التحقيق ماست الخلية الإفرازية حبيبات. من البناء الحيوي لالإيماس

وكان الهدف من هذا البروتوكول إلى تطوير طريقة من شأنها أن تسمح التحليلات الجينومية الوظيفية لإفراز الخلايا البدينة. ويستند هذا البروتوكول على التقييم الكمي لإطلاق سراح من الجين مراسل الفلورسنت cotrasfected مع الجينات في المصالح في الوقت الحقيقي تحليلات التشكل حبيبة إفرازية ل.

الخلايا البدينة (MC) هي الخلايا الإفرازية للجهاز المناعي التي تحقق وظائفها الفسيولوجية والمرضية عن طريق الإفراج عن وسطاء الحساسية، التهابات وimmunoregulatory قبل تشكيلها وتوليفها حديثا. وسطاء إم سي إس "تؤثر على الأنسجة والأعضاء متعددة بلغت ذروتها في استجابات حساسية والمناعة. وينظم درجة عالية من التوليف والتخزين والإفراج عن وسطاء MC. معبأة الوسطاء شكلت قبل في حبيبات إفرازية حشوية (SG) أن تلتحم مع غشاء البلازما والافراج عن محتواها بواسطة إيماس المنظم. نقدم بروتوكول، على أساس المشاركة في التعبير عن الجينات في المصالح مع الجين المراسل أن يتم استهداف لجان الدراسات وإصدارها بطريقة المنظم جنبا إلى جنب مع وسطاء SG الذاتية. بروتوكول يتيح عالية الدقة أربعة متحد البؤر الأبعاد يحلل من MC جان الدراسات ومراقبة الجدول الزمني الخاصة بهم من نشوء حيوي لإيماس تشغيلها. وهكذا، وذلك باستخدام هذا البروتوكول لفحص الجينات من بينمؤسسة لالمظهرية والوظيفية تأثيرها يسمح فك رموز الآليات الجزيئية التي تتحكم في نشوء حيوي وإيماس من MC جان الدراسات وتحديد الجهات الرقابية المعنية. وبالتالي، ينبغي أن تقدم مزيدا من الإيضاحات عن الآليات الخلوية التي تمثل وظيفة إم سي إس في الصحة والمرض.

الخلايا البدينة (MC) هي خلايا المناعة التي اشتهر مشاركتهم في الحساسية والتهابات مثل التهاب المفاصل والربو والتهاب المريء بالحمضيات، التهاب الجلد المزمن وصدمة الحساسية ^1،2 فضلا عن الأمراض الأخرى بما في ذلك مرض الشريان التاجي ^3،5 و السرطان ^3،4. وبالإضافة إلى ذلك، إم سي إس تلعب أدوارا هامة في المناعة الفطرية والتكيفية، سواء في الدفاع المضيف ضد البكتيريا والطفيليات وقمع الاستجابات المناعية، على سبيل المثال حمل المزروع التسامح ^5،6.

المعلقون تنشأ من النخاع العظمي، وتطوير من CD34 + / CD117 + الخلايا الاصلية المحفزة ^7. يتم الافراج نخاع العظام ملتزمة الأسلاف MC إلى مجرى الدم وتهاجر إلى الأنسجة الطرفية توطين في الغالب داخل الأنسجة الضامة والأسطح الظهارية ^8. وحققت النضج والتمايز النهائي في نهاية المطاف تحت تأثير سو السيتوكينات داخل الوسط ^8،9 المحيطة بها.

المعلقون يمكن تفعيلها من خلال مثيرة للحساسية (مستضد، حج)، الذي أدى إلى جيل من الغلوبولين المناعي E (IgE و) لقاء اكتب الأجسام المضادة. ربط هذا إيج لمستقبلات FcεRI مولودية، تليها عبر ربط الخلايا ملزمة الجلوبيولين على إعادة التعرض لنفس حج، والنتائج في FcεRI تجميع والشروع في سلسلة مما يشير إلى أن يبلغ ذروته في تحبب خلية [استعراضها في ^10،11] . يتم تنشيط إم سي إس أيضا، بشكل مستقل عن فريق الخبراء الحكومي الدولي، من خلال نيوروببتيد ^5،12، والسموم ^13، بكتيريا ومولدات المضادات الفيروسية ^14،15، وعدد من الببتيدات موجبة الشحنة يشار إليها مجتمعة ب secretagogues الأساسية، الخلايا المناعية والسيتوكينات ^{5،13،12،16 ، 17.} يتم تنشيط المعلقون أيضا من قبل العديد من وسطاء لهم صدر الخاصة، الأمر الذي يزيد من تضخيم الاستجابة الالتهابية.

