ביומולקולות בעלות משקל מולקולרי גבוה הן תרכובות שאינן נדיפות ועשויות להתפרק לפני שהן מתיינות או מתאדות במהלך ניתוח מסה בשיטות יוניזציה מסורתיות באמצעות פגיעת אלקטרונים. בהתאם לכך, יוניזציה באלקטרוספריי (ESI) היא השיטה המועדפת לאידוי ויוניזציה של ביומולקולות, מכיוון שהיא עוקפת פירוק מהיר ומאפשרת הקלטת אותות מסה עבור הביומולקולה בשלמותה.

ESI משתמשת באנרגיה חשמלית כדי להעביר יונים מהמצב הנוזלי של הדגימה למצב הגזי. מולקולת הביומולקולה האנליטית מעורבבת מראש עם נוזל יוני - תרכובת לא מולקולרית המשמשת כמקור יוניזציה. הפתרון מותז דרך קפילרה במתח גבוה ליצירת אירוסול עדין. הפרש המתח המיושם בין הקפילרה לכניסה לתא הניתוח גורם לתנועת טיפות טעונות לעבר תא הניתוח. הנוזל היוני מהאירוסול מתאדה במהלך תנועה זו, ומשאיר אחריו מולקולה אנליטית שעברה פרוטונציה או יוניזציה במידת מה. מינים טעונים אלו מזוהים בספקטרום המסה בערך m/z השווה לסכום המסה המולקולרית של מולקולת האנליט ומשקל המולקולות של היונים מהנוזל היוני הקשורים למולקולת האנליט.

מיקום אותות המסה משתנה בהתאם לסוג הקטיונים הקיימים בנוזל היוני. לדוגמה, נוכחות יוני נתרן בנוזל היוני מובילה לפסגת (M+23) בספקטרום המסה, בעוד שנוכחות פרוטון תיצור פסגת (M+1).