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Druck Myographie wird verwendet, um Vasoaktivität der kleinen Arterien, die anhaltende Verengung zu entwickeln, wenn unter Druck zu bewerten. Diese Handschrift ein detailliertes Protokoll, um in isolierten Segmenten der kleinen Mesenterialarterien von Ratten, Vasoaktivität und die Wirkung der intraluminale Druck auf die Gefäßdurchmesser zu bewerten.
Geringen Widerstand Arterien verengen und zu dilatieren bzw. in Reaktion auf erhöhte oder verringerte intraluminale Druck; Dieses Phänomen, das als myogene Reaktion bekannt ist ein Schlüsselregulator der lokalen Durchblutung. In isobar kleinen Widerstand Arterien anhaltend in Verengung als myogene Tonus (MT), die eine wichtige Determinante für den systemischen Gefäßwiderstand (SVR) ist bekannt. Daher ex vivo unter Druck stehende Präparate von kleinen Widerstand Arterien sind wichtige Werkzeuge, um mikrovaskulären Funktion in nahezu physiologische Zustände zu studieren. Um dies zu erreichen, wird eine frisch isolierte intakte Segment eines kleinen Widerstandsader (Durchmesser ~ 260 & mgr; m) auf beiden Glas Kanülen und unter Druck gelagert ist. Diese Arterienpräparate behalten die meisten in vivo Eigenschaften und Genehmigung Beurteilung der Gefäßtonus in Echtzeit. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Beurteilung Vasoaktivität in Druck kleiner Widerstand Mesenterialarterien von Ratten; diese Arterien entwickelnpermanente Vasokonstriktion - etwa 25% des maximalen Durchmessers - wenn sie bei 70 mm Hg Druck. Diese arterielle Zubereitungen können verwendet werden, um die Wirkung der Verbindungen auf die experimentellen Verhältnis zwischen intra-arteriellen Blutdruck und Vasoaktivität untersuchen und zu bestimmen, Änderungen der mikrovaskulären Funktion in Tiermodellen von verschiedenen Krankheiten.
Kleinen Widerstand Arterien sind entscheidend für SVR und spielen eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von vielen Krankheiten 1,2. Erkrankungen wie Diabetes 3, Schwangerschaft 4, Ischämie-Reperfusion 5, Fettleibigkeit und Bluthochdruck 6,7 werden häufig mit veränderten Mikrogefäßfunktion. Vascular Myographie können nicht nur wichtige Erkenntnisse über Änderungen der mikrovaskulären Funktion bei verschiedenen Krankheiten, sondern auch dazu beitragen, therapeutische Ziele und bewerten die Wirksamkeit von vasoaktiven Verbindungen. Kreislauf-Funktion wurde unter Verwendung von isolierten kleinen Arterien unter isometrischen oder isobaren Bedingungen Gefäß 8 untersucht. Detaillierte Beschreibung der isometrischen Myographie anderswo 9 vorgesehen. Jedoch gibt es Unterschiede in den Daten aus isometrischen gegen isobaren Präparationen 10-12 erhalten. Da unter Druck Arterienpräparate erlauben die Untersuchung der mikrovaskulären Funktion in nahezu physiologischen Bedingungen, diegewonnenen Erkenntnisse können besser mit In-vivo-Verhalten der Gefäßbett 8,13 korrelieren.
Im Jahr 1902 die Wirkung von transmuralen Druck zuerst beschrieben Bayliss auf Gefäßdurchmesser 14. Er beobachtete, in kleinen Widerstand Arterien von verschiedenen vaskulären Betten von Kaninchen, Katzen und Hunden, die eine Abnahme des Drucks wurde durch Vasodilatation gefolgt, und eine Zunahme der Druck wurde durch Vasokonstriktion gefolgt. Dieses Phänomen ist als myogenen Reaktion bekannt. Bayliss und nachfolgende Forscher festgestellt, dass in isobaren Bedingungen geringen Widerstand Arterien entwickeln nachhaltige Verengung als MT 15,16 bekannt. Sowohl myogenen Antwort und MT kann durch Verwendung von Druck Myographie (PM) -Verfahren bewertet. PM wird in erster Linie verwendet, um Vasoaktivität der kleinen Arterien, Venen und anderen Fahrzeugen zu bestimmen. Neben der Beurteilung der Wirkung von vasoaktiven Verbindungen auf Gefäßdurchmesser, PM - wie der Name sagt - wird verwendet, um intravaskuläre Druck-vermittelte ch bewertenanges auf Gefäßdurchmesser. In den letzten Jahrzehnten Fortschritte in der Computer-Software, die eine verbesserte Videomikroskopie und Glaspipette Ziehen, haben PM leichter durchzuführen hat. Jedoch bleibt Dissektion von lebensfähigem intaktem Segmente kleiner Blutgefäße mühsam und manchmal schwierig. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur myogenen Reaktion in kleinen mesenterialen Widerstandsarterien von Ratten isoliert studieren.
