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Myography pressione è utilizzato per valutare vasoactivity di piccole arterie che si sviluppano costrizione sostenuta quando sotto pressione. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per valutare in segmenti isolati di piccole arterie mesenterici di ratto, vasoactivity e l'effetto della pressione intraluminale del diametro vascolare.
Le piccole arterie di resistenza restringono e si dilatano rispettivamente in risposta ad un aumento o diminuzione della pressione endoluminale; questo fenomeno noto come risposta miogenico è un regolatore chiave di flusso ematico locale. In condizioni isobariche piccole arterie di resistenza sviluppano sostenuti costrizione noto come tono miogenico (MT), che è un importante determinante di resistenze vascolari sistemiche (SVR). Quindi, ex vivo preparazioni pressione di piccole arterie di resistenza sono i principali strumenti per studiare la funzione microvascolare negli stati vicini-fisiologico. Per ottenere questo, un segmento intatto fresco isolato di una piccola arteria resistenza (diametro ~ 260 micron) è montata su due cannule piccolo vetro e pressurizzato. Queste preparazioni arteriose conservano più a caratteristiche vivo e la valutazione permesso del tono vascolare in tempo reale. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la valutazione vasoactivity in pressurizzati piccole arterie resistenza mesenterici di ratti; queste arterie sviluppanovasocostrizione sostenuta - circa il 25% del diametro massimo - quando sotto pressione a 70 mmHg. Queste preparazioni arteriose possono essere utilizzati per studiare l'effetto dei composti in fase di sperimentazione in relazione tra pressione intra-arteriosa e vasoactivity e determinare alterazioni della funzione microvascolare in modelli animali di varie malattie.
Arterie piccola resistenza sono i principali determinanti di SVR e svolgono un ruolo importante nella fisiopatologia di molte malattie 1,2. Condizioni come il diabete 3, la gravidanza 4, ischemia-riperfusione 5, obesità e ipertensione 6,7 sono spesso associati con la funzione microvascolare alterata. Myography vascolare può fornire non solo importanti conoscenze cambiamenti nella funzione microvascolare in varie malattie, ma anche aiutare a identificare target terapeutici e di valutare l'efficacia di composti vasoattivi. Funzione vascolare è stata studiata utilizzando isolate piccole arterie in condizioni di nave isometriche o isobariche 8. Descrizione dettagliata di myography isometrica è fornito altrove 9. Tuttavia ci sono differenze tra i dati ottenuti da isometrica contro preparazioni isobariche 10-12. Poiché preparazioni arteriosi pressurizzati permettono lo studio della funzione microvascolare in condizioni pressoché fisiologiche, larisultati ottenuti possono correlare meglio con il comportamento in vivo del letto vascolare 8,13.
Nel 1902 Bayliss descrisse per primo l'effetto della pressione transmurale del diametro vascolare 14. Si osserva in piccole arterie di resistenza di vari distretti vascolari di conigli, cani e gatti che una diminuzione della pressione è stata seguita da vasodilatazione, e un aumento della pressione è stata seguita da vasocostrizione. Questo fenomeno è noto come risposta miogenico. Bayliss e gli investigatori successivi hanno osservato che in condizioni isobariche arterie piccola resistenza sviluppano costrizione sostenuta chiamato MT 15,16. Sia risposta miogenica e MT possono essere valutati utilizzando myography pressione (PM) tecnica. PM viene utilizzato principalmente per determinare vasoactivity delle piccole arterie, vene e altre imbarcazioni. Oltre a valutare l'effetto dei composti vasoattivi sul diametro vascolare, PM - come indica il nome - viene utilizzato per valutare intravascolare ch-mediata pressioneanges del diametro vascolare. Nel corso degli ultimi decenni i progressi nel software per computer, che ha migliorato la microscopia video e pipetta di vetro tirando, hanno reso PM più facile da eseguire. Tuttavia, la dissezione di segmenti intatti vitali di piccoli vasi sanguigni rimane noiosa e talvolta impegnativo. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per studiare la risposta miogenico nelle piccole arterie di resistenza mesenteriche isolati da ratti.
Gli esempi qui riportati sono da esperimenti approvati dal IACUC presso la Georgia Regents University - Protocollo n: # 2011-0408
1. Preparazione dei reagenti
2. Preparazione di vetro cannule
3. Preparazione di perfusione Camera
4. Raccolta di mesenterica Arcade di ratti Sprague-Dawley
5. Isolamento e Incannulazione di 4 ° Ordine mesenterica
6. Misurazione del diametro arterioso
7. Risposta Miogenica
8. Interpretazione dei risultati e calcolo dei dati
Rappresentazione schematica di un miografo pressione tipico set-up è mostrata in Figura 1. Le due estremità del recipiente sono cannulati con una micropipetta di vetro e fissati con suture su entrambi i lati. Via tubo e un rubinetto aperto, una cannula viene collegato ad un regolatore di pressione servocomandato; l'altra cannula è collegata ad un rubinetto chiuso. La camera è perfuso con PSS e diametro vascolare cambiamenti sono osservati da un microscopio invertito collegato ad una telecamera CCD.
