Les biomolécules de poids moléculaire élevé sont des composés non volatils qui peuvent se décomposer avant de s'ioniser ou de se vaporiser lors de l'analyse de masse avec les méthodes d'ionisation par impact électronique conventionnelles. En conséquence, l'ionisation par électrospray (ESI) est la méthode privilégiée pour vaporiser et ioniser les biomolécules car elle évite la fragmentation rapide et permet l'enregistrement des signaux de masse pour l'ensemble de la biomolécule.

L'ESI utilise l'énergie électrique pour transférer les ions de la phase liquide de l'échantillon vers la phase gazeuse. La biomolécule d'analyte est prémélangée avec un liquide ionique, un composé non moléculaire servant de source d'ionisation. La solution est pulvérisée à travers un capillaire haute tension pour générer un aérosol fin. La différence de tension appliquée entre le capillaire et l'entrée de la chambre d'analyse provoque le mouvement des gouttelettes chargées vers la chambre d'analyse. Le liquide ionique de l'aérosol s'évapore au cours de ce mouvement, laissant derrière lui une molécule d'analyte variablement protonée ou ionisée. Ces espèces chargées sont détectées dans le spectre de masse à une valeur m/z équivalente à la somme de la masse moléculaire de la molécule d'analyte et du poids moléculaire des ions du liquide ionique associé à la molécule d'analyte.

La position des signaux de masse varie en fonction du type de cations présents dans le liquide ionique. Par exemple, la présence d'ions sodium dans le liquide ionique conduit à un pic (M+23) dans les spectres de masse, tandis que la présence d'un proton entraîne un pic (M+1).