilascio di NPY-MRFP in un lettore di fluorescenza 96 pozzetti (B).

Figura 2:. Quantificazione delle dimensioni SGs 'RBL cellule sono state co-trasfettate con NPY-MRFP e sia GFP o GFP-CA Rab5A e seminate su 8 pozzetti sistema coprioggetti borosilicato camera. 24 ore più tardi, la camera 8 pozzetti è stata posta in microscopio confocale laser attrezzato camera riscaldata (37 ° C). Immagini Z-stack di immagini successive con fette ottiche 0,7 micron sono stati catturati con un / 1,4 obiettivo apertura numerica 63X olio. Le immagini sono state deconvoluto e tre immagini di dimensione sono stati costruiti dal software Imaris. Il volume della SGS e il loro numero sono stati calcolati usando il software Imaris (A). Parte della Granu NPY-MRFP contenentiles sembra essere incorporato all'interno Rab5A (punte di freccia). Altri sono nudi o ponte con Rab5A (frecce). Bar Scala = 5 micron (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3:. Misura la portata e cinetica di esocitosi nella risoluzione di una singola SG in cellule activatedRBL RBL cellule sono state co-trasfettate con NPY-MRFP e GFP-CA Rab5A e sistema coverglass seminato in8-bene borosilicato camera. 24 ore più tardi camera IN8-pozzo è stato collocato in un microscopio confocale laser dotato di una camera riscaldata (37 ° C) e le cellule sono state innescato con 10 mM Ca2 + ionoforo. Le immagini sono state acquisite ogni 15 secondi con un / 1,4 obiettivo apertura numerica 63X olio. Immaginierano deconvoluto e poi elaborati dal software Imaris. Bar Scala = 5 micron (A). L'intensità di fluorescenza media dei NPY-MRFP contenenti granuli è stato determinato dal software Imaris ei dati sono stati normalizzati in base al tempo 0 (tempo di aggiunta del Ca2 + ionoforo). Le frecce rappresentano i punti di tempo in cui il rilascio di SGcargo wasnoted (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Descriviamo una strategia innovativa che combina la quantificazione di MCs esocitosi e quattro (x, y, z, t) quantificazioni dimensione da immagini tridimensionali e ritardi delle SG in cellule viventi con un gene reporter per esocitosi. Questa tecnica consente proiezione di famiglie di proteine ​​per il loro impatto sulla funzione MC come SGs monitoraggio inizio già a loro uscita dal Golgi attraverso la loro maturazione, acquisizione di competenze esocitosi e degranulazione. La combinazione di misure di esocitosi insieme caratterizzazioni morfometriche e cinetici della SG fornisce informazioni sui meccanismi con cui le proteine ​​testate mediano funzioni MC. Pertanto, con questa metodologia, la manipolazione genetica dei geni mirati può svelare nuovi meccanismi molecolari con cui il negozio MC SGS e rilasciare il loro carico. In particolare, NPY può servire come reporter per esocitosi in altre cellule secernenti quali MCF-7 cellule, una linea cellulare derivata from una ghiandola mammaria adenocarcinoma umano ^31, cellule cromaffini ³⁴ e pancreatiche β-cellule ^35.

Manipolazioni genetiche sono gli strumenti più potenti attualmente disponibili per la ricerca di reti funzionali. Manipolazioni genetiche permettono l'identificazione di proteine ​​essenziali in ogni rete, la cui eliminazione imporrà collasso del sistema, a differenza di altre proteine, la cui eliminazione imporrà diafonia tra reti parallele o non hanno alcun effetto dovuto alla ridondanza. Tuttavia, a causa della bassa efficienza di trasfezione di MC, quando si misura esocitosi di mediatori endogeni solo una piccola frazione di cellule esprime il 'manipolare' DNA test. Quindi, quando si misura esocitosi di mediatori endogeni, il contributo delle cellule trasfettate la lettura totale è minore. Pertanto, il tentativo di adottare tale approccio per esplorare le reti complesse associate alla esocitosi regolata in MCs era ettarimpered. Questa tecnica supera l'ostacolo della bassa efficienza di trasfezione e fornisce un modo semplice per osservare alternanze fenotipiche MC SG causate da over espressione, atterramento e mutagenesi di geni di interesse.

Questa tecnica può essere estesa per indagare la gerarchia e la modalità di interazione di reti funzionali utilizzando transitoria triple-trasfezione. I risultati saranno analizzati per determinare quale gene può salvare un certo fenotipo; causare un fenotipo più drammatico o non hanno alcun effetto. Sulla base di tali trasfezioni combinatorie, reti esocitosi possono essere costruiti. Ad esempio, utilizzando triple-trasfezione siamo stati in grado di identificare la proteina SNARE VAMP8 come mediatore a valle nel processo di Rab5-dipendente SG fusion ^25.

Questo metodo permette la visualizzazione e la quantificazione della esocitosi nella risoluzione dei singoli SGS. Infatti siamo stati in grado di dimostrare che SGS risposte differenziali display STIMUli. La ragione per cui certe SG fuse con la membrana plasmatica, mentre altri non hanno fatto o la ragione per la cinetica differenziali di MC SG fusione restano da determinare. Futuri studi che utilizzano questo approccio sperimentale hanno il potenziale per rispondere a queste domande. Ad esempio, la quantificazione delle diverse SNAREs o Rabs sulle singole SGS e correlazione con competenze esocitosi e la cinetica del esocitosi nella risoluzione di una singola SG dovrebbe rivelare nuovi regolatori di esocitosi.

Il limite principale di questa tecnica è la manipolazione genetica causa sovraespressione di una proteina può influenzare la funzione delle cellule o la morfologia. Pertanto, è essenziale per convalidare i risultati con approcci complementari. Ad esempio, quando sovraespressione di un mutante costitutivamente attivo inibisce esocitosi, l'effetto di un costitutiva mutante negativo o abbattere del gene dovrebbe essere testato pure.

Usando questa tecnica, si IDENTIFIED nuovi regolatori di funzioni MC, che colpiscono MC esocitosi o alterano la morfologia del SG. La combinazione di misurazioni esocitosi insieme caratterizzazione morfometrica SG fornisce più profonde intuizioni sulla funzione e meccanismi di azione delle proteine ​​testate.

The authors have no financial conflicts of interest.

Ringraziamo il Dr. U. Ashery per il dono di NPY-MRFP cDNA. Ringraziamo Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, e Y. Zilberstein per la preziosa assistenza di microscopia e analisi dell'immagine. Ringraziamo anche il Dr. Joseph Orly per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Israel Science Foundation, fondata dall'Accademia di Israele per le Scienze (1139-1112 di RS-E.).