Il segmento arterioso pressurizzato a 70 mmHg è incubato in appena preparato caldo PSS, che scorre attraverso la camera arteriosa di 2-4 ml / min e aspirata. Diametro arterioso viene monitorato e registrato usando videomicroscopia e il rilevamento dei bordi software. Dopo circa 40 min, segmenti arteriosi restringono spontaneamente del 20-40% del loro diametro iniziale (Figura 2A). Nelle nostre mani arterie di resistenza piccolo ratto costrizione del 25-30% (media varies secondo le impostazioni, operatore, e bed arteriosa). Poi, la vitalità funzionale è valutata vasodilatatori e vasocostrittori risposte ACh (1 pM) e Phe (1 mM), rispettivamente (Figura 2A). Mentre possono essere utilizzati per altri vasodilatatori, ACh induce vasodilatazione endotelio-dipendente e, quindi, è utile per valutare sia endoteliale così come la vitalità della muscolatura liscia vascolare. Successivamente il segmento arterioso viene nuovamente incubato in PSS e una volta il diametro stabilizza, è pronto per l'esperimento. Al termine di ogni esperimento, segmenti arteriosi sono incubati in Ca 2+ libera PSS misurare PD (Figura 2B). I diametri registrate nella Figura 2A e 2B sono tabulati in Figura 2C. Absolute MT è la differenza tra PD e diametro stabile realizzato su vasocostrizione spontanea a 70 mmHg. Quindi, il MT osservata dal tracciato mostrato è 33% del PD. Come si vede qui, la risposta a ACh (1 micron) è ge nerally simile a quello osservato per Ca 2+ gratis PSS. Si noti che in esperimenti valutare vasodilatazione, previa aggiunta di un vasocostrittore può essere necessaria.
Per determinare la risposta miogenico, ratto segmenti arteriosi mesenterici sono sottoposti ad aumentare passi pressione intraluminale tra 20 e 100 mmHg. Un esempio è mostrato in Figura 3A. Le arterie possono raggiungere un diametro stabile dopo ogni passo (~ 5 min; linee tratteggiate). Successivamente, il segmento arterioso stesso è sottoposto a pressione in risposta Ca 2+ -free PSS con 0.39 mM EGTA e 0,1 mM SNP (Figura 3A). Il diametro raggiunto alla fine di ogni passo di pressione può essere visualizzata come un grafico lineare (Figura 3B). MT calcolato come la differenza percentuale di diametro per Ca 2+ -contenenti vs Ca 2+ -free PSS ad ogni pressione può essere visualizzato come linea o grafico a barre (Figura 3C).
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Figura 2: (A) Come indicato dal tracciato, diametro di arteriole mesenterici di ratti, quando pressurizzato a 70 mmHg, diminuisce spontaneamente. L'aggiunta di ACh (1 mM) ha aumentato il diametro (diametro quasi iniziale). L'aggiunta di Phe (1 micron) a bagno il tessuto riduce il diametro delle arterie. (B) L'incubazione in Ca2 + -free PSS aumenta il diametro delle arterie. (C) Il diametro di un segmento arterioso pressione singola in varie perfusates indicate in A e B è tabulato.
Figura 3: (A) Diametro arteriosa viene registrata in modo continuo mentre aumenta la pressione intraluminale incrementale in presenza di PSS e Ca 2+ -freePSS. (B) della curva linea di diametro arteriosa ottenuta al passo ogni pressione. (C) Diagramma della MT raggiunto ad ogni passo pressione. Clicca qui per ingrandire la figura .
Passaggi critici, risoluzione dei problemi e modifiche
In una preparazione tipica imbarcazione isobarica, l'arteria viene pressurizzato a 70 mmHg tra due cannule di vetro perfusi con acqua calda (37 ° C) PSS. Dopo 30-45 min, arterie sviluppano MT, caratterizzato dalla riduzione spontanea di diametro che stabilizza in 20-30 min. Le arterie di resistenza dai vari distretti vascolari sviluppano MT variabile. Per esempio resistenza ratto arterie mesenteriche sviluppano MT ~ 25% di PD, mentre le arterie cremastric possono raggiungere MT ~ 40% del PD. Le arterie che non sviluppano MT entro 60 min deve essere eliminata; tale durata può variare a seconda letto vascolare e specie. Le arterie con risposta inadeguata al PHE e ACh dovrebbero essere scartati.
pH e temperatura del PSS hanno un impatto significativo sullo sviluppo della MT. pH di PSS, che si trova per lunghi periodi senza aerazione, può aumentare. Inoltre, presso la sala arterie temperatura è improbabile che dEvelop MT. Quindi il PSS deve essere aerato appena possibile mediante la miscela gas indicato nella sezione del protocollo e della temperatura della camera di perfusione devono essere monitorati in continuo e mantenuta a ~ 37 ° C utilizzando un riscaldatore flusso.
