ברצוננו להודות למנואלת ודאק, Ljiljana Marinkovi וקריסטינה Wullimann לקבלת סיוע טכני מעולה. אנו מודים וו מאקלין למתן עכברי PLP-GFP. TM נתמך על ידי המכון ללימודים מתקדמים (אוניברסיטת Technische מינכן), על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), על ידי אלכסנדר פון הומבולדט--הקרן ועל ידי סוכנות המימון הלאומי (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; ) במסגרת של &quot;Neuron&quot; iPSoALS ERA-NET ו&quot; הדמית 2-פוטון &quot;. TM וMB נתמכים על ידי המרכז למדע החלבון משולב (מינכן). השעה הייתה נתמכת על ידי בית הספר למוסמכים של אוניברסיטת Technische מינכן (טום-GS).

1. Triangularis Sterni Explant (איור 1) תזמון: 15 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכשירי ניתוח: 2 זוגות של מלקחיים, 1 זוג מספריים, 1 זוג מספרי האביב, צלחת תרבית רקמה 1 (10 סנטימטרים). מראש מבעבעים-(מינימום 15 דקות) מקורר (4 ° C) הפתרון של רינגר עם 5% CO 2/95% O 2. מלא צלחת תרבית רקמה 15-סנטימטר עם קרח ולכסות אותו עם לוחית מתכת. הכן מיקרוסקופ נתיחה ולמקם את צלחת 15-הסנטימטר עם קרח מתחת להיקף הנתיחה כדי לקרר את explant במהלך נתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטלני להרדים את העכבר על ידי מנת יתר isoflurane (או כל שיטה אחרת שאושרה לקורבן). רסס את העכבר עם אתנול 70% על מנת למנוע זיהום פרווה של explant. להלבנת SC, השתמש עכברי PLP-GFP, אשר ניתן לחצה Thy1-OFP3 או Thy1-Membow13 להדמיה סימולטני של האקסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בזוג מספרי גדול, לעשות חתך קו אמצע שלהעור מעל עצם החזה ושני חתכים מקבילים לקצה התחתון של כלוב הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בזוג מספרי גדול, להסיר את העור, לפתוח את דופן הבטן, ולבצע חתכים מקבילים לצלעות את כל הדרך חזרה לעמוד השדרה. ואז לנתח את שרירי החזה על ידי ביצוע חתכים קרובים יותר להחדרה בשרירי עצם החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הסרעפת הפתוחה ממש מתחת לסחוס xiphoid ולנתח את הסרעפת יחד הוספות costal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את כלוב צלעות על ידי תהליך xiphoid עם סט של מלקחיים, להתחיל לחתוך את הצלעות את עמוד השדרה, קרוב ככל האפשר להוספות שלהם. קיצוצי השמאל וימין צריכים להתכנס מעל הלב כלפי manubrium sterni. נסה להימנע מחיתוך כלי דם גדולים (במיוחד את ורידי subclavian). ראות טובה יותר מושגת על ידי הרמת הכנת עדינות תוך אחיזה בתהליך xiphoid עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך רוחבי מתחת manubrium sterniולהעביר explant לתוך צלחת 10-הסנטימטר עם פתרון 2 בועות-CO של רינגר המקורר 5% 2/95% O. מניח את צלחת 10-הסנטימטר על לוחית המתכת המכסה את צלחת תרבית רקמת 15-הסנטימטר מלא בקרח. צריכים לעשות את כל צעדים נוספים תחת המיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספרי האביב קטנים להסיר שאריות של בלוטה התימוס, הצדר, סרעפת (בפנים) ושרירי חזה (חיצוניים; איור 1B-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתאים את המנה לexplant 3.5-הסנטימטר, לנתח את כל הצלעות שלא להכניס לעצם החזה. הדרך טובה ביותר לעשות שימוש במספרי האביב קטנים וחיתוך רקמות שבבין צלעות (האיור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד explant sterni triangularis עצבי השריר לתוך צלחת Sylgard המצופית 3.5-סנטימטר רקמת התרבות באמצעות סיכות minutien (קצר ל&lt; 4 מ&quot;מ; האיור 1G). שתי סיכות צריכות לעבור את חלקי סחוס (לבן) של עצם החזה. הכנס לפחות שתי סיכות דרך הצלעות הן בצד השמאל וימין של הexplant הדואר מכוון לחלקי הסחוס הרכים והימנעות מהצלעות מתחת או קרוב לשריר triangularis. ככל שיותר סיכות משמשות, טוב יותר (בדרך כלל