معبأة المعلقون مع حبيبات إفرازية (جان الدراسات) التي تحتوي على المناعةوسطاء التنظيمية، بما في ذلك الأمينات فعال في الأوعية، مثل الهستامين والسيروتونين (في القوارض)، البروتيوغليكان، البروتياز، مثل كيماز وتريبتاز، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية والعديد من السيتوكينات و chemokines ^8،9. هذه هي وسطاء "على استعداد للذهاب" وحالما يتم تفعيل المعلقون من قبل التحفيز المناسب، وأصدرت هذه سطاء من الخلايا عن طريق إيماس تنظيم (تحبب) في بضع ثوان إلى دقائق ^18،19. ويتبع هذا الحدث الأولي من التوليف دي نوفو وإطلاق مجموعة كبيرة من المواد الفعالة بيولوجيا، بما في ذلك الأيض حمض الأراكيدونيك، السيتوكينات متعددة وكيموكينات ^20،21،22. الافراج عن المنتجات تصنيعه حديثا يحدث بشكل مستقل عن إطلاق SG. بشكل جماعي، وهذه سطاء الشروع الردود في وقت مبكر والمرحلة المتأخرة التهابات والحساسية. ولذلك، فهم آليات المحاسبة لتفعيل MC وتحبب كلاهما عفريت النظري والسريريortance.

صعوبة التلاعب وراثيا إم سي إس الابتدائية ومثقف وأعاقت محاولات لتوضيح الآليات الكامنة MC تحبب، والتي ظلت حلها بشكل سيئ. للتغلب على هذه المشكلة وضعنا مقايسة على أساس مراسل بواسطة خط الخلية المخاطية الصاري transfecting المشترك، الفئران سرطان الدم مستقعد (RBL) -2H3 (المشار إليها هنا RBL) أو نخاع العظام المستمدة إم سي إس (BMMCs) ³⁰ مع الجينات في المصالح و نيوروببتيد Y (NPY) تنصهر لRFP أحادى (mRFP)، كمراسلة SG.

تم NPY توضح مسبقا تلخيص سلوك علامات SG المحلية في النظم الأخرى. وعلاوة على ذلك، لأن mRFP مضان هو الرقم الهيدروجيني حساسة والتعبير عن NPY-mRFP يسمح التصور من لجان الدراسات الحمضية وكذلك التقييم الكمي للإيماس باستخدام لوحات 96-جيدا وقارئ لوحة مضان. لقد أظهرنا أن يتم تسليم NPY-mRFP لجان الدراسات الحمضية خلايا RBL وBMMCs ويتم تحريرها من الخلايابطريقة المنظم إلى جانب البضائع SG الذاتية (أي، β-هيكسوزامينيداز والسيروتونين) ^{30، 32.} يوفر هذا البروتوكول منهجية قائمة على التصوير عالية الدقة التي تسمح الجينات فحص الفائدة لالمظهرية وتأثيرها على خصائص وظيفية SG وتحبب في خلايا RBL ^32. على وجه التحديد، وهذا البروتوكول يسمح في الوقت الحقيقي تتبع MC جان الدراسات والكمي لمنطقتهم أو حجم وحدة التخزين، عددهم، حركية التجمع والتنقل على طول الهيكل الخلوي الخلية والانصهار في نهاية المطاف مع غشاء البلازما تحت ظروف مختلفة. على سبيل المثال، توعية الخلايا مع DNP محددة إيج والتسبب في الخلايا مع حج متعددي (DNP مترافق ألبومين المصل) تحت الاضطرابات المختلفة (أي ضربة قاضية للجينات من الفائدة، على التعبير عن الجينات WT أو متحولة، أو التلاعب الدوائية) و مقارنة للسيطرة على الخلايا.

1. إعداد RBL خلية الثقافة وسائل الإعلام

1. مزيج 500 مل من المتوسط ​​تعديل النسر انخفاض مستوى السكر في Dulbecco لفي (DMEM) مع 56 مل من مصل بقري جنيني (وهذا يجعل 10٪ FBS)، ثم قم بإضافة 5.5 مل من البنسلين ستربتومايسين (وهذا يجعل ~ 1٪ من الآفات).
2. تصفية وسائل الإعلام باستخدام 500-1،000 مل زجاجة-الأعلى فراغ الفلاتر مع 0.22 ميكرون حجم المسام وتخزينها في 4 ° C.

