Aspetti tecnici della fistola aorto-cavale mouse

L'obiettivo è di produrre una fistola artero che è semplice e riproducibile. Questo metodo non fa uso di suture o adesivi colla. Pertanto i campioni possono essere utilizzati con la minor quantità di materiali estranei per l'analisi.

Sono discussi aspetti tecnici della creazione di una fistola artero nel topo. In anestesia generale, una incisione addominale è fatto, e l'aorta e vena cava inferiore (IVC) sono esposti. L'aorta sottorenale dell'aorta prossimale e distale sono sezionati per il posizionamento e serraggio dell'ago puntura, rispettivamente. Particolare attenzione è rivolta al fine di evitare la dissezione tra l'aorta e la vena cava inferiore. Dopo aver fissato l'aorta, un ago G 25 è usato per forare entrambe le pareti dell'aorta nella IVC. Il tessuto connettivo circostante è utilizzato per la compressione emostatica. Realizzazione dello AVF mostrerà pulsatile del flusso di sangue arterioso nella IVC. Ulteriore conferma di AVF successo può essere ottenuto postoperatoria ultrasuoni Doppler.

L'opzione più comune scelto per la terapia sostitutiva renale in pazienti con malattia renale allo stadio terminale è l'emodialisi. L'accesso per l'emodialisi viene eseguita da fistola artero-venosa (AVF), innesto arterovenose, o il posizionamento del catetere temporaneo. Sebbene AVF sono il modo preferito di accesso, AVF sono ancora ben lungi dall'essere perfetto. Un anno primari tassi di pervietà AVF sono solo il 60-65%, con molti fallimenti dovuti a iperplasia della neointima. La biologia molecolare e fisiologia della formazione AVF normale e formazione disadattivi rimangono poco caratterizzati. Come tale, è molto da guadagnare nel miglioramento dei risultati AVF con il guadagno di accompagnamento nella comprensione del regolamento di formazione di fistole. ^1-3

L'esposizione di una vena di flusso arterioso è comunemente studiata nel contesto di innesti di vena che sono modelli diretti di bypass chirurgico. ^{4, 5} Sebbene innesti di vena e AVF similmente espongono una vena di un ambiente arterioso, ci sono diversi di criticafferences tra di loro. Prima, la resistenza del letto deflusso distale è molto inferiore nel AVF, come AVF drena all'atrio destro mentre l'innesto venoso drena alle malate spesso piccole arterie distali, con conseguente aumento del flusso sanguigno e shear stress nel AVF. Secondo, il sangue nell'arto venoso del AVF può essere una miscela di sangue arterioso e venoso conseguente ossigenazione inferiore rispetto al contenuto puramente arteriosa nella innesto venoso. Terzo, la vena del AVF non viene rimosso dalla sua base, che porta alla conservazione del suo vaso venorum e innervazioni nervose, rispetto alla trasposizione completa dell'innesto vena nel letto arterioso. Infine, il numero di anastomosi è di solito in due innesti di vena mentre una AVF ha tipicamente una sola. In questo studio, si introduce un modello murino di fistola aorto-cavale che può essere utilizzato per lo studio di AVF.

1. Anestesia e pre-operatoria Procedure

1. Induzione dell'anestesia generale
   Approvazione da parte adeguata cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa si ottiene. Maschio topi C57/black, di 10 settimane, sono anestetizzati. Consegnare 4% isoflurano con 0,8 L / min di ossigeno per una scatola di plexiglas tramite un vaporizzatore isoflurano e posizionare il mouse all'interno. In alternativa, se preferito dal chirurgo, anestesia intraperitoneale può essere utilizzato.
2. Preservare l'anestesia
   Dopo la conferma di anestesia dalla mancanza di reazione alla punta pinch, il mouse viene messo sul tavolo operatorio in posizione supina con una maschera di silicone. Isoflurano è ridotta al 2% per mantenere adeguato il livello di anestesia.
3. Depilazione
   Capelli ventrale viene rimosso dal collo al basso addome usando un dispositivo di rimozione dei capelli. Rimozione dei capelli è preferito perché i capelli che viene lasciato utilizzando un rasoio può interferire con gli ultrasuoni Doppler.

