Le biomolecole di peso molecolare più elevato sono composti non volatili che possono decomporsi prima di ionizzarsi o vaporizzarsi durante l'analisi di massa con i metodi convenzionali di ionizzazione per impatto elettronico. Di conseguenza, la ionizzazione elettrospray (ESI) è il metodo preferito per vaporizzare e ionizzare le biomolecole, poiché ne evita la rapida frammentazione e consente la registrazione dei segnali di massa per l'intera biomolecola.

L'ESI utilizza energia elettrica per trasferire gli ioni dalla fase liquida del campione alla fase gassosa. La biomolecola dell'analita viene premiscelata con un liquido ionico, un composto non molecolare che funge da sorgente di ionizzazione. La soluzione viene spruzzata attraverso un tubo capillare ad alta tensione per generare un aerosol fine. La differenza di tensione applicata tra il tubo capillare e l'ingresso della camera di analisi provoca il movimento di goccioline cariche verso la camera di analisi. Il liquido ionico evapora  dall'aerosol durante questo movimento, lasciando dietro di sé una molecola di analita variabilmente protonata o ionizzata. Queste specie cariche vengono rilevate nello spettro di massa a un valore m/z equivalente alla somma della massa molecolare della molecola dell'analita e del peso molecolare degli ioni del liquido ionico associato alla molecola dell'analita.

La posizione dei segnali di massa varia a seconda del tipo di cationi presenti nel liquido ionico. Ad esempio, la presenza di ioni sodio nel liquido ionico porta a un picco a (M+23) negli spettri di massa, mentre la presenza di un protone porta a un picco a (M+1).