2. الثقافة من الخلايا RBL

1. زراعة خلايا RBL في جو مرطب من CO ₂ 5٪ عند 37 درجة مئوية في أي لوحات أو قوارير. وينبغي استكمال خلايا RBL التي تنمو في 10 سم لوحات مع 10 مل المتوسطة وتشكيل أحادي الطبقة متموجة من ~ 10 ⁷ خلايا / لوحة.
2. عندما طبقة الخلايا يقترب التقاء، replate ثقافة في مناطق ذات كثافة أقل.
   1. إزالة مستنبت من لوحة / قارورة باستخدام ماصة باستير العقيمة متصلة فراغ.
   2. شطف أحادي الطبقة الخلية مع prewarmed (37° C) 0.25٪ التربسين / EDTA التي تغطي أحادي الطبقة بأكملها (حجم يعتمد على حجم وحة الثقافة / قارورة، 2 مل لمدة 10 سم لوحة). وهذا فصل الخلايا.
   3. بدلا من ذلك، شطف أحادي الطبقة الخلية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة prewarmed (37 درجة مئوية) التربسين / EDTA. هذه الخطوة تنفصل الخلايا بشكل أسرع.
   4. وضع لوحة / قارورة في حاضنة عند 37 درجة مئوية (لا يزيد عن 10 دقيقة).
   5. تفقد الخلايا تحت المجهر الضوئي للتحقق مما إذا كانت قد منفصلة. إذا لم الخلايا فصل بعد 10 دقيقة، اضغط بلطف على لوحة / قارورة.
   6. إضافة المتوسطة إلى لوحة الثقافة / قارورة لتعليق الخلايا (يجب أن يكون حجم المتوسط ​​على الأقل 2 أضعاف أكبر من حجم الحل التربسين).
   7. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 غرام عند 25 ° C.
   8. resuspend الخلايا في المتوسط. تمييع الخلايا عن طريق 1:10 و البذور في صحن الثقافة الجديد. احتضان الخلايا لمدة 48-72 ساعة، حتى REACح ما يقرب من 90٪ التقاء.
   9. كرر نفس الإجراء (القسم 2.2.1-2.2.8) لمدة تصل إلى 3 أشهر (30 الممرات).

3. إعداد ترنسفكأيشن وسائل الإعلام.

1. إعداد 100 ملي حل K-أنابيب الرقم الهيدروجيني 7، 1 ملم حل من الكالسيوم ²⁺ خلات و 100 ملي حل من المغنيسيوم ²⁺ خلات.
2. تمييع ملي حل 100 من K-أنابيب درجة الحموضة 7 إلى 20 مم باستخدام DMEM وسائل الإعلام، إضافة محلول 1 ملم من الكالسيوم ²⁺ خلات إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر و 100 ملي حل من المغنيسيوم ²⁺ خلات إلى تركيز النهائي من 2 ملي.
3. تزن البوتاسيوم الصوديوم وإضافة إلى حل لتركيز النهائي من 128 ملي، تخلط جيدا والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. حافظ على الحلول المتبقية (أي.، K-أنابيب، كاليفورنيا ²⁺ خلات، والمغنيسيوم خلات ²⁺⁾ في -20 ° C.

4. ترنسفكأيشن من خلايا RBL

1. إزالة مستنبت من لوحة / قارورة باستخدامماصة باستير العقيمة متصلة فراغ.
2. شطف أحادي الطبقة الخلية مع prewarmed (37 درجة مئوية) التربسين / EDTA التي ينبغي تغطية أحادي الطبقة بأكملها. وضع لوحة / قارورة في حاضنة عند 37 درجة مئوية (لا يزيد عن 10 دقيقة). تحقق مما إذا كان قد فصل الخلايا باستخدام المجهر الضوئي.
3. إضافة المتوسطة إلى لوحة الثقافة / قارورة لتعليق الخلايا (حجم وسائل الإعلام يجب أن يكون على الأقل 2-أكبر أكثر من حجم الحل التربسين).
4. حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
5. بيليه 1.5 × 10 ⁷ الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 x ج عند 25 درجة مئوية. تجاهل supernatants وإضافة 280 ميكرولتر ترنسفكأيشن المتوسطة. نقل مزيج التفاعل إلى 4 مم كفيت.
6. إضافة 20 ميكروغرام من NPY-mRFP البلازميد وإما 30 ميكروغرام من السيطرة البلازميد فارغة أو البلازميد التي تم اختبارها. يجب أن يكون الحجم النهائي من مزيج رد فعل 300 ميكرولتر.
7. وضع على الفور على الجليد لمدة 10 دقيقة. مسح كفيت من المياه المتبقية وصroceed إلى Electroporation للفي 300 V لمدة 9 ميللي ثانية.
8. لقياس إيماس، replate الخلايا على الفور في 24 جيدا أطباق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 300 ميكرولتر المتوسطة. إضافة 8 ميكرولتر من مزيج التفاعل (4 × 10 ⁵ خلايا) إلى كل بئر. إضافة 4 × 10 ⁵ غير الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى آبار إضافية من أجل السيطرة. إعداد ما يكفي من الآبار لللديك على الأقل تكرار الآبار لكل معاملة لكل ترنسفكأيشن.
9. للمرة الفاصل بين المجهري، replate الخلايا على الفور في 8 جيد غرفة البورسليكات نظام ساترة تحتوي على 80 ميكرولتر المتوسطة. إضافة 1.5 ميكرولتر من مزيج التفاعل (7.5 × 10 ⁴ خلايا) لكل غرفة. (حاول تجنب استخدام غرف على حافة ساترة، وغرف في وسط ساترة هي أسهل للصورة).
   ملاحظة: الأهم من ذلك، ليس كل الخلايا ردا على الزناد، وأحيانا منسوخ المجهري الوقت الفاصل بسبب فقدان التركيز والانجراف من borosi الغرفة 8 جيدانظام ساترة licate. لذلك، وإعداد لا يقل عن 8 غرف لكل علاج لكل ترنسفكأيشن.
10. لتوعية الخلايا لمدة FcεRI تفعيل بوساطة، إضافة 1 ميكروغرام / مل من الماوس إدارة التخطيط الوطني وحيدة النسيلة محددة فريق الخبراء الحكومي الدولي لوسائل الإعلام (احتضان الخلايا مع فريق الخبراء الحكومي الدولي لا يقل عن 2 ساعة).
11. بعد 18-24 ساعة استخدام المجهر الفلورسنت للتأكد من أن الخلايا تبدي والبلازميدات. الإثارة وانبعاث موجات من mRFP مضان هي: λEx 584، λEm 607 نانومتر. يجب أن تظهر NPY-mRFP في الهياكل حويصلي التي تتوافق مع اس جي اس. إذا تم تنصهر فيها الجين الثاني من الفائدة على علامة فلوري استخدام المجهر الفلورسنت لتأكيد المشاركة في التعبير عن كل من البلازميدات في نفس الخلايا. على سبيل المثال، إذا تم تنصهر فيها الجين اختبار لGFP، والإثارة وانبعاث موجات من GFP مضان هي: λEx 488، λEm 507 نانومتر. يجب أن تظهر البروتين GFP الموسومة في نفس الخلايا التي تعبر عن NPY-mRFP.
12. لقياسات إيماس المضي قدما رس الخطوة 5 والفاصل الزمني المجهري، انتقل إلى الخطوة 6.