Die hier gezeigten Beispiele sind aus Experimenten von IACUC in Georgia Regents Universität zugelassen - Protokoll Nr: # 2011-0408
1. Vorbereitung der Reagenzien
2. Herstellung von Glas Kanülen
3. Herstellung der Perfusionskammer
4. Sammlung von Mesenterialarterie Arcade von Sprague-Dawley Ratten
5. Isolierung und Kanülierung von 4 th Sortieren Mesenterialarterie
6. Messung der Arteriendurchmesser
7. Myogenic Antwort
8. Interpretation der Ergebnisse und Berechnung von Daten
Schematische Darstellung eines typischen Druck Myographions Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Die beiden Enden des Schiffes sind mit einer Glasmikropipette kanüliert und mit Nähten auf beiden Seiten gesichert. Über eine Rohrleitung und einer offenen Absperrhahn wird eine Kanüle in eine servogesteuerte Druckregler verbunden ist; die andere Kanüle in einen geschlossenen Absperrhahn verbunden. Die Kammer ist mit PSS und Gefäßdurchmesser Änderungen werden durch ein umgekehrtes Mikroskop, um eine CCD-Kamera verbunden ist beobachtet perfundiert.
Die arterielle Segment bei 70 mmHg Druck in frisch hergestellten warmen PSS, die durch die arterielle Kammer bei 2-4 ml / min fließt und abgesaugt inkubiert. Arterielle Durchmesser wird überwacht und aufgezeichnet mit Videomikroskopie und Kantenerkennungssoftware. Nach ~ 40 min, verengen Arteriensegmente spontan von 20-40% ihrer Ausgangsdurchmesser (2A). In unseren Händen verengen kleine Ratte Widerstand Arterien um 25-30% (Durchschnitts varies gemäß den Einstellungen, Operator und arteriellen Bett). Dann wird Funktionsfähigkeit von gefäßerweiternden und vasokonstriktorische Reaktion auf ACh (1 uM) und Phe (1 uM), bzw. (2A) bestimmt. Während andere Vasodilatoren verwendet werden, ACh induziert endothelabhängige Vasodilatation und somit sind nützlich, um sowohl endotheliale als auch die glatte Gefäßmuskulatur Lebensfähigkeit. Anschließend wird der arterielle Segment in PSS wieder inkubiert und einmal der Durchmesser stabilisiert, bereit für Experiment ist es. Am Ende jedes Experiments sind arterielle Segmente in Ca 2+ frei PSS inkubiert PD (2B) zu messen. Die in 2A und 2B aufgezeichnet Durchmesser werden in 2C tabelliert. Absolute MT ist die Differenz zwischen PD und stabile Durchmesser bei einer spontanen Vasokonstriktion bei 70 mmHg erreicht. Daher ist die von der gezeigten Verfolgungs beobachtet MT 33% PD. Wie hier zu sehen ist, als Reaktion auf ACh (1 & mgr; M) ist ge nerally ähnlich dem für freie Ca 2+ PSS beobachtet. Man beachte, daß in Versuchen die Beurteilung Vasodilatation vor Zugabe eines Vasokonstriktors erforderlich sein.
Zu myogenen Antwort zu bestimmen, werden Ratten- mesenterialen arteriellen Segmente zur Erhöhung intraluminale Druck Stufen zwischen 20 und 100 mmHg unterworfen. Ein Beispiel ist in 3A gezeigt. Die Arterien sind erlaubt, um einen stabilen Durchmessers nach jedem Schritt (~ 5 min; gestrichelte Linien) zu erzielen. Anschließend wurde dieselbe arterielle Segment mit Druckantwort in Ca 2+ mit 0,39 mM EGTA und 0,1 mM SNP (3A) unterworfen -freien PSS. Die am Ende jeder Druckstufe erreicht Durchmesser kann als ein Liniendiagramm (3B) dargestellt werden. MT berechnet als die prozentuale Differenz im Durchmesser für Ca 2+ -enthaltenden vs. Ca 2+ -freien PSS bei jedem Druck kann als Linien- oder Balkendiagramm (3C) angezeigt.