משתמשים באנו 8-10). כפי שאתם להצמיד הכנה, לוודא שהצלעות מפוזרות במקצת, תקן את השריר למצב מתוח במקצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: דמיינו אתרים המכילים קולטניים אצטילכולין סינפטיים ידי הוספת bungarotoxin מצמיד את צבעי Alexa (ריכוז של 0.8 מיקרוגרם / מ&quot;ל בפתרון 2-בועות של רינגר 5% CO 2/95% O). דגירת explant הצמיד בצלחת מצופית Sylgard לדקות 15-20 בטמפרטורת חדר ולאחר מכן לשטוף מספר פעמים עם פתרון 2-בועות של רינגר 5% CO 2/95% O. </li></ol> 2. SCS הלבנה ומיקרוסקופיה זמן לשגות אופציונלית (איור 2) תזמון: 30 - 45 דקות + 1 אופציונלית - 5 שעות לזמן פקיעה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מנת Sylgard המצופית של 3.5 סנטימטר לשנינות מצוידת confocal מיקרוסקופh ארגון ליזר (488 ננומטר אורך גל) ויעדי טבילה במים (4x, 0.13 NA; 20x, 0.5 NA ו100x, 1.0 NA או 60x, 0.9 נ&quot;א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי למיקרוסקופיה זמן לשגות: הוספה Sylgard מצופית 3.5 סנטימטר צלחת לטבעת חימום, להתקין את מערכת superfusion ובדיקת טמפרטורה (איור 2 א). ודא שאף אחד מהם לגעת explant, השפה של המנה או ציפוי Sylgard. מחמם את המדגם כדי 33-35 מעלות צלזיוס להלבנת SC ללא זמן לשגות, בטמפרטורת החדר היא טובה יותר, כמו תאים להראות פחות דינמיקה בין צעדי הלבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במטרה לבחון אוויר 4x דפוס עצבוב של שרירי sterni triangularis ולמצוא להקת endplate sterni triangularis. לעבור ל20x אובייקטיבי חרוט הטבילה ולהתחיל לחפש אזורים שטחיים בתוך להקת endplate (צלעות שמעליה אזורים הם מועמדים טובים). שינוי אובייקטיבי למטרה או 100x 60x חרוט הטבילה לבדוק NMJs הבודד. אידיאלי הוא NMJ כי הוא מכוסה על ידי מספר SCS והוא ממוקם מאוד superficially (איור 2 ב &#39;). אם תבצע הדמית זמן לשגות אחרי הלבנה, בחר עד 3 NMJs שקרובים יחסית יחד כדי להגדיל את התשואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונת confocal של NMJ לפני צילום הלבנת SCS הבודד (איור 2 ב &#39;). (להדמיה ברזולוציה מלאה, למשל בFV1000 מיקרוסקופ אולימפוס, להשתמש, אובייקטיבי 100x 1.0 ו -2.5 NA זום, שתוצאת דגימת נייקוויסט המוגבלת של ~ 0.1 מיקרומטר לפיקסל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;פרק&quot; 488 קרן ליזר ננומטר מרכזי בגרעין של SC משתמש בכוח מקסימאלי למשך 5 שניות (לחלופין דפוס יעיל סריקה באזור קטן של עניין ניתן להשתמש, כגון פונקציה &quot;טורנדו הסריקה&quot; במיקרוסקופ אולימפוס; כפי שאנו משתמשים confocal מיקרוסקופ, הליזר הוא מרוכז למטוסי תמונת הצמד ומכאן, ב488 ננומטר עם מטרה של 1.0 NA, &lt;0.5 מיקרומטר קוטר). מחדש להתמקד בתא ושופט הלבנת תוצאה. אם יש צורך לחזור על הלבנת צעד שוב עד רמות GFP הם להפחיתד לרמות רקע קרוב. לרכוש תמונה אחרי הלבנה (האיור 2C). זה קריטי כדי לוודא שהאזור המולבן הוא מחוץ לכל חפיפה בין שני תאים - אם יש חפיפה, הלבנה בתא שני תהיה ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב מעל עד שכל אבל אחד SC הם מולבנים (איור 2D-E). האחרון &quot;המולבן&quot; SC מתאים למיקרוסקופיה confocal זמן לשגות. לשחזר תאים בודדים על ידי חיסור של תמונות, לדוגמא שימוש בתוכנת פוטושופ, כדי להתוות מורפולוגיה SC אחת ושטח (האיור 2F). להיות מודע לכך שהפחתת 2 המגים מוסיפה רעש (למשל על ידי יבואם ב&quot; שכבות &quot;רצופות בפוטושופ ולאחר מכן הגדרת הערוץ מלמעלה&quot; הבדל &quot;בתפריט הנפתח בחלק העליון של כרטיסיית ערוצים). זה יכול היה לעקוף באמצעות פונקציה &quot;despeckle&quot; בערוצים לפני החיסור וחיתוך משם כל רקע שאינו ברור מקורןתא מולבן. כדי לייעל, לעומת זאת, זה יכול להיות נחוץ כדי להתאים את הבהירות של שני הערוצים בחלון &quot;הרמות&quot;. התמונה