5. قياس NPY-mRFP الإيماس

1. إعداد عازلة تايرود:
   1. تحضير محلول من 54 ملي بوكل، 20 ملي MgCl _2، 2.74 M كلوريد الصوديوم و 8 ملي ناه ₂ PO ₄ في أحواض دبي الجافة العالمية. تخلط جيدا وتخزينها في 4 درجات مئوية. هذه الخطوة هي لإعداد 20x وتايرود العازلة.
   2. تحضير محلول من 20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7، 1.8 ملي CaCl _2، 1 ملغ / مل BSA، والجلوكوز 5.6 ملم والتخفيف من 1 إلى 20 من تايرود 20x وفي أحواض دبي الجافة العالمية وتخلط جيدا. هذه الخطوة هي لإعداد عازلة 1X تايرود.
   3. قسامة المخزن المؤقت 1X تايرود وتخزينها في -20 ° C. تجنب تكرار التجميد والذوبان.
2. إزالة مستنبت من لوحة جيدا 24 ويغسل 3 مرات مع العازلة تايرود. إعداد الخلايا unstimulated من خلال إضافة 200 ميكرولتر تايرود عازلة للسيطرة على آبار.
3. إعداد تتركز 10 ميكرولتر / جيد من 20X تفعيل كاشف [(على سبيل المثال 1،000 نانوغرام / مل DNP-BSA أو إدارة التخطيط الوطني-HSA (حج)، و ​​200 ميكرومتر الكالسيوم ²⁺ حامل الأيون (على سبيل المثال A23187)، ومزيج من 20 ميكرومتر الكالسيوم ²⁺ حامل الأيون و 1،000 نيوتن متر 12-O- tetradecanoylphorbol-13-خلات (TPA)]. إذا تم تخزين الكواشف في DMSO، يخفف من الكواشف إلى 20x والتركيز في تايرود العازلة التي تحتوي على 1٪ DMSO. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. إزالة supernatants من كل بئر بعناية إلى 96 لوحة جيدا، ضع على الجليد وتجنب من الضوء. (وsupernatants تحتوي على الببتيد خيالية NPY-mRFP الذي تم إصداره من الخلايا).
5. إضافة 200 ميكرولتر تايرود العازلة التي تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100 إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. (هذه الخطوة مهمة لإعداد لست] خلية التي تحتوي على ما تبقى من NPY-mRFP التي لم يفرج عنه من الخلايا). جمع لست] الخلية ونقل إلى 96 لوحة جيدا، ضع على الجليد وتجنب من الضوء.
6. قياس مضان من supernatants الخلية والخلية لست] باستخدام fluorescسينعقد لوحة القارئ، وذلك باستخدام 590-، 20 نانومتر عرض النطاق الترددي الإثارة وتصفية 635-، 35 نانومتر تصفية الانبعاثات عرض النطاق الترددي.
7. حساب النسبة المئوية للنبي-mRFP صدر:
   ملاحظة: هذا الاجراء القارئ مضان وحدات مضان التعسفية (AFU). قيم AFU تعتمد على الآلة وحساسيتها وكفاءة ترنسفكأيشن.
   1. تعيين تألق ذاتي للخلايا RBL nontransfected فارغة كما. تقسيم AFU من كل طاف لمضان الإجمالي (AFU من supernatants + AFU من المحللة المقابلة) ومضاعفة بنسبة 100.