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Abbildung 2: (A) Wie in der Ablaufverfolgung angezeigt, Durchmesser kleiner mesenterischen Arterien von Ratten, wenn sie bei 70 mm Hg Druck, nimmt spontan. Zugabe von ACh (1 uM) erhöhten Durchmessers (bis nahen Ausgangsdurchmesser). Zugabe von Phe (1 uM), um Gewebebad abnimmt Arteriendurchmessers. (B) Inkubation in Ca 2+ -freien PSS erhöht arteriellen Durchmessers. (C) Der Durchmesser eines einzelnen druckbeaufschlagten Arteriensegment in verschiedenen in A gezeigt perfusates und B aufgeführt.
Figur 3: (A) Arterielle Durchmesser kontinuierlich gleichzeitiger Erhöhung der intraluminale Druck inkrementell in Gegenwart von PSS und Ca 2+ -freiem zeichnetenPSS. (B) Kurve der arteriellen Durchmesser an der jeder Druckstufe erreicht. (C) Bar Graph der MT erreicht bei jeder Druckstufe. Klicken Sie hier, um größere Abbildung zu sehen .
Kritischen Schritte, Fehlersuche und Änderungen
In einem typischen isobaren Gefäß Vorbereitung wird die Arterie bei 70 mmHg zwischen zwei Glas Kanülen mit warmem (37 ° C) PSS perfundiert Druck gesetzt. Nach 30-45 min, Arterien entwickeln MT, gekennzeichnet durch spontane Abnahme des Durchmessers, die in 20-30 Minuten stabilisiert. Die Widerstandsarterien aus verschiedenen Gefäßbetten entwickeln variablen MT. Zum Beispiel Ratte Widerstand Mesenterialarterien entwickeln MT ~ 25% der PD, während cremastric Arterien MT ~ 40% der PD zu erreichen. Arterien, die MT nicht entwickeln innerhalb von 60 min zu verwerfen; diese Dauer kann je nach Gefäßbett und Arten variieren. Arterien mit unzureichendem Ansprechen auf Phe und ACh auch verworfen werden.
pH-Wert und Temperatur des PSS haben einen signifikanten Einfluss auf die Entwicklung der MT. pH-Wert der PSS, die über lange Zeiträume ohne Belüftung sitzt, kann sich erhöhen. Zusätzlich bei Raumtemperatur Arterien unwahrscheinlich develop MT. Daher der PSS sollte so schnell wie möglich unter Verwendung der im Protokollabschnitt und der Temperatur der Perfusionskammer angegebenen Gasgemisch ständig zu überwachen und bei ~ 37 ° C unter Verwendung eines Durchlauferhitzers aufrechterhalten werden belüftet werden.
Da diese Experimente sind 3-5 Stunden Dauer werden Perfusionskammern und die damit verbundenen Schlauch an PSS für längere Zeit ausgesetzt ist; Salz-Ausscheidungen können sowohl in der Kammer und Schläuche, die mit nachfolgenden Experimenten stören können zu bauen. Daher ist es wichtig, die Perfusionskammer gründlich waschen und spülen Sie den Schlauch mit entionisiertem Wasser nach jedem Experiment. Ebenso ist darauf zu gut säubern Sylgard-beschichtete Schale für die Präparation mit entionisiertem Wasser nach jeder Präparation verwendet werden.
Begrenztheit
Trotz ihrer Bedeutung hat PM verschiedenen Einschränkungen. Erstens, die kollektiven Kosten zu beschaffen PM Ausrüstung ist hoch (~ 22.000 $) und kann unerschwinglich für bestimmte la seinbs; Eine detaillierte Aufstellung der Geräte sind in Tabelle 3 dargestellt Zweitens werden neue Schiffe für die meisten Experimente nötig. somit ein neues Tier wird für jedes Experiment euthanasiert, was zu den Gesamtkosten. Drittens Dissektion der kleinen Mesenterialarterien ist mühsam und erfordert andere Instrumente wie Dissektionsmikroskop und Mikrodissektion Werkzeuge, die anfällig für Schäden sind. Viertens gibt es eine Lernkurve; Gewinnung Expertise in und Gründung PM in einem Labor erfordert engagiertes Personal, Zeit und Mühe.