המתקבלת של התא המולבן היא על גבי התמונה המקורית של סינפסה, פסאודו הצבועה בגוון ייחודי ושקוף לצבוע את השטח של התא המולבן בתמונה המקורית (מלעשות את זה עבור כל מולבן והאחרון , תאים מולבנים תמונה שמוצגת בתוצאות תרשים 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: מיקרוסקופיה confocal התחל זמן לשגות אחרי הלבנה כל אבל אחד SCS. קח תמונה במרווחי זמן קבועים (למשל כל 5 עד 10 דקות). השתמש בכוח הליזר קטן ככל האפשר. עד 3 NMJs ניתן הדמיה באותה הישיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות מפה של NMJs הנושן על ידי לקיחת תמונה ב100x ללא זום, אז תמונות של האזור באמצעות 20x ויעדי 4x (איור 2G-I). &quot;המפה&quot; זו נחוצה כדי למצוא NMJs הבא אימונוהיסטוכימיה של שריר קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמונהעיבוד, להמיר תמונות בודדות לתחזיות בעצמה מרבית ולשמור בפורמט TIFF. מערבב את כל זמן נקודתי Z-מוקרנים לתוך ערימה וליישר בxy, למשל באמצעות התוסף &quot;stackreg&quot; 10 בפיג&#39;י (חבילה המבוססת על תוכנת הקוד הפתוח ImageJ; המכונים הלאומיים לבריאות). </li></ol> 3. קיבעון ואימונוהיסטוכימיה (איור 3) תזמון: לינה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת explant לתוך צינור תגובה 50-מ&quot;ל מכיל לפחות 15 מ&quot;ל 4% PFA על ידי הסרת הסיכות בזהירות. לאחר תיקון קיר בית החזה קדמי המכיל את שרירי sterni triangularis לשעה 1 בקרח. יש לשטוף את רקמה קבועה עם 0.1 M גליצין ב PBS (כדי להרוות מקבע השיורי ולכן להפחית רקע) במשך לפחות 10 דקות. דוגמאות ניתן לאחסן בנקודה זו ועיבוד מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת explant קבוע לצלחת 10-סנטימטר Sylgard מצופית רקמת תרבות מלאה עם 0.01 M PBS. גזור את צורת טרפז עם סי 1דה במקביל לעצם החזה והשני דרך מעברי עצם לסחוס - זה מכיל את שריר triangularis על פני השטח שלו. הסרת צלעות תחתונות עם (כלומר טרנס חזה) לחתוך אופקי כך שקצה הזנב של שריר triangularis ניתן לגשת באופן חופשי (איור 3A-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מזרק כמו סיכה בחלק העליון של הטרפז (איור 3E). השתמש במזרק המצורף למזרק 1 מ&quot;ל ומלקחיים כדי להסיר את שריר triangularis על פני השטח על ידי החזקתה בעדינות אל פינת זנב של השריר ושימוש במחט כמייקרו אזמל. ודא כי קיצוצים נעשים במקביל למישור של קיר בית החזה. ברגע שחלק הזנב של השרירים משתחרר, הכנס זריקת הרגעה נוספת כמו סיכה מתחת לשריר דרך קיר בית החזה - זה משתק את ההכנה ומאפשר הפעלת משיכה עדינה על השריר באמצעות מלקחיים (איור 3F). כפי שאתה חותך tiss חיבורהוספות UE, &quot;לקלף&quot; את השרירים מבית החזה. חותך מצורף זנב אחרון במספרי האביב. הסר שאריות שומן וכלי דם באמצעות מלקחיים. היזהר שלא לקרוע את העצבים. הערה: השתמש במערכות נפרדות של כלים וצלחות לעבודה עם רקמה חייה וקבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל אימונוהיסטוכימיה (באמצעות פרוטוקול סטנדרטי) על ידי העברת דגימות רקמה לפתרון חסימה לשעה 1 בייקר בטמפרטורת חדר. נפח הקטן ביותר האפשרי להכתמה הוא 200 μl באמצעות צלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נוגדן ראשוני המדוללים בפתרון חסימה, 200 μl לטוב, לילה ב 4 ° C במטרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף ב0.01 M פעמי PBS 3 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נוגדן משני מתאים ל1-2 שעות בטמפרטורת חדר דילול בחסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף ב0.01 M פעמי PBS 3 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר במדיום נגד דהייה (למשל Vectashield) וcoverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית מניח על צלחת מתכת מגנטית, מגנט מקום על גבימהמדגם לשטח לכמה שעות או למשך לילה ב 4 ° C. לאטום בלכה לציפורניים. </li></ol>