6. الوقت الفاصل بين الميكروسكوب من الإيماس

1. البذور 7.5 × 10 ⁴ من transfected خلايا / غرفة في نظام ساترة غرفة البورسليكات 8-جيدا. بعد 18-24 ساعة، وإزالة مستنبت من غرف ويغسل 3 مرات مع العازلة تايرود
2. إضافة 72 ميكرولتر من العازلة تايرود لكل غرفة. تمييع الكواشف تفعيل العازلة في تايرود إلى 10X التركيز.
<لى> استخدام المجهر مضان مبائر مجهزة غرفة ساخنة (37 ° C) وCO ₂ تحكم (4.8٪) وهدف 40X 63X أو. بدوره على أنظمة المجهر: مصباح الزئبق، والكمبيوتر، وأشعة الليزر. تأكد من أن غرفة ساخنة هي في درجة الحرارة الصحيحة قبل بدء التجربة.
3. ضع غرفة في غرفة ساخنة وتأكد من أن يتم تثبيت الغرفة بشكل صحيح ومستقرة.
4. بدوره على ضوء مضان وفقا لfluorophore ذات الصلة وتصور الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. إيقاف مضان مرة واحدة في خلية من الفائدة في الميدان من أجل تقليل التبييض والسمية الخلوية. فمن المهم أن هذا المجال سوف تحتوي على حوالي 2-3 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. والخلايا المصابة بالعدوى بالنقل يجب أن تنتشر بشكل جيد ولكن لا لمس كل منهما الآخر.
5. ضبط قوة الليزر (اعتمادا على المجهر) للحد من الضوضاء وoversaturation وكذلك سمية، وتعيين الربح وتعويض لتعديل إشارة إلى نسبة الضوضاء. مسح سريع أو دير لتقليل مدة المعرض الليزر (المتوسط ​​2).
6. ضبط حجم الثقب إلى الحد الأقصى، وهذا يتيح تقليل قوة الليزر والحفاظ على الصور ركزت لفترة طويلة من الزمن. إذا رغبت في ذلك، تعيين المعلمات لZ كومة لإعادة بناء الصورة في ثلاثي الأبعاد، وضبط حجم الثقب إلى 1 وحدة مهواة (AU) الذي يعطي أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء والحصول على المسح الضوئي على التوالي من شرائح الضوئية مبائر ثنائية الأبعاد في -axes ض مع شرائح بصرية ≤0.7 ميكرون.
7. ضبط الوقت الفاصل بين كل اكتساب إلى 15-30 ثانية ومدة الاستحواذ الكلي إلى 15 دقيقة والبدء في الحصول على الصور. بعد 5 دقائق من اكتساب وقفة السلاسل الزمنية. إضافة 8 ميكرولتر من على الزناد 10X والاستمرار في الاستحواذ على الفور.
8. حفظ الصور، تنفيذ إزالة التفاف باستخدام برنامج إزالة التفاف وإعادة بناء المداخن إلى ثلاث صور ثلاثية الأبعاد وفيلم باستخدام برنامج Imaris.

الصورة = "jove_title"> 7. تحليلات صورة

1. استيراد البيانات من الصور المتسلسلة deconvoluted التي تم الحصول عليها من قبل مضان المجهر متحد البؤر لبرنامج Imaris. هذا البرنامج يقرأ أكثر من 40 ملفات المجهري. إذا كان البرنامج لا يمكن قراءة الملفات؛ تحويل الملفات إلى ملفات معرض طرابلس والاستيراد.
2. لإضافة نقاط الوقت إلى نهاية مفتوحة مجموعة البيانات الصحفية تحرير -> إضافة نقاط الوقت واستيراد البيانات الجديدة المحددة.
3. خلق سطح القناة mRFP باستخدام الخيار المعالج السطح. اختيار خوارزمية الافتراضية. اختيار قناة NPY-mRFP. بمناسبة الخيار تجانس للحد من الضوضاء. لتجنب فقدان التفاصيل الصغيرة تقلل من مستوى التفاصيل منطقة إلى 0.05 ميكرون.
4. تعيين عتبة الشدة. سيتم عرض سطح رمادي جديد. انتقل إلى "إعدادات" وتبديل النمط من "نقطة المركز" إلى "السطحية".
5. انتقل إلى علامة التبويب إحصائيات في خصائص الكائن المحدد، حدد علامة التبويب مفصل ويرغب، يمث قيمة محددةح كما كثافة مضان، وحجم الخ
6. مراجعة البيانات والتأكد من أن القيم هي متوافقة مع الصور. على سبيل المثال، يمكن قياس اثنين أو أكثر من حبيبات المجاورة كأحد أكبر الحبيبية. لقياس متوسط ​​حجم الحبيبات تقسيم حجم الحبيبات المدمجة إلى العدد الفعلي للحبيبات.
7. تصدير مجموعات البيانات المطلوبة لملفات اكسل وتحليل البيانات.

