评估肌反应及血管活性阻力肠系膜动脉使用压力肌动描记

压力肌动描记用于评估小动脉的持续发展压力收缩时血管活性。这份手稿提供了一个详细的协议在小肠系膜动脉大鼠，血管活性和腔内压力对血管直径的影响隔离段评估。

阻力小动脉收缩，并分别以响应增加或减少腔内压力扩张;这种现象被称为肌源性反应是局部血流量的重要调节器。在等压条件下阻力小动脉持续养成收缩称为肌音（MT），这是全身血管阻力（SVR）的主要决定因素。因此，阻力小动脉体外加压制剂的主要工具来研究微血管功能在近生理状态。为了实现这一目标，一个小的阻力动脉（直径〜260微米）的新鲜分离的完好分段被安装到两个小玻璃套管并加压。这些动脉制剂保留大部分体内特性和血管张力的实时许可证评估。在这里，我们为评估在大鼠加压阻力小肠系膜动脉血管活性详细的协议;这些动脉开发持续的血管收缩 - 最大直径的约25％ - 当在70毫米汞柱压力。这些动脉制剂可用于研究研究化合物对动脉内压力和血管活性之间关系的影响，并确定在各种疾病的动物模型的改变微血管功能。

小阻力动脉是SVR的主要决定因素，并在许多疾病^1,2的病理生理学中发挥重要作用。条件如糖尿病^3，妊娠^4，缺血再灌注^5，肥胖和高血压^6,7-经常与改变微血管功能相关联。血管肌动描记不仅可以提供重要的见解在各种疾病中的变化微血管功能也有助于确定治疗目标和评估血管活性化合物的功效。血管的功能已经被使用等距或等压容器的条件下^，8孤立的小动脉的影响。等距肌动描记的详细描述在其他地方提供了^9。不过，也有来自等距获得与等压制剂^10-12数据的差异。因为加压动脉制剂允许微血管功能的研究在近生理条件下，该得到的结果可能会与相关的血管床^8,13 体内的行为更好。

1902年，拜里斯首次描述血管直径¹⁴透压力的影响。他观察到在从兔，猫，狗的各种血管床中压力的降低随后的血管舒张小阻力动脉，并增加了压力，随后由血管收缩。这种现象被称为肌应答。贝利斯和随后的调查发现，在等压条件下阻力小动脉持续发展的收缩称为MT ^15,16。既生肌响应和MT可以通过使用压力肌动描记（PM）的技术进行评估。 PM主要用于确定小动脉，静脉等血管血管活性。除了评估血管直径血管活性化合物的作用，PM - 顾名思义 - 用来评估血管内压力介导的CH安格斯对血管的直径。在过去的几十年中前进在计算机软件，这增强视频显微镜和玻璃吸管拉动，取得了下午更容易执行。然而，小血管存活完好分段解剖仍然繁琐，有时具有挑战性。在这里，我们勾勒出一个详细的协议，以研究在小肠系膜动脉阻力来自大鼠分离生肌响应。

这里显示的例子是来自佐治亚大学校务经IACUC实验 - 协议编号：＃2011-0408

1.准备试剂

1. 准备剥离液货：500毫升股票清扫液（5倍），溶解21.18克氯化钠，0.875克氯化钾，0.739克_硫酸镁 ，1.049克MOPS和450毫升的Milli-Q水0.019克EDTA。调节pH至7.3-7.4用1N NaOH洗涤。补足体积至500ml用Milli-Q水。原液可以存储多达7-10天。请参考表1化学品及其供应商的列表。 见表2;以毫米浓度。
2. 准备工作夹层解决方案：准备新的工作夹层解决方案的每一天。 100 ml工作溶液，溶解0.091克葡萄糖，0.016克的NaH ₂ PO ₄和0.022克丙酮酸钠在79.8毫升的Milli-Q水中。中加入0.2ml 1M _氯化钙和20毫升夹层解决方案的股票带来VOLU我到100毫升。
3. 制备生理盐溶液（PSS）：制备千毫升PSS，溶解0.365克氯化钾，6.545克氯化钠，0.296克_硫酸镁 ，0.163克KH ₂ PO _4，2.072克葡萄糖，2.184克_碳酸氢钠和2.383在950毫升ģHEPES的Milli-Q水。调节pH至7.3-7.4用1N NaOH洗涤。补足体积至1000毫升Milli-Q水。除去加入2ml溶液，并将其用2ml的1M的CaCl ₂代替。 （PSS鲜需要每天准备）
4. 准备钙（Ca ^2+）免费PSS：对于100mL来说PSS无^钙 ，溶解0.036克氯化钾，0.654克氯化钠，0.029克_硫酸镁 ，0.016克_{磷酸二氢钾} ，0.207克葡萄糖，0.218克_碳酸氢钠 ，0.238克HEPES，0.015克EGTA和0.0026克硝普钠（SNP）的95毫升Milli-Q水中。调节pH至7.3-7.4用1N NaOH洗涤。补足体积至100毫升用Milli-Q水。

2.制备玻璃插管

1. 拉玻璃吸管生成用吸管拉马按照生产商的指导100-150微米放倒插管。
2. 伞用微电极beveller玻璃套管末端，火擦亮他们用热探针由〜45°弯曲的玻璃套管末端。
3. 加载到插管微量座和附加的微支架上的灌注腔。

3.准备灌注腔

1. 冲洗灌注腔用Milli-Q水，然后用解剖溶液，每次5分钟。加载室用2ml解剖溶液。
2. 用10毫升注射器，并认真填写了整个套管和油管连接没有任何气泡通过插管吸解剖的解决方案。适用于吸轻轻地防止产生气泡。
3. 准备两缝线用半结利用每个钝钳。由于眼用单丝尼龙缝线（10-0，0.2公吨）用于制备只属于节直径1-2毫米，解剖显微镜，可能需要。
4. 解剖显微镜下可视化，用解剖钳来加载两个套管与局部封闭缝线结稍微远离尖。后来这些节将精心滑动到空心动脉末端和完全关闭。

从SD大鼠4.收集肠系膜动脉街机

1. 进行这些实验之前征得当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。房子的动物在控制温度和照明，并允许自由饮水和商业啮齿动物食物的动物设施中。
2. 通过腹膜内注射氯胺酮（80毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）麻醉大鼠。经确认脚趾捏，如果需要额外的管理麻醉深度麻醉。
3. 确认手术麻醉后，用断头安乐死的动物。遵循UTI AAALAC指引lizing适当的方法对动物实施安乐死。
4. 用剪刀解剖和镊子从骨盆到胸骨进行中线剖腹手术。这样做是在两个步骤：首先，切开皮肤和第二，切开下面的肌肉层。必须注意不要伤及腹内脏器。
5. 切肠接近幽门和所述远端靠近回肠盲肠结的近端。分别配合两端，防止食糜和粪便从而避免细胞外液沐浴污染的泄漏。切开肠系膜在馈送脉管即 ，肠系膜上动脉接近其底部和整个小肠肠系膜床转移到50ml烧杯含冰冷夹层溶液。
6. 允许收获的组织留在冰冷的夹层中5分钟，用新鲜的解剖溶液冲洗摆脱血液。

5.分离的^第 4 ^次插管订单肠系膜动脉

1. 牵制在右手侧以SYLGARD涂层盘肠的近端。延长剩余肠中逆时针路径，钉扎的段向下传播肠系膜和暴露的血管（ 图1）。注意：我们分离在室温下动脉段。否则，我们把这道菜含冰肠系膜商场。一些实验室，包括在我们的机构，用冷水机组解剖动脉在4℃。
2. 在立体声变焦显微镜解剖了3 ^次和4 ^阶小肠系膜动脉（〜260微米）平行于用小剪刀小肠。首先剖析了所有的覆盖脂肪。然后解剖出的静脉和隔离带V形分支点的动脉。要小心，不要刺破所选段。开始解剖脂肪附近²阶分支，找到办法3 ^次或4 ^次 ORD呃船只。
   1. 注意：动脉和静脉可以基于他们的壁厚来区分 - 动脉壁比静脉的厚。此外，当相邻的结缔组织轻轻拉动垂直于血管，静脉容易崩溃，而动脉没有。由于动脉管腔直径<400微米是全身血管阻力主要场所，对于这个协议，我们采用4 ^阶大鼠肠系膜动脉（管腔直径<300微米）。
3. 隔离动脉平行的4-5毫米部到小肠。想象所有的5 ^阶分支嵌入到小肠，切成稍微远离分支的起源和保存的部分。分支的这些保留的部分作为保持部位（与解剖钳）用于传送的动脉段到灌注室，并随后引导插管。
4. 然后通过切口2远端切断动脉段在动脉上的每一侧的5 ^阶分支并将其转移到灌注腔（ 见图1C和说明）。
5. 使用镊子剥离按住动脉段与解剖钳提示：（100-150微米直径）的玻璃微的一个导管插入血管的一端。以前加载的局部封闭缝合滑入空心端和固定。注意：在动脉的近端可以被插入套管上，其连接到伺服控制压力调节装置的原位环境模仿玻璃套管。
6. 附加一个夹层溶液内有10毫升注射器连接到这个套管，使得在连接所述插管和旋塞油管夹层溶液合并与该注射器中的活塞。轻轻抬起注射器。在溶液中的重力将去除帧内血管血液从容器的开口端。除去动脉血液后，关闭水龙头。
   注意：可替代地，附加的活栓到压力控制器，其打开和压力轻轻增加至5-10毫米汞柱，以达到相同的结果。
7. 通过仔细使其他套管尽可能接近到动脉段的解开端扎血管的远端上的第二玻璃套管。以前加载的局部封闭缝合滑入空心端和固定。必须注意不能拉拽或拉动脉段。确保连接到两个插管旋塞关闭。
8. 转让灌注腔倒置显微镜配备了实时视频录制的阶段。
9. 连接套管连接到动脉段的近端到一个伺服控制压力调节装置的活塞，并确保活塞附连到其它插管保持关闭，以维持稳定的管腔内的压力。
10. 接着，附着在真空管连接到抽吸口的次的灌注管向腔室的灌注端口。
    注：斜口针端口用于抽吸和钝针端口用于灌注。
11. 通过单列直插溶液加热器启动容器的灌注用温的PSS（37℃，平衡的气体混合物：5％的CO _{2，5％O 2}和90％的N以保持中性pH和充分氧合^17）以2毫升/分钟使用蠕动泵。打开真空上也是如此。放置一个热敏电阻在室内连续监测温度。
12. 由于PSS在炉膛内的温度接近〜37℃（通常在5分钟内），慢慢增加腔内的压力为20〜100毫米汞柱，并检查血管是否有泄漏。这是通过使用压力调节器的自动压力设置。丢弃船只泄漏并更换另一段。与泄漏的容器将不能够保持压力。
13. 评估动脉段弯曲，同时保持在100毫米汞柱的压力。使用螺丝杆，将套管挺起动脉段。不要过度拉伸动脉段;我们的目标是在体内动脉段长度来模仿。
14. 降低压力至70毫米汞柱（ 在在肠系膜拱廊¹⁸ 体内压力模仿），并允许在动脉段稳定和发展生肌基调。 （40-70毫米汞柱）根据实验策略和血管床的动脉可以可变加压。以前发布的审查提供可变性的极好审查MT来自不同血管床动脉⁸段。

6.测量动脉直径

1. 在配备有一个单色视频电荷耦合器件照相机的显微镜视图动脉在10X物镜。利用视频图像采集和实时边缘检测系统测量管腔直径。 表3中提供了使用的设备的列表。
2. 监视和记录器Ðiameter不断。
3. 为观察MT的发展。注意：我们观察到，在大鼠肠系膜动脉阻力，在70毫米汞柱，MT的发展的特征在于，约20％的减少的直径。 MT根据血管床和动物物种而异。
4. 确认通过评估血管收缩和血管舒张反应为1μM苯福林（苯丙氨酸）和1μM的乙酰胆碱（ACh）的血管的生存能力。
5. 在每个实验结束时，确定被动直径（PD），通过将动脉在无Ca ²⁺的PSS 20分钟。

7.生肌响应

1. 降低压力至20毫米汞柱，并允许直径稳定。增加在增量步骤（20，40，60，80和100）的管腔内的压力，并在各压力步允许动脉以实现稳定的直径（通常在5分钟内）。
2. 降低腔内压力到20毫米汞柱和孵化^2+的 PSS含0.39毫米的Ca动脉段EGTA和0.1mM的SNP。允许动脉直径稳定（通常为15分钟）。
3. 重复在含0.39毫EGTA和0.1mM的SNP的Ca ²⁺ -free PSS中的压力阶跃响应。

8.解释成果数据，并计算

1. 计算的MT与根据以下计算直径观察的Ca ²⁺的百分差值含与无Ca ²⁺的PSS在每个压力：
   
2. 对动脉进行血管舒缩直径可以通过平均平顶阶段1分钟计算。根据关系表示所收集的数据作为最大松弛（％PD）的百分比：％PD = 100×[ΔD/ PD]; ΔD是前和添加任何试验化合物（ 例如苯丙氨酸）的后直径之间的差异; PD为被动直径（也最大直径）。

一个典型的压力肌动描记设置示意图示于图1。将容器的两端插管用玻璃微并固定在两侧的缝合线。通过管道和开口旋塞，一个插管连接至伺服控制压力调节器;另一个套管连接到一个封闭的活栓。腔灌注有通过倒置显微镜相连的CCD摄像机观察PSS和血管直径的变化。

加压，在70毫米汞柱的动脉区段孵育在新鲜制备的温暖的PSS，流经动脉腔在2-4毫升/分钟，吸出。动脉直径被监视，并且用电视显微镜和边缘检测软件记录。 〜40分钟后，动脉段通过它们的起始直径（ 图2A）的20-40％收缩自发性。在我们手中的小老鼠阻力动脉收缩25-30％（平均瓦里ES根据设置，操作员和动脉床）。然后，功能性活力由血管舒张和血管收缩反应评定为乙酰胆碱（1μM）和苯丙氨酸（1μM），分别为（ 图2A）。尽管可以使用其他血管扩张剂，乙酰胆碱诱导的内皮依赖性血管舒张，因此是在评估两个内皮以及血管平滑肌存活率很有用。随后，动脉区段重新孵育PSS和一旦直径稳定，这是准备实验。在每个实验结束时，动脉段被孵育的Ca ²⁺游离的PSS测量PD的（ 图2B）。记录在图2A和2B的直径列于图2C。绝对MT为PD和稳定直径在70毫米汞柱实现在自发收缩之差。因此，从示出的跟踪观察在MT为PD的33％。因为在这里看到，响应胆碱（1μM）是GE nerally类似于所观察到的Ca ²⁺游离的PSS。需要注意的是在实验中评估血管舒张，事先加入一种血管收缩剂的可能需要。

为了确定生肌响应，大鼠肠系膜动脉段进行提高20和100毫米汞柱之间腔内压力的步骤。一个例子示于图3A。动脉被允许每一步（〜5分钟;虚线）后达到稳定的直径。接着，同一动脉段进行压力-响应于无Ca ²⁺的PSS与0.39毫EGTA和0.1mM的SNP（ 图3A）。实现在各压力步的末尾的直径可以被示出为线图（ 图3B）。 MT计算 对于钙直径的百分差值²⁺含 与无Ca ²⁺的PSS在每个压力可以示为线或棒图（ 图3C）。

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图2：（A）如该跟踪，从大鼠小肠系膜动脉的直径，当在70毫米汞柱压力，自发降低。加入ACh（1μM）的增加的直径（以接近起始直径）。此外苯丙氨酸（1μM）对组织浴减小动脉直径。 （ 二）在孵化的Ca ^2+的 PSS增加动脉直径。 （C）在A中所示和各种灌流液B中的单个加压动脉段的直径制表。