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

SC שיטת ההלבנה מוצגת כאן היא פשוט, מהירה ותכליתית: (i) הוא מאפשר לחשוף מורפולוגיה SC אחת ודינמיקה ידי מיקרוסקופיה confocal מבוססת על transgene בודד - אשר מהווה יתרון משמעותי בעת שילוב לדוגמא הגישה למודלים למחלות הדורשים אללים נוספים . (Ii) היא השיטה מהירה, כמנתיחה לקיבעון זה ניתן לבצע בחצי יום. (Iii) מספר היישומים רחב, כפי שהיא ניתנת בשילוב עם שיטות אחרות, כגון כריתה סלולרית, אברוני הדמיה, electrophysiology או אימונוהיסטוכימיה. בנוסף, הגישה המוצגת כאן לSCS בNMJs Murine ניתן להכליל את תאים אחרים, רקמות או מינים - דוגמה אחת ליישום של טכניקה קשורה בדג הזברה מוצגת ב6 הפניה. גם חלבוני ניאון אחרים מלבד GFP יכולים לשמש להלבנה וזמן לשגות מיקרוסקופ, למשל YFP או CFP. למרות שאנו לא השתמשנו חלבוני הניאון האלה בSCS, bleachiננוגרם של אקסונים מראה כי חלבון פלואורסצנטי פחות יציב (למשל CFP) בהגדרה זו יכול להיות יתרון. עם זאת, פשרה בין הדמית הלבנה יעילה ויציבה יש למצוא, בהתאם לתוצאות הרצויות (למשל תמונה אחת לעומת זמן לשגות של התאים הנותרים בלתי המולבנים). ישנן מספר המגבלות לטכניקה, עם זאת. אחד מתייחס לשימוש בשרירי explanted (ומכאן axotomized), המגביל את תקופת ההדמיה. במחקרים הקודמים שמצאנו כי - בהתאם לשאלה נחקרת - explant sterni triangularis יכול לשמש למקסימום של 3-6 שעות. ובכל זאת, תמונה רציפה הלבנה-ניתן להשתמש in vivo, התגברות על מגבלה זו ספקה דגימה ניתן לייצב במידה מספקת כדי להשיג תמונות שניתן נגרעו. שני היבטים נוספים צריכים להיות כל זמן בראש, בעת ניתוח נתונים המתקבל מגישת ההלבנה הרציפה: Phototoxicity (אני) יכול לשנות את הדינמיות SC, כפי killing לתוצאות מסוף SC בהתרחבות מהירה של 11 שכניה. אז יש לכלול בדיקות סבירות, למשל מדידת הסכום של הרחבות והכחשות בסינפסה יציבה. בממוצע, האוכלוסייה של SCS הדמיה לא צריכה לגדול או להתכווץ באופן משמעותי. (Ii) המורפולוגיה של כל אבל SC האחרון מתקבלת על ידי חיסור תמונה. איכות תמונה כזו תלויה בניגוד ההלבנה הושג. זו מושגת בדרך כלל קל יותר בקווי עכבר בהירים. לדוגמה, PLP-GFP עובד טוב יותר מאשר 12 S100-GFP. תמונת החיסור מוסיף רעש, ולכן SCS האחרון מתגלה בדרך כלל בפירוט רב יותר מאשר לאחרים (במיוחד גם, כהדמיה שלאחר מעשה לאחר קיבוע מאפשר באמצעות מטרות נפט גבוהות מספריות צמצם). לפיכך, תכונה מורפולוגית צריכה להתקבל רק כאמיתי, אם הוא גלוי בSCS &quot;האחרון&quot;, כמו גם באלה מולבנים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה (דוגמה) </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> 70% (כרך / כרך) פתרון אתנול </td><td> רוט </td><td> T913.1 </td><td> בבקבוק תרסיס </td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Forene, אבוט </td><td></td><td> כל מאושרת הרדמה אחרת יכולה לשמש להרדמה קטלנית </td></tr><tr><td> עכברים הטרנסגניים (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> שיופק ממקורות שצוטטו </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ נתיחה עם תאורה קרה אור </td><td> אולימפוס SZ51 </td><td></td><td> מצויד בשוט KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> מלקחיים #2 </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים # 5 </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> מספריים, רפואי גדול </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> מספריים, אביב זווית קטן </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> תנור בקו </td><td> וורנר מכשירים </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> חימום טבעת למנות של 3.5 סנטימטר </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> 2 מערכת בקרת טמפרטורת ערוץ </td><td> וורנר מכשירים </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> מערכת משאבת superfusion </td><td></td><td></td><td> שהותקן </td></tr><tr><td> צלחת תרבית רקמה 15-סנטימטר </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> מלא בקרח ומכוסה על ידי לוחית מתכת </td></tr><tr><td> צלחת תרבית רקמה 10-סנטימטר </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> עם הפתרון של רינגר חומץ </td></tr><tr><td> צלחת תרבית רקמה 3.5 סנטימטרים </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> מלא בSylgard פולימר </td></tr><tr><td> Sylgard פולימר </td><td> Dow Corning </td><td> ערכת אלסטומר Sylgard 184 סיליקון </td><td></td></tr><tr><td> confocal מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> FV1000 </td><td> עם ארגון ליזר </td></tr><tr><td> צינור תגובה 50-מ&quot;ל </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% PFA ב PBS </td><td> סיגמא </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 25 מ&quot;מ צינורית מ&quot;מ x </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק 1 מ&quot;ל </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן synaptophysin </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> ארנב </td></tr><tr><td> נוגדן משני </td><td> Invitrogen </td><td> -11012 </td><td> אלכסה 594 </td></tr><tr><td> צלחת 24 היטב </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td> סיגמא </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0.1 מ &#39;גליצין ב PBS </td><td> רוט </td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td> coverslips </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> שקופיות </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> מעבדות וקטור </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> פיני minutien × 10 </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 26002-20 </td><td> קצר ל&lt; 4 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin מצמיד את אלכסה 594 </td><td> Invitrogen (בדיקות מולקולריות) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> חסימת פתרון </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2% Triton-x100 </td><td> רוט </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% סרום עיזים רגיל </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% אלבומין בסרום שור </td><td> סיגמא </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> צלצלן מבעבע עם 95% O 2/5% CO 2 </td></tr><tr><td> 125 המ&quot;מ NaCl </td><td> סיגמא </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5 המ&quot;מ KCl </td><td> סיגמא </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1.25 מ&quot;מ nah 2 PO 4 </td><td> סיגמא </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 המ&quot;מ 3 NaHCO </td><td> סיגמא </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 המ&quot;מ CaCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 המ&quot;מ MgCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז 20 מ&quot;מ </td><td> סיגמא </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. ריאגנטים וציוד ספציפיים. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

תמונה רציפה הלבנה-מספק דרך לא פולשנית לתייג SCS הבודד בNMJ. NMJ הוא סינפסה הגדולה ביותר של מערכת העצבים של היונקים וכהן כמנחה מודל ללמוד מבנה ותפקוד הסינפטי. במסופי האקסון מוטורי NMJs עכבר להקים אתרי מגע הבייגלה עם סיבי שריