Biomoleküle mit höherem Molekulargewicht sind nichtflüchtige Verbindungen, die sich bei der Massenanalyse mit herkömmlicher Elektronenstoßionisation vor der Ionisierung oder Verdampfung zersetzen können. Dementsprechend ist die Elektrospray-Ionisation (ESI) die bevorzugte Methode zum Verdampfen und Ionisieren von Biomolekülen, da sie eine schnelle Fragmentierung umgeht und die Aufzeichnung von Massensignalen für das gesamte Biomolekül ermöglicht.

ESI nutzt elektrische Energie, um Ionen aus der flüssigen Phase der Probe in die gasförmige Phase zu übertragen. Das Analyt-Biomolekül wird mit einer ionischen Flüssigkeit vorgemischt – einer nichtmolekularen Verbindung, die als Ionisierungsquelle dient. Die Lösung wird durch eine Hochspannungskapillare gesprüht, um ein feines Aerosol zu erzeugen. Der zwischen der Kapillare und dem Eingang der Probekammer angelegte Spannungsunterschied bewirkt die Bewegung geladener Tröpfchen in Richtung der Probekammer. Die ionische Flüssigkeit aus dem Aerosol verdampft während dieser Bewegung und hinterlässt ein unterschiedlich protoniertes oder ionisiertes Analytmolekül. Diese geladenen Spezies werden im Massenspektrum bei einem m/z-Wert nachgewiesen, der der Summe der Molekularmasse des Analytmoleküls und des Molekulargewichts der Ionen aus der mit dem Analytmolekül verbundenen ionischen Flüssigkeit entspricht.

Die Position der Massensignale variiert je nach Art der in der ionischen Flüssigkeit vorhandenen Kationen. Beispielsweise führt die Anwesenheit von Natriumionen in der ionischen Flüssigkeit zu einem (M+23)-Peak in den Massenspektren, während die Anwesenheit eines Protons zu einem (M+1)-Peak führt.