2. Ultrasoun preoperatoriad

1. Obiettivi del ultrasuoni
   Ecografia doppler viene eseguita prima dell'intervento AVF modo da registrare le risultanze livello base che possono essere confrontati con i risultati post-operatori di vedere cambiamenti anatomici e fisiologici.
2. Punti di osservazione
   La vena giugulare, sovra-e infra-renale della vena cava inferiore (IVC) e aorta addominale vengono esaminati utilizzando sia Doppler impulso e B-mode.
3. Misurazioni
   Con la modalità B, diametro di ciascun vascolarizzazione viene misurato. Inoltre, massima velocità (velocità di picco sistolico in arterie) e le forme d'onda vengono registrate in tutti i punti di misurazione sopra descritti.

3. Procedure Operative

1. Topo Preparazione
   Preparare il sito di incisione con un antisettico topico e continuare una corretta tecnica asettica durante l'intervento tra cui l'uso di un telo chirurgico, guanti e strumenti sterili, ecc
2. Laparotomia
   Linea mediana incisione addominale è fatto from bordo inferiore del fegato a appena sopra il pube.
3. L'esposizione dell'aorta e IVC.
   Un divaricatore viene inserito e tutte le viscere sono tirati fuori dalla cavità addominale per il lato destro e mantenuto avvolto in una garza imbevuta con soluzione salina. Sezionare la membrana che collega il retroperitoneo e colon inferiore per ottenere pieno vista dell'aorta e IVC. Applicare una pressione sulla vescica, se si dilata e si mette in cammino.
4. Esposizione del sito di puntura
   Sito di puntura sarà tra la metà a tre quarti della distanza dalla vena renale sinistra a biforcazione aortica. (Figura 1) sezionare il margine sinistro dell'aorta modo che possa essere punta. Tenere presente che l'aorta è posizionata circa 45 gradi dietro la IVC e deve essere sezionato posteriormente oltre alla sinistra. (Figura 2) Il punto più importante di questa chirurgia non è di sezionare tra l'aorta e IVC. Tenere lontano da loro.
5. Esposizione del sito morsetto del aorta
   Sezionare l'aorta sottorenale dai tessuti circostanti. Fare attenzione a non ferire l'IVC sulle vene renale sinistra e di sinistra con i suoi affluenti di destra.
6. Bloccaggio della aorta
   Bloccare l'aorta prossimale mediante l'applicazione di clips di microchirurgia.
7. Rotazione della aorta
   Afferrando il tessuto connettivo circostante l'aorta, ruotare l'aorta in modo che la puntura può essere fatta dal lato leggermente dorsale dell'aorta (Figura 2).
8. Puntura dell'aorta attraverso di IVC
   Mantenendo l'aorta in una posizione ruotata, l'aorta mediante puntura di IVC utilizzando un ago G 25. (Figura 2) In caso di successo, l'ago può essere visto attraverso la sottile parete IVC.
9. Emostasi
   Tirando i tessuti retroperitoneali, compresi i muscoli, avvolgere il sito di puntura dell'aorta. Non comprimere l'aorta contro la IVC, poiché potrebbero ostruire il AVF (Figura 3).
10. De-bloccaggio dell'aorta
    Dopo la confermadella emostasi primaria, de-clamp dell'aorta. Sanguinamento supplementare può accadere ma può essere fermata con un'ulteriore compressione sopra descritto. Upon de-bloccaggio, sangue arterioso può essere visto scorre nel IVC anziché scuro flusso di sangue venoso.
11. Chiusura dell'addome
    Riportare le viscere nella sua posizione naturale e chiudere l'addome.