图3：（A）的动脉直径连续地记录，而在PSS的存在下和无Ca ²⁺增加腔内压力逐渐PSS。实现在各压力步动脉直径（B）的线曲线。 （ 三）律师MT的曲线在每一步的压力来实现。 点击这里查看大图 。

关键步骤，故障排除和修改

在典型的等压容器的准备，动脉被加压至灌注用温水（37℃）的PSS两个玻璃插管之间70毫米汞柱。后30-45分钟，动脉开发MT，其特征在于，稳定在20-30分钟的直径自发下降。从各种血管床的阻力动脉开发可变MT。例如大鼠阻力肠系膜动脉开发的MT〜PD的25％，而cremastric动脉可能实现的PD的MT〜40％。动脉没有在60分钟内开发MT应该被丢弃;这个持续时间可以根据血管床和物种不同而不同。动脉反应不足Phe和胆碱也应丢弃。

pH和PSS的温度对MT的发展一个显著影响。 pH值PSS，它坐落长时间没有通气，可能会增加。此外，在室温下动脉是不大可能至develop MT。因此PSS应该使用在灌注腔的协议部分和温度指示的气体混合物应持续进行监测，并使用一个流动加热器保持在〜37℃下尽快通气越好。

由于这些实验是3-5小时的持续时间，灌注腔室和相关的管道接触到的PSS长时间;盐沉淀物可以在两个腔室和管路可以与随后的实验干扰积聚。因此，它是非常重要的彻底清洗灌注腔并且每个实验后冲洗用去离子水的管路。同样，必须注意彻底清洁用于解剖用去离子水每次清扫后SYLGARD涂层盘。

限制

尽管它的重要性，拥有PM各种限制。首先，集体成本促使下午设备是高（〜22 000美元）和可能是过高的某些拉BS;设备的详细名单列于表3其次，需要用于大多数实验新鲜船只。因此一个新的动物被安乐死每个实验，加入到总成本。三，清扫小肠系膜动脉是乏味的，需要其他手段，如解剖镜下显微切割和工具，这是容易损坏。第四，有一个学习曲线;在获得专业知识和在实验室建立PM需要专门的人员，时间和精力。

相对于其它的方法和未来的应用意义

同量异序和等距实验方案是用于确定血管反应性两种主要方法。与此相反，以等压制剂，血管活性在等距制剂是通过测量血管平滑肌张力使用线肌动描记系统确定。除了需要为这两个实验方案在设备的差异，激动剂-i的EP3受体激动剂诱导收缩是这些实验方法的问候幅度，时间过程和血管壁张力^11,19的方向上有所不同。由于技术的便利和限制，既准备发球重要的作用。例如，因为它更容易保持微观焦点上等距制剂，它们经常用于血管反应性和变化的血管平滑肌的Ca ²⁺的同时测量。另一方面，生肌活性最佳评估被认为接近地模拟体内的生理状态的加压制剂。这些制剂之间的差异的详细审查先前^19条规定。

总之，压力肌动描记是一个可靠的技术，研究在接近生理条件的小阻力血管肌源性反应。尽管有其局限性，PM提供显著的贡献变化的理解血管功能在正常和病理条件下^3-7,20-23。系统性血管张力调节是非常复杂的，涉及本地和神经激素因素，因此分离的调节的血管床体内音调特定机制的作用是困难的。在这方面， 离体加压动脉制剂作为优异替代物。那些热衷于MT和肌源性反应的传导机制被称为此前公布的极高的评价^15,19。在将来，我们可能会看到整合生肌反应和变化，下游信使如Ca评估²⁺虽然这是极不可能的，我们会看到在设备成本的降低设备的进步。然而，由于这种技术采用由科学家具有不同的背景下，我们可能会看到其应用到评估比高血压，糖尿病和休克等疾病中的变化在微血管功能如肝硬化，德痴呆等。

作者没有任何经济利益冲突。

桑迪普库拉纳是由美国国立卫生研究院（K08DKO81479）的支持。维克兰特Rachakonda由（T32DK067872）的支持。