Aspects techniques de la fistule aorto-cave de la souris

L'objectif est de produire une fistule artério-veineuse qui est simple et reproductible. Cette méthode n'utilise pas de sutures adhésives ou de la colle. Par conséquent, les échantillons peuvent être utilisés avec la moindre quantité de matériaux étrangers à l'analyse.

Les aspects techniques de la création d'une fistule artério-veineuse chez la souris sont discutées. Sous anesthésie générale, une incision abdominale est faite, et l'aorte et la veine cave inférieure (VCI) sont exposés. L'aorte sous-rénale proximale et distale de l'aorte sont disséqués pour le placement de serrage et ponction à l'aiguille, respectivement. Une attention particulière est accordée à éviter la dissection entre l'aorte et la veine cave inférieure. Après serrage de l'aorte, une aiguille 25 est utilisé pour perforer les deux parois de l'aorte dans la veine cave inférieure. Le tissu conjonctif environnant est utilisée pour la compression hémostatique. La mise sur pied de l'AVF montrera le flux sanguin artériel pulsatile dans la VCI. Une autre confirmation de AVF succès peut être atteint en post-opératoire échographie Doppler.

L'option la plus commune choisie pour la thérapie de remplacement rénal chez les patients atteints d'insuffisance rénale au stade ultime est l'hémodialyse. Accès pour hémodialyse est effectuée par une fistule artério-veineuse (FAV), greffe artérioveineuse ou d'un cathéter temporaire. Bien AVF sont le mode d'accès privilégié, AVF sont encore loin d'être parfait. Les taux de perméabilité primaire AVF d'un an ne sont que 60-65%, avec de nombreux échecs dus à l'hyperplasie intimale. La biologie moléculaire et la physiologie de la formation des AVF normale et la formation inadaptée restent mal caractérisés. En tant que tel, il ya beaucoup à gagner à l'amélioration des résultats AVF avec le gain d'accompagnement dans la compréhension de la régulation de la formation de la fistule. ^1-3

L'exposition d'une veine de flux artériel est couramment étudiée dans le contexte des greffes de veine qui sont des modèles directs de pontage chirurgical. ^{4, 5} Bien que des greffons veineux et AVF exposent une veine similaire à un environnement artérielle, il ya plusieurs di critiquefferences entre eux. Tout d'abord, la résistance du lit de ruissellement distale est beaucoup plus faible dans les AVF, comme l'AVF draine vers l'oreillette droite alors que la greffe de veine draine les petites artères distales souvent malades, ce qui augmente le flux sanguin et la contrainte de cisaillement dans l'AVF. D'autre part, le sang dans le membre veineux de la FAV peut être un mélange de sang veineux et artériel conduisant à une oxygénation plus faible par rapport à la teneur purement artérielle dans la greffe de veine. Troisièmement, la veine de l'AVF n'est pas sorti de son lit, ce qui conduit à la préservation de son vaso venorum et innervation nerveux, par rapport à la transposition complète de la greffe de veine dans le lit artériel. Enfin, le nombre d'anastomoses est habituellement de deux à greffons veineux tandis qu'une AVF a généralement qu'une seule. Dans cette étude, nous présentons un modèle murin de la fistule aorto-cave qui peut être utilisé pour l'étude de l'AVF.

1. Procédures d'anesthésie et pré-opératoire

1. Induction de l'anesthésie générale
   Approbation par l'Institutional Animal Care appropriée et le Comité d'utilisation est obtenue. Souris C57/black hommes, âgés de 10 semaines sont anesthésiés. Livrer 4% d'isoflurane à 0,8 L / min d'oxygène à une boîte en plexiglas via un vaporisateur isoflurane et placez la souris à l'intérieur. Alternativement, si l'on préfère par le chirurgien, anesthésie intrapéritonéale peut être utilisé.
2. Préserver l'anesthésie
   Après confirmation de l'anesthésie par le manque de réaction de pincement de l'orteil, la souris est placé sur la table d'opération en décubitus dorsal avec un masque de silicone. L'isoflurane est réduite à 2% pour maintenir le niveau d'anesthésie appropriée.
3. Épilation
   Cheveux ventrale est enlevé de la nuque au bas de l'abdomen en utilisant un épilateur. solvant de cheveux est préférable parce que les cheveux qui est laissé à l'aide d'un rasoir peut interférer avec l'échographie Doppler.

2. Ultrason préopératoired

1. Objectifs de l'échographie
   Échographie Doppler est effectué avant la chirurgie AVF afin d'enregistrer les résultats de niveau de base qui peuvent être comparés avec les résultats post-opératoires à voir des changements anatomiques et physiologiques.
2. Points d'observation
   La veine jugulaire, supra et infra-rénale veine cave inférieure (VCI), et de l'aorte abdominale sont examinés en utilisant deux impulsions Doppler et B-mode.
3. Mesures
   En utilisant le mode B, le diamètre de chaque système vasculaire est mesurée. En outre, la vitesse maximale (pic de vélocité systolique dans les artères) et des formes d'onde sont enregistrées dans chacun des points de mesure décrits ci-dessus.

3. Procédures opérationnelles

1. Préparation de la souris
   Préparez le site d'incision avec un antiseptique topique et continuer technique aseptique appropriée au cours de la chirurgie, y compris l'aide d'un drap chirurgical, gants et des instruments stériles, etc
2. Laparotomie
   Incision abdominale médiane est faite fROM bord inférieur du foie à juste au-dessus du pubis.
3. L'exposition de l'aorte et IVC.
   Un enrouleur est insérée et toutes les entrailles sont tirés hors de la cavité abdominale pour le côté droit et maintenu enveloppé dans de la gaze imbibée de sérum physiologique. Disséquer la membrane qui relie le rétropéritoine et inférieure du côlon pour obtenir la vue de l'aorte et IVC. Appliquer une pression sur la vessie si elle est dilatée et se met en route.
4. L'exposition du point de ponction
   site de ponction sera entre demi à trois quarts de la distance de la veine rénale gauche à la bifurcation aortique. (Figure 1) disséquer la marge gauche de l'aorte de sorte qu'il peut être perforé. Gardez à l'esprit que l'aorte est positionné sur 45 degrés derrière la VCI et il doit être disséqué arrière en plus vers la gauche. (Figure 2) Le point le plus important de cette chirurgie n'est pas à disséquer entre l'aorte et l'IVC. Gardez loin d'eux.
5. Exposition du site de fixation de l'AORTA
   Disséquer l'aorte sous-rénale à partir des tissus environnants. Attention à ne pas blesser l'IVC sur les veines rénales droite et gauche avec ses affluents sur la droite.
6. Serrage de l'aorte
   Fixer l'aorte proximale en appliquant clips de microchirurgie.
7. Rotation de l'aorte
   En saisissant le tissu conjonctif qui entoure l'aorte, l'aorte tourner de sorte que la perforation peut se faire d'un côté légèrement dorsale de l'aorte (figure 2).
8. Ponction de l'aorte à travers IVC
   Garder l'aorte dans une position de rotation, à la perforation de l'aorte par le biais d'IVC en utilisant une aiguille de calibre 25. (Figure 2) En cas de réussite, l'aiguille peut être vu à travers la paroi mince IVC.
9. Hémostase
   En tirant les tissus rétropéritonéaux, y compris les muscles, enveloppez le site de ponction de l'aorte. Ne pas comprimer l'aorte contre l'IVC, car il peut coaguler l'AVF (Figure 3).
10. De-serrage de l'aorte
    Après confirmationde l'hémostase primaire, de-serrer l'aorte. Saignement supplémentaire peut se produire, mais il peut être arrêté avec une compression supplémentaire décrit ci-dessus. Lors de-serrage, le sang artériel est visible circulant dans la veine cave inférieure à la place de l'écoulement de sang veineux foncé.
11. Clôture de l'abdomen
    Retourner les entrailles dans sa position naturelle et fermer l'abdomen.