Da questi esperimenti sono 3-5 ore di durata, camere di perfusione e tubazioni associate sono esposti a PSS per lunghi periodi; saline precipitati possono accumularsi sia nella camera e il tubo può interferire con i successivi esperimenti. Quindi è fondamentale per lavare accuratamente la camera di perfusione e risciacquare il tubo con acqua deionizzata dopo ogni esperimento. Allo stesso modo, la cura deve essere presa per pulire a fondo il piatto Sylgard rivestita usato per la dissezione con acqua deionizzata dopo ogni dissezione.
Limitazioni
Nonostante la sua importanza, PM ha diverse limitazioni. In primo luogo, il costo collettivo di procurarsi materiale PM è elevato (~ $ 22.000) e che può essere proibitivo per certo labs; un elenco dettagliato delle attrezzature è mostrato nella Tabella 3 Secondo, sono necessarie navi fresche per la maggior parte degli esperimenti.; quindi un nuovo animale è eutanasia per ogni esperimento, aggiungendo al costo complessivo. In terzo luogo, la dissezione delle piccole arterie mesenteriche è noioso e richiede altri strumenti quali microscopio dissezione e di microdissezione strumenti, che sono soggetti a danni. In quarto luogo, vi è una curva di apprendimento; guadagnando esperienza e stabilire PM in un laboratorio richiede personale dedicato, tempo e fatica.
Importanza rispetto ad altri metodi e applicazioni future
Protocolli sperimentali isobariche e isometriche sono due principali approcci utilizzati per determinare la reattività vascolare. Contrariamente ai preparati isobariche, vasoactivity in preparazioni isometrici è determinata misurando la tensione muscolare liscia vascolare utilizzando un sistema di fili miografo. Oltre alle differenze nelle attrezzature necessarie per questi due protocolli sperimentali agonist-icontrazione nduced è diverso tra questi approcci sperimentali in materia di magnitudo, tempo-corso e la direzione della tensione della parete vascolare 11,19. A causa delle convenienze tecniche e limitazioni, entrambe le preparazioni sono destinate ruoli importanti. Ad esempio, perché è più facile mantenere la concentrazione microscopica sulla preparazione isometrico, che sono spesso utilizzati per la misurazione simultanea di reattività vascolare e cambiamenti nella muscolatura liscia vascolare Ca 2+. D'altra parte, l'attività miogenica è meglio valutata in preparati in pressione che sono considerati per imitare stato fisiologico in vivo da vicino. Una rassegna dettagliata delle differenze tra queste preparazioni è fornito in precedenza 19.
In conclusione, myography pressione è una tecnica affidabile per studiare risposta miogenico in piccoli vasi di resistenza a condizioni quasi fisiologiche. Nonostante i suoi limiti, PM ha fornito un contributo significativo per la comprensione dei cambiamenti infunzione vascolare in condizioni normali e patologiche 3-7,20-23. Regolazione del tono vascolare sistemica è molto complesso e coinvolge fattori locali e neuro-ormonali quindi che isolano il ruolo dei meccanismi specifici che regolano il tono di posti letto vascolare in vivo è difficile. A questo proposito, ex vivo preparazioni arteriosi pressurizzati servono come ottimi surrogati. Chi è interessato ai meccanismi di trasduzione di MT e di risposta miogenica sono indicati precedentemente pubblicati ottime recensioni 15,19. In futuro potremmo vedere progressi nelle apparecchiature che integrano la valutazione della risposta miogenica e cambiamenti di messaggeri a valle, come Ca 2+ anche se è altamente improbabile che avremmo visto una riduzione dei costi delle attrezzature. Tuttavia, dato che questa tecnica viene adottata dagli scienziati con sfondo variegato, ci sarà probabilmente vedere la sua applicazione per valutare i cambiamenti nella funzione microvascolare in malattie diverse da ipertensione, diabete e shock come la cirrosi, dedemenza etc.
Gli autori non hanno conflitti finanziari.
Sandeep Khurana è supportato dal NIH (K08DKO81479). Vikrant Rachakonda è supportato da (T32DK067872).
Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Chemical | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MOPS | Sigma Aldrich | M5162 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Potassium chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium nitroprusside | Sigma Aldrich | 13451 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma Aldrich | S9638 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Table 2. Composition of Experimetnal solutions | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCD Monochrome Camera | The imaging Source | DMK 21AU04 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermistor | Warner Instruments | 64-0108 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dual automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Fluorescence System Interface | IonOptix | model FSI-700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Forceps and scissors | World Precision Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ion Wizard-Core and Analysis | IonOptix | Ion Wizard 6.0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Laboratory tubing | Silastic | 508-005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Male Sprague Dawley rat | Harlan Laboratories | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Master flex console drive | Cole-parmer | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Milli-Q Plus Ultrapure Water System | Millipore | ZD5211584 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ophthalmic monofilament nylon suture | Ethicon | 9007G | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Photometry and Dimensioning Microscope | Motic | AE31 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Stereomicroscope | Nikon Instruments Inc | SMZ660 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dissection dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW120-6 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Microforge | Stoelting | 51550 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 3. |
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