4. Procedure post-operatorie

1. Assistenza post-operatoria
   Dopo la chiusura dell'addome, isoflurano viene arrestato. Assistenza post-operatoria compresa l'analgesia e la cura delle ferite è applicata in conformità con le istruzioni raccomandate da Institutional Animal Care e del Comitato Usa. Per l'analgesia usiamo buprenorfina a 0.1 mg / kg intrasmuscularly ogni 12 ore per 24 ore seguendo le procedure chirurgiche.
2. Ecografia post-operatorio
   Il primo giorno dopo l'operazione, Doppler è effettuata per confermare l'AVF. Inoltre, altre variabili sono misurate per controllare i cambiamenti dal pre-operatoriavalori.

Dopo la pratica, la sopravvivenza nel primo giorno post-operatorio è tipicamente superiore al 95%; al giorno post-operatorio 7, sopravvivenza era del 91,3% figure 1 e 2 mostrano il sito di puntura ideale in vista coronale e trasversale;. Posizionamento della puntura sito è fondamentale per ottenere una buona sopravvivenza senza eccessiva emorragia. Morti intra-operatorie e le morti precoci post-operatorie sono in genere a causa di emorragia. Ciò tende a verificarsi con eccessiva dissezione tra l'aorta e l'IVC, o dalla pressione emostatico inadeguato. Figura 3 mostra una schematica dell'importanza di avvolgere il sito di puntura con il tessuto connettivo prima di applicare pressione per l'emostasi, consentendo una buona emostasi senza compressione del AVF. Nella nostra esperienza, tutto AVF tecnicamente riuscita può essere confermata con ecografia entro il terzo giorno, una volta che l'AVF è confermato su due piani di essere presente, l'AVF di solito è stabile almeno fino al giorno 28 Figura 4.mostra tipici ecografia Doppler in formazione AVF successo. Variazioni di forme d'onda sono state osservate a livello della AVF in IVC e verso il cuore. Il tasso di conferma AVF generale il giorno 3 post-operatorio è stato del 71,4%.

Figura 1. Diagramma che mostra il sito di puntura. L'puntura ideale è tra la metà a tre quarti della distanza tra la vena renale sinistra e iliaca biforcazione. IVC: vena cava inferiore.

Figura 2. Schema in sezione del sito di formazione AVF. La freccia nera indica il sito e Direttisu di dissezione per esporre l'aorta. La freccia blu indica il sito di puntura e la direzione.

Figura 3. Diagramma che mostra il metodo per l'emostasi fila superiore:. Avvolgendo l'aorta con tessuti connettivi e dei muscoli. Riga inferiore: applicando una pressione diretta. Le probabilità di chiusura AVF sono alti con compressione diretta.

Figura 4. Ecografia dopo l'intervento chirurgico. L'AVF AVF è stato esaminato con gli ultrasuoni ad alta risoluzione post-operatorio. Forme d'onda al di sotto della AVF erano forme d'onda tipica venosa, mentre al di sopra della AVF e le forme d'onda mostrato sovrapposizione di flusso arterioso che non era presente sotto del AVF. Clicca qui per ingrandire la figura.

Ci sono diversi rapporti che sono descritti AVF nei ratti, tra AVF femorale, ^{6, 7} carotidea a giugulare AVF ⁸ e aorto-cavale AVF. ^{9, 10} Il ratto è diverse volte più grande di quello del mouse, permettendo facile chirurgia nel ratto rispetto a il mouse. Tuttavia, al fine di usufruire di topo ceppi genetici e varianti la procedura deve essere estesa per includere modelli di mouse. Diversi rapporti precedentemente pubblicati introdotto il modello AVF nei topi, ma questi rapporti sono stati generalmente nel contesto dello sviluppo di un modello per l'insufficienza cardiaca destra, usando aghi di dimensioni più grandi ^11-13 Guzman ha riportato una tecnica simile alla nostra,. Tuttavia in tale relazione gli autori hanno utilizzato punti di sutura per chiudere la arteriotomia. ¹³ Non usiamo suture per evitare possibili interferenze con la successiva estrazione di proteine ​​e RNA per l'analisi molecolare. Inoltre chiudendo il arteriotomia con suture comporta un rischio di applicare un'eccessivatensione sulla fistola che possono portare a sanguinamento acuto o ritardo. In altre relazioni, AVF sono stati creati tra le vene giugulari carotidee e utilizzando il metodo bracciale. ¹⁴ In questo studio descriviamo un metodo semplice e riproducibile che può essere utilizzata negli studi di AVF sé che non dipendono da un polsino peri-anastomotica .