4. Procédures post-opératoires

1. Les soins post-opératoires
   Après fermeture de l'abdomen, de l'isoflurane est arrêté. Les soins post-opératoires, notamment l'analgésie et le soin des plaies est appliquée en conformité avec les instructions recommandées par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation. Pour l'analgésie, nous utilisons la buprénorphine à 0,1 mg / kg toutes les intrasmuscularly h 12 à 24 h suivant les procédures chirurgicales.
2. Échographie post-opératoire
   Le premier jour après l'opération, l'échographie Doppler est effectuée pour confirmer l'AVF. En outre, d'autres variables sont mesurées pour vérifier les changements de pré-opératoirevaleurs.

Après la pratique, la survie, le premier jour post-opératoire est généralement supérieur à 95%; au jour post-opératoire 7, la survie était de 91,3% figures 1 et 2 montrent le site de ponction idéal en vue coronale et transversale;. Placement de la ponction site est essentiel pour obtenir une bonne survie sans hémorragie excessive. Décès intra-opératoires et les décès post-opératoires précoces sont généralement dues à une hémorragie. Ceci tend à se produire avec dissection excessive entre l'aorte et la veine cave inférieure, ou de la pression hémostatique insuffisante. Figure 3 montre un schéma de l'importance de l'emballage du site de ponction avec le tissu conjonctif avant d'appliquer la pression pour l'hémostase, permettant une bonne hémostase sans compression de l' AVF. Dans notre expérience, tout AVF techniquement réussie peut être confirmé par échographie au troisième jour, une fois l'AVF est confirmé duplex d'être présent, l'AVF sera généralement stable au moins jusqu'à ce jour 28 Figure 4.montre les résultats de l'échographie Doppler typiques dans la formation des AVF succès. Les variations de formes d'onde ont été observées au niveau de l'AVF dans IVC et vers le cœur. Le taux de confirmation des AVF global sur jour post-opératoire était de 71,4% 3.

Figure 1. Diagramme montrant le site de ponction. Le site de ponction idéale se situe entre demi à trois quarts de la distance entre la veine rénale gauche et bifurcation iliaque. IVC: veine cave inférieure.

Figure 2. Section schéma Croix du site de formation AVF. La flèche noire indique le site et de directivessur la dissection pour exposer l'aorte. La flèche bleue indique le site et direction perforation.

Figure 3. Schéma montrant la méthode pour l'hémostase Rangée du haut:. Envelopper l'aorte avec les tissus et les muscles conjonctifs. Rangée du bas: appliquer une pression directe. Les chances de fermeture AVF sont élevés avec compression directe.

Figure 4. Résultats échographiques après la chirurgie. AVF L'AVF a été examinée par ultrasons à haute résolution en post-opératoire. Formes d'onde en dessous de la AVF étaient des formes d'onde typique veineuse, alors qu'au-delà de l'AVF les courbes montrent la superposition du flux artériel qui n'était pas présente ci-dessous la FAV. Cliquez ici pour agrandir la figure.

Il ya plusieurs rapports qui ont décrit AVF chez les rats, y compris AVF ^{fémorale, 6, 7} carotide à jugulaire AVF ⁸ et aorto-cave AVF. ^{9, 10} Le rat est plusieurs fois plus grande que la souris, permettant de faciliter la chirurgie chez le rat par rapport à la souris. Néanmoins, afin de profiter des souches et des variantes génétiques de souris la procédure doit être étendue pour inclure des modèles de souris. Plusieurs rapports publiés précédemment introduit le modèle AVF chez la souris, mais en général, ces rapports ont été dans le cadre du développement d'un modèle d'insuffisance cardiaque droite, en utilisant des aiguilles de grande taille ^11-13 Guzman a rapporté une technique similaire à la nôtre;. Toutefois en ce rapport les auteurs ont utilisé des sutures pour fermer la arteriotomy. ¹³ Nous n'utilisons pas de sutures pour éviter des interférences possibles avec extraction ultérieure des protéines et de l'ARN pour l'analyse moléculaire. En outre la fermeture de la arteriotomy avec sutures comporte un risque d'application excessivetension sur la fistule qui peuvent conduire à une hémorragie aiguë ou tardive. Dans d'autres rapports, AVF ont été créés entre les veines jugulaires et carotides en utilisant la méthode brassard. ¹⁴ Dans cette étude, nous décrivons une méthode simple et reproductible qui peut être utilisée dans les études d'AVF lui-même qui ne dépend pas d'une manchette péri-anastomotique .

On crée une FAV en perforant l'aorte sous-rénale souris avec une aiguille de calibre 25 et de l'extension de la perforation à travers la paroi latérale de l'aorte dans l'infra-rénale veine cave. Au cours du développement de notre méthodologie actuelle, nous avons remarqué quelques points techniques essentiels pour améliorer la réussite technique et la cohérence de la procédure:

1. Le point de ponction de l'aorte est placé sur l'aorte abdominale distale. Comme le montre la figure 1, la partie proximale de l'aorte sous-rénale n'est pas positionné à côté de l'IVC, et il ya plus de tissus conjonctifs entre ces deux vaisseaux qui inhibe la stabilisation de l'AVF,conduisant à un saignement et une faible perméabilité.
2. Aucun pinces sont nécessaires distale au-delà du point de ponction sur l'aorte. Proximale de serrage est suffisant pour réduire la pression artérielle au cours de la procédure. En outre, pinces distales nuiraient à la perforation de l'aorte.
3. Comme le montre la figure 2, la direction la plus efficace et physiologique à la perforation grâce à la VCI est de l'arrière gauche à droite ventral. Sinon, cela peut conduire à une réduction de la taille de la fistule qui mène à maturation lente ou occlusion précoce. Par conséquent, nous préférons disséquer la partie postérieure externe de l'aorte et de tourner l'aorte légèrement vers la droite de manière à obtenir une vue directe sur le site de ponction.
4. Pour l'hémostase, le trou d'entrée aortique est réparé seulement avec compression en utilisant les tissus environnants, et ne nécessite pas de réparation de suture de la arteriotomy ou de la colle adhésive. Suture peut tirer de l'aorte loin de l'IVC, ce qui peut conduire à une occlusion de l'AVF. Colle peutfaire du renforcement de l'hémostase, mais il peut également interférer lors de l'examen échographique Doppler ainsi que de faire l'extraction de tissus post-opératoire difficile. Quant à la compression, nous n'avons pas appliquer une pression directe sur le site de ponction à l'IVC, car il peut aussi compresser la fistule ainsi. Comme décrit ci-dessus et illustré à la figure 3, nous terminerons l'aorte avec les tissus conjonctifs et les muscles environnants.

Une limitation potentielle de cette étude est que ce modèle est faite entre l'aorte et l'IVC, les grands navires dans la petite souris. Il n'est pas clair si ce modèle imite l'AVF tel qu'il est utilisé dans les soins cliniques des patients humains, c'est à dire AVF faite dans les petites artères périphériques. En outre, les animaux de contrôle pour les expériences doivent être réalisées avec soin, et dépendent du protocole expérimental. Nous utilisons généralement des opérations fictives pour les contrôles, dans lesquels nous effectuons une laparotomie fermeture immédiate et sous anesthésie générale, sans aucune puncture du tout.

Nous décrivons un protocole court dans lequel l'opérateur peut effectuer AVF chez la souris, dans les 15-20 min. Nous prévoyons que ce modèle sera utile pour les études d'adaptation de la fistule qui peuvent être utiles pour des patients humains atteints d'insuffisance rénale au stade terminal, surtout s'il est utilisé en conjonction avec des modèles murins de la maladie.

Aucun.

Ce travail a été financé en partie par l'Institut national de la santé subvention R01-HL095498, ainsi que les ressources et l'utilisation des installations du Connecticut Healthcare Système VA, West Haven, CT.