ونظرا لكفاءة ترنسفكأيشن منخفضة من إم سي إس، من غير المرجح أن يترك أثرا على قراءات من متوسط ​​إفراز قياس وسطاء جان الدراسات الذاتية التلاعب الجيني. ومع ذلك، من خلال إنشاء كامل شاركت في التعبير لمراسل الجين NPY-mRFP والبلازميد-transfected شارك في نفس الخلايا، رصد النتائج NPY-mRFP في رصد حصرا السكان الخلية التي تعبر عن الجينات في المصالح. ولذلك، فإن الاستفادة من هذا الاختبار بالمقارنة مع الطرق التقليدية هي القدرة على رصد انتقائي خلايا التلاعب بها وراثيا (الشكل 1).

في الواقع، وذلك باستخدام هذا الاختبار قمنا فحص الجينات التي تنظم الاتجار حويصلي بما في ذلك NSF للذوبان [N-ethylmaleimide حساسة الانصهار] البروتين مرفق مستقبلات (كمين) البروتينات و 44 من أفراد عائلة راب GTPases. حددنا الجينات التي تنظم SGsize، عدد، وتكوين البضائع وإيماس ^23.

Wحددت ه 30 Rabs التي غيرت (أي، وتمنع أو تحفيز) إيماس في خلايا RBL يحفزه إما حج أو عن طريق مزيج من الكالسيوم ²⁺ حامل الأيون واستر phorbol TPA (ايون / TPA) ^23. وكشف التصوير متحد البؤر الافخاخ وRabs التي تسببت الظواهر الدرامية تغيير مورفولوجيا الخلايا أو لجان الدراسات ^30،32. التصوير متحد البؤر من هذه البروتينات كشف 8 الافخاخ وRabs التي تسببت الظواهر الدرامية على الخلايا أو التشكل SG ^30،32. باستخدام هذا البروتوكول تمكنا من تتبع جان الدراسات الفردية وإجراء قياسات حجمها، وكثافة مضان، حركتهم وإيماس. على سبيل المثال، حددنا Rab5 كمنظم للSG نشوء حيوي ^30. تم التعرف Rab5 كمنظم سيد الإلتقام وendosomal الانصهار ^24. لقد أثبتنا أن شارك في التعبير عن (CN) المسوخ السلبية جوهري غير الساحلية الناتج المحلي الإجمالي من الأشكال الإسوية أعرب التطور الطبيعي للRab5 (Rab5A، Rab5B وRab5C)، أو البريدxpression من Rab5A / B / C استهداف shRNAs، خفضت بشكل ملحوظ حجم اس جي اس 'مع ما يصاحب ذلك زيادة في أعدادهم ^30. على العكس، تعبيرا عن غير الساحلية GTP، جوهري نشط (CA) Rab5A متحولة (Rab5A Q79L، هنا: "CA Rab5A")، والذي يعرف لتسهيل اندماج مثلي النمط من الإندوسومات في وقت مبكر (EES) ^24، أسفرت عن تشكيل عملاق الحويصلات زينت Rab5A، والتي حددنا اس جي اس على أساس مضمونها من البضائع إفرازية NPY-mRFP والسيروتونين، وقدرتها على exocytose بطريقة المنظم ^30.

يوضح الشكل 2 التحليلات المظهرية لجان الدراسات NPY-mRFP التي تحتوي على. بلغ حجم متوسط ​​في لجان الدراسات CA الخلايا، معربا عن Rab5A قيمة 44 ميكرون ^3، والتي كانت> 20 أضعاف أكبر من حجم متوسط ​​من لجان الدراسات في السيطرة خلايا بينما انخفض عددهم بنسبة 20 أضعاف، معربا عن GFP (الشكل 2A). العلاقة العكسيةبين عدد وحجم جان الدراسات (الشكل 2A) اقترح توسيع بوساطة Rab5 من لجان الدراسات ينطوي على الانصهار بهم مثلي النمط. العملاق NPY-mRFP تحتوي على لجان الدراسات التي شكلتها CA Rab5A يسمح التصوير المجهري متحد البؤر الخلايا الحية في قرار عالية التي تمكن من مراقبة لجان الدراسات في التفاصيل التي لا يمكن أن يكون ممكنا على خلاف ذلك. على سبيل المثال، اكتشفنا Rab5A في التفجير جان الدراسات جنبا إلى جنب مع الهياكل الصغيرة المتناثرة بين لجان الدراسات العملاقة، وعلى الأرجح الموافق الإندوسومات (الشكل 2B). بالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا أن Rab5 عابر ويفضل أن يكون الزميلة مع لجان الدراسات التي شكلت حديثا مما يشير إلى أن الجمعية انتقائية وعابرة للRab5A مع شكلت حديثا لجان الدراسات متوافق مع جهاز fusogenic التي فقط حبيبات ولدت حديثا لديها القدرة على دمج مع غيرها من لجان الدراسات ^30.

ويبين الشكل 3 الوقت الفاصل بين الصور التمثيلية للMC العملاقة لجان الدراسات التي تم تشكيلها من قبل التعبير عن CARab5A وحركية إيماس في القرار من SG احدة بعد التحفيز. خلال MC إيماس، اس جي اس التحرك نحو والصمامات مع غشاء البلازما. ونتيجة لذلك يتم الافراج عن البضائع إفرازية من الخلايا في الفضاء خارج الخلية. في هذا النظام التجريبي، يتم تحريرها NPY-mRFP من الخلايا وجدت في supernatants الخلايا. مضان من NPY-mRFP في supernatants خلية يمكن قياسها بواسطة قارئ مضان. ومع ذلك، لأن المخفف NPY-mRFP في supernatants لا يمكن الكشف عن إشارة مضان، أو تصور بواسطة المجهر مضان. الافراج عن NPY-mRFP من حبيبات خلال النتائج إيماس في الانخفاض السريع والكبير في NPY-mRFP كثافة مضان وانكماش NPY-mRFP التي تحتوي على لجان الدراسات وdisappearance.Therefore، وتصوير الخلايا الحية من خلايا حفز وقياسات NPY كثافة مضان -mRFP أو NPY-mRFP حجم تحتوي SG توفر تقييمات دقيقة للحركية إيماس منحبيبات الفردية. الشكل 3B يدل على شدة مضان من SGS بعد تحفيز الخلايا مع الكالسيوم ²⁺ حامل الأيون. لجان الدراسات تخضع إيماس في نقاط زمنية مختلفة (أي، 2، 3، 6، و 11 دقيقة التحفيز آخر)، في حين أن كثافة مضان من SG احدة التي لم تلتحم مع غشاء البلازما ثابتة.

وcotransfected توضيحات من الخطوات الرئيسية لبروتوكول RBL الخلايا مع NPY-mRFP والجين الثاني من الفائدة أو المقابلة السيطرة البلازميد والمصنف coverslips على الفور، 8-جيدا غرفة البورسليكات نظام ساترة أو لوحات 96-جيدا: الشكل 1. اليوم التالي، ويتم الحصول على صور من لجان الدراسات NPY-mRFP التي تحتوي في الراحة والخلايا الناجمة عن المجهري متحد البؤر (A). وبالإضافة إلى ذلك، إيماس من restinز وأدت cellsis كميا عن طريق قياس الإفراج عن NPY-mRFP في القارئ مضان 96 لوحة جيدا (B).

تم cotransfected الكمي لحجم اس جي اس "RBL الخلايا مع NPY-mRFP وإما GFP أو GFP-CA Rab5A والمصنف في 8-جيدا نظام ساترة غرفة البورسليكات: الرقم 2. بعد 24 ساعة، وضعت الغرفة 8 جيدا في المجهر متحد البؤر الليزر غرفة ساخنة مجهزة (37 ° C). تم القبض على الصور Z-كومة من الصور المتعاقبة مع شرائح بصرية 0.7 ميكرون باستخدام / 1.4 الهدف الفتحة العددية 63X النفط. تم deconvoluted الصور وشيدت ثلاث صور البعد من قبل البرنامج Imaris. تم حساب حجم جان الدراسات وعددهم باستخدام برنامج Imaris (A). جزء من granu NPY-mRFP التي تحتوي علىليه يبدو أن تكون جزءا لا يتجزأ ضمن Rab5A (السهام). البعض الآخر عاريا أو سدها مع Rab5A (السهام). شريط مقياس = 5 ميكرون (B). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم cotransfected قياس مدى وحركية إيماس في القرار من SG احدة في الخلايا activatedRBL RBL الخلايا مع NPY-mRFP وRab5A GFP-CA والمصنف غرفة البورسليكات نظام ساترة-in8 أيضا: الرقم 3. بعد 24 ساعة وقد وضعت غرفة in8 جيدا في المجهر متحد البؤر ليزر مجهزة غرفة ساخنة (37 ° C) وكانت أثارت الخلايا مع 10 ميكرومتر CA2 + حامل الأيون. تم الحصول على الصور كل 15 ثانية باستخدام / 1.4 الهدف الفتحة العددية 63X النفط. الصوركانت deconvoluted ومن ثم معالجتها بواسطة برنامج Imaris. شريط مقياس = 5 ميكرون (A). تم تحديد متوسط ​​كثافة مضان للmRFP NPY حبيبات تحتوي من قبل البرنامج Imaris وتم تطبيع البيانات وفقا لآخر 0 (وقت إضافة CA2 + حامل الأيون). الأسهم تمثل نقاط الوقت الذي الإفراج عن SGcargo wasnoted (B). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وصفنا استراتيجية مبتكرة تجمع بين الكمي لإم سي إس إيماس وأربعة (س، ص، ض، ر) quantifications البعد عن طريق ثلاثي الأبعاد التصوير ساقطا وقت جان الدراسات في الخلايا الحية باستخدام الجين مراسل إيماس. هذه التقنية تتيح فحص عائلات البروتينات من حيث أثرها على وظيفة MC مثل جان الدراسات المراقبة ابتداء وقت خروجهم من جولجي من خلال النضج، واكتساب الكفاءة إيماس وتحبب. مزيج من قياسات إيماس جنبا إلى جنب مع الأوصاف المظهرية والحركية للجان الدراسات ويوفر نظرة ثاقبة الآليات التي البروتينات اختبار توسط ظائف MC. ولذلك، باستخدام هذه المنهجية، والتلاعب الجيني للجينات المستهدفة يمكن أن يكشف الآليات الجزيئية الجديدة التي المتجر MC جان الدراسات والافراج عن حمولتها. والجدير بالذكر، أن NPY بمثابة مراسل إيماس في الخلايا الإفرازية أخرى مثل MCF-7 الخلايا، والاب خط الخلية المشتقةام لالثديية غدة غدية الإنسان ^31، والخلايا أليفة الكروم ³⁴ و β-خلايا البنكرياس ^35.

