אנו בוחנים ביטוי חוץ רחמי בתיווך AAV של גורמי שעתוק נוירוגניים כטיפול פוטנציאלי לשבץ איסכמי. ההתמקדות שלנו היא לראות אם ביטוי Neurod1 בתאים המבטאים GFAP במהלך השלבים התת-חריפים והכרוניים לאחר שבץ מוחי מגביר את הנוירונים המתמרים ומתאם עם שיפורים בתפקוד המוטורי. ממצאים אחרונים מראים כי ביטוי גנים בקליפת המוח משתנה לפי אזור עם אותו AAV המחקר שלנו מצא כי מקדם ה-GFAP פעיל יותר בקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית מאשר בקליפת המוח המוטורית, מה שמצביע על כך שתאים מותמרים מגיבים בצורה שונה למקדמים ספציפיים.
לפיכך, טיפולים הכוללים גורמי שעתוק נוירוגניים צריכים להיות מותאמים לאזור מוח היעד. האתגרים הנוכחיים כוללים שונות בגודל נגע שבץ עקב משתנים כמו שיעורי ההזרקה של ET-1 ויעילות התמרה בין אזורי מוח. טיטרים וטרופיזם של AAV על פני אזורי מוח וזני עכברים יכולים להשפיע על יעילות הטרנסדוקציה, ולהשפיע על ההערכה התאית של ביטוי Neurod1 חוץ רחמי לאחר שבץ מוחי.
האתגר העיקרי בהמרת אסטרוציטים לנוירונים הוא להבחין בין נוירונים מתוכנתים מחדש לבין נוירונים קיימים. המעבדה שלנו שואפת לאשר שתכנות מחדש זה מתרחש in vivo על ידי פיתוח כלים חדשים. בסופו של דבר, אנו מבקשים להבין כיצד ביטוי חוץ רחמי של גורם שעתוק עצבי משפר את ההחלמה בבעלי חיים פגועי מוח.
כדי להתחיל, הסר את החיה המורדמת מהתא והנח אותה על משטח נקי. לאחר ניקוי אזור הניתוח של העכבר, הנח את אפו בחרוט האף הסטריאוטקסי וייצב את הגולגולת באמצעות מוטות אוזניים. בעזרת להב אזמל מספר 10, בצע חתך אנכי במקביל למישור הסגיטלי מאחורי נקודת האמצע של העיניים לעצם הקודקודית.
לאחר מכן, יש למשוך בעדינות את העור כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, השתמש בקצה Q כדי לשבש את הפאשיה על הגולגולת ולאפשר לגולגולת להתייבש כדי לחשוף את הברגמה במלואה. בעזרת מקדחה סטריאוטקסית במהירות גבוהה, קדחו שלושה חורי קוצים בקואורדינטות בקליפת המוח המוטורית החושית הימנית.
לאחר מכן, החלף את המקדחה במזרק בגודל 26 המצויד במחט באורך 0.375 אינץ'. טען 1.5 מיקרוליטר של תמיסת אנדותלין-1 מיקרוטולרית 400 מומסת ב-PBS סטרילי לתוך המזרק. שחרר נפח קטן של אנדותלין-1 כדי לצפות בטיפה בקצה המחט, מה שמבטיח זרימה טובה.
הורד את קצה המחט מעבר לגולגולת לתוך חור הקוצים האמצעי מבלי לנקב את הדורה מאטר. לאחר היישור, הורידו את המחט מילימטר אחד לתוך המוח. בעזרת מזרק המילטון, הוציאו 0.1 מיקרוליטר בכל פעם, והמתינו דקה אחת לפני הזרקת 0.1 מיקרוליטר הבא.
כדי למנוע את חסימת המחט בין הזריקות ואחריהן, שחרר נפח קטן של אנדותלין-1 עד להופעת טיפה בקצה המחט. בעזרת Q-tip סטרילי, נגב את עודפי האנדותלין-1 לפני ההזרקה. לבסוף, תפר את העור שמעל הגולגולת באמצעות תפר סטרילי 4-0 כדי לסגור את הפצע.
לאחר הרדמת העכבר שטופל באנדותלין-1, העבירו את העכבר למסגרת הסטריאוטקסית. בעזרת מספריים כירורגיים חותכים את התפרים על הפצע. בעזרת מלקחיים, הסר את הגלד ומשוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת.
לאחר מכן, השתמש בקצה Q סטרילי כדי לייבש את משטח הגולגולת ולאתר את חורי הקוצים. הגדר את זרועות המניפולטור של המנגנון הסטריאוטקסי. הנח מחזיק מחט הנושא מזרק בגודל 26 עם מחט באורך 0.375 אינץ'.
כעת, טען 3.4 מיקרוליטר של תמיסת AAV לתוך המזרק. הורד את קצה המחט מעבר לגולגולת לתוך החור הראשון, הקדמי ביותר. ודא שהמחט לא מנקבת את הדורה מאטר, ואז הורד במילימטר אחד לתוך המוח.
באמצעות מזרק המילטון, הזרקו מיקרוליטר אחד של תמיסת AAV על ידי הוצאת 0.1 מיקרוליטר בכל פעם כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן תפר את העור שמעל הגולגולת כדי לסגור את הפצע באמצעות תפר פוליאסטר 4-0 Polysorb. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והעבר אותו לכלוב דיור בעלי חיים נקי ומחומם מראש באזור ההתאוששות.