Creiamo un AVF bucando il mouse aorta infra-renale con un ago G 25 ed estendendo la puntura attraverso la parete laterale aortica nella infra-renale della vena cava. Durante lo sviluppo della nostra attuale metodologia, abbiamo notato alcuni punti tecnici cruciali per migliorare il successo tecnico e la coerenza della procedura:

1. Il sito di puntura della aorta è posto su distale dell'aorta addominale. Come mostrato in figura 1, la porzione prossimale dell'aorta sottorenale non è posizionato a fianco della IVC, e non vi è più tessuto connettivo tra queste due navi che inibisce la stabilizzazione della AVF,che porta a emorragie e bassa pervietà.
2. Non ci sono morsetti necessari distalmente oltre il punto di foratura sul aorta. Prossimale bloccaggio è sufficiente a minimizzare la pressione del sangue durante la procedura. Inoltre, morsetti distali interferirebbero con perforando l'aorta.
3. Come mostrato in figura 2, la direzione più efficiente e fisiologica per forare attraverso la IVC è da sinistra a destra posteriore ventrale. Non fare ciò può portare a dimensione più piccola fistola che porta alla lenta maturazione precoce o occlusione. Pertanto preferiamo sezionare la porzione esterna posteriore dell'aorta e di ruotare l'aorta leggermente verso destra in modo da ottenere vista diretta del sito di puntura.
4. Per l'emostasi, il foro di entrata aortica viene riparato solo con compressione utilizzando i tessuti circostanti, e non richiede suture riparazione degli arteriotomia o qualsiasi colla adesiva. Sutura può tirare l'aorta dal IVC, che può portare alla occlusione della AVF. Colla maggiodare rinforzo per emostasi, ma può anche interferire durante ecografia Doppler oltre a rendere estrazione tissutale post-operatorio difficile. Per quanto riguarda la compressione, non applichiamo pressione diretta sul sito di puntura verso la IVC perché può anche comprimere la fistola pure. Come descritto sopra e mostrato in Figura 3, ci avvolgono l'aorta con i tessuti connettivi e muscoli circostanti.

Un potenziale limite di questo studio è che questo modello è realizzato tra aorta e IVC, grandi vasi nel piccolo topo. Non è chiaro se questo modello simula l'AVF come usato nella cura clinica dei pazienti umani, cioè AVF fatta in piccole arterie periferiche. Inoltre, gli animali di controllo per esperimenti devono essere eseguiti con attenzione, e dipendono dal protocollo sperimentale. Usiamo tipicamente operazioni fittizie per i controlli, in cui svolgiamo la chiusura laparotomia e immediato in anestesia generale, senza alcuna puncture affatto.

Descriviamo un protocollo corto in cui l'operatore può eseguire AVF nei topi, entro 15-20 min. Prevediamo che questo modello possa essere utile per gli studi di fistola adattamento che possono essere utili per i pazienti umani con malattia renale allo stadio terminale, soprattutto se utilizzato in combinazione con i modelli murini di malattia.

Nessuna.

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institute of Health sovvenzione R01-HL095498, nonché con le risorse e l'uso delle strutture del VA Connecticut Healthcare System di West Haven, CT.