التلاعب الجيني هي أقوى الأدوات المتاحة حاليا للبحث شبكات وظيفية. التلاعب الجيني تسمح تحديد البروتينات الأساسية في كل شبكة، والتي سوف فرض انهيار النظام الحذف، خلافا لغيرها من البروتينات، التي سوف تنفذ الحديث المتبادل بين شبكات موازية أو ليس لها أي تأثير المقرر أن التكرار الحذف. ومع ذلك، ونظرا للكفاءة ترنسفكأيشن منخفضة من إم سي إس، عند قياس إيماس للوساطة الذاتية سوى جزء صغير من الخلايا وتعبر عن "التلاعب" DNA الاختبار. وبالتالي، عند قياس إيماس للوساطة الذاتية، ومساهمة من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى قراءات الإجمالية طفيفة. لذلك، في محاولة لتبني هذا النهج لاستكشاف الشبكات المعقدة المرتبطة إيماس المنظم في المعلقون كان هكتارmpered. هذه التقنية تتغلب على عقبة من انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن ويوفر وسيلة بسيطة لمراقبة التناوبات المظهرية من MC جان الدراسات التي تسببها على التعبير، ضربة قاضية والطفرات من الجينات في المصالح.

ويمكن تمديد هذه التقنية للتحقيق في التسلسل الهرمي وطريقة التفاعل الشبكات الوظيفية باستخدام عابرة الثلاثي ترنسفكأيشن. وسيتم تحليل النتائج لتحديد الجينات التي يمكن انقاذ النمط الظاهري معين. تسبب النمط الظاهري أكثر دراماتيكية أو لديك أي تأثير. وبناء على هذا transfections اندماجي، وشبكات إيماس يمكن بناؤها. على سبيل المثال، وذلك باستخدام الثلاثي ترنسفكأيشن تمكنا من التعرف على VAMP8 البروتين كمين كوسيط المصب في عملية تعتمد على Rab5 SG الانصهار ^25.

يسمح هذا الأسلوب التصور النوعي والكمي لإيماس في حل لجان الدراسات واحدة. وبالفعل تمكنا من إظهار أن لجان الدراسات الردود عرض التفاضلية لSTIMأولي. والسبب لماذا بعض لجان الدراسات تنصهر مع غشاء البلازما البعض الآخر لم يستطيع أو سبب حركية التفاضلية من MC SG الانصهار لا يزال يتعين تحديدها. الدراسات المستقبلية باستخدام هذا المنهج التجريبي لديها القدرة على الإجابة على هذه الأسئلة. على سبيل المثال، يجب أن القياس الكمي للالافخاخ مختلفة أو Rabs على الفردية جان الدراسات والعلاقة مع الكفاءة إيماس وحركية إيماس في القرار من SG احدة تكشف المنظمين رواية من إيماس.

القيد الرئيسي لهذه التقنية هو التلاعب الجيني لoverexpression من البروتين قد تؤثر على وظيفة الخلية أو شكلها. لذلك، فمن الضروري للتحقق من صحة النتائج مع نهج تكميلية. على سبيل المثال، عندما overexpression من متحولة نشط جوهري يمنع إيماس، وتأثير متحولة سلبي التأسيسي أو تدق إلى أسفل من الجين ينبغي اختبار أيضا.

باستخدام هذه التقنية، فإننا identifالمنظمين رواية العبوات الناسفة وظائف MC، والتي تؤثر MC إيماس أو تغيير التشكل SG. مزيج من القياسات إيماس جنبا إلى جنب مع توصيف لجان الدراسات المورفولوجية ويقدم رؤى أعمق وظيفة وآليات العمل من البروتينات التي تم اختبارها.

The authors have no financial conflicts of interest.

نشكر الدكتور U. عاشري لهدية من NPY-mRFP [كدنا]. نشكر الدكاترة. MJ Kofron، L. ميتلمان، M. Shaharbani، وY. زلبرشتاين للحصول على مساعدة لا تقدر بثمن مع المجهري وصورة ويحلل. كما نشكر الدكتور جوزيف أورلي لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم إسرائيل، التي تأسست من قبل الأكاديمية الوطنية الإسرائيلية للعلوم (1139-1112 إلى RS-E).