Signifikanz in Bezug auf andere Verfahren und zukünftige Anwendungen
Isobar und isometrische experimentelle Protokolle sind zwei wichtige Ansätze verwendet werden, um vaskuläre Reaktivität zu bestimmen. Im Gegensatz zu den Isobaren Vorbereitungen wird Vasoaktivität in isometrische Vorbereitungen durch Messung der glatten Gefäßmuskelspannung mit einer Draht Myographions System bestimmt. Neben den Unterschieden in der Ausrüstung für diese zwei experimentellen Protokollen erforderlich, Agonist-induced Kontraktion unterscheidet sich unter diesen experimentellen Ansätzen in Bezug auf Größe, Zeitverlauf und die Richtung der Gefäßwandspannung 11,19. Aufgrund technischer Komfort und Grenzen, beide Präparate dienen eine wichtige Rolle. Zum Beispiel, weil es einfacher ist, mikroskopische Schwerpunkt isometrische Zubereitungen zu erhalten, werden sie häufig zur gleichzeitigen Messung der vaskulären Reaktivität und Veränderungen in der vaskulären glatten Muskulatur Ca 2+ eingesetzt. Andererseits wird myogene Aktivität am besten in Druckpräparate, die als in vivo physiologischen Zustand genau imitieren beurteilt. Eine detaillierte Übersicht über Unterschiede zwischen diesen Vorbereitungen wird zuvor 19 zur Verfügung gestellt.
Zusammenfassend ist Druck Myographie eine zuverlässige Technik zur myogenen Antwort in geringen Widerstandsgefäße bei nahezu physiologischen Bedingungen zu studieren. Trotz der Einschränkungen, hat PM bedeutende Beiträge zum Verständnis der Veränderungen in der vorgesehenenKreislauf-Funktion in normalen und pathologischen Bedingungen 3-7,20-23. Regulierung der systemischen Gefäßtonus ist sehr komplex und beinhaltet lokale und neuro-hormonelle Faktoren daher zu isolieren die Rolle der spezifischen Mechanismen der Ton der Gefäßbetten in vivo ist schwierig. In dieser Hinsicht ex vivo unter Druck arteriellen Präparate dienen als ausgezeichnete Surrogate. Wer sich für die Übertragungsmechanismen von MT und myogene Reaktion sind bisher veröffentlichten exzellenten Kritiken 15,19 bezeichnet. In der Zukunft können wir Fortschritte in der Ausrüstung, die Beurteilung der myogenen Reaktion und Veränderungen in der nachgeschalteten Botenstoffe, wie beispielsweise Ca 2+ zu integrieren, obwohl es sehr unwahrscheinlich ist, dass wir eine Reduzierung der Anlagenkosten zu sehen. Da diese Technik wird von Wissenschaftlern mit abwechslungsreichen Hintergrund angenommen, werden wir wahrscheinlich sehen ihre Anwendung auf Änderungen in der mikrovaskulären Funktion in Krankheiten außer Bluthochdruck, Diabetes und Schock wie Leberzirrhose, de bewertenDemenz usw.
Autoren haben keine finanziellen Konflikte.
Sandeep Khurana wird durch NIH (K08DKO81479) unterstützt. Vikrant Rachakonda durch (T32DK067872) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Chemical | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MOPS | Sigma Aldrich | M5162 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Potassium chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium nitroprusside | Sigma Aldrich | 13451 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma Aldrich | S9638 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Table 2. Composition of Experimetnal solutions | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCD Monochrome Camera | The imaging Source | DMK 21AU04 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermistor | Warner Instruments | 64-0108 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dual automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Fluorescence System Interface | IonOptix | model FSI-700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Forceps and scissors | World Precision Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ion Wizard-Core and Analysis | IonOptix | Ion Wizard 6.0 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Laboratory tubing | Silastic | 508-005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Male Sprague Dawley rat | Harlan Laboratories | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Master flex console drive | Cole-parmer | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Milli-Q Plus Ultrapure Water System | Millipore | ZD5211584 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ophthalmic monofilament nylon suture | Ethicon | 9007G | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Photometry and Dimensioning Microscope | Motic | AE31 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Stereomicroscope | Nikon Instruments Inc | SMZ660 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dissection dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW120-6 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Microforge | Stoelting | 51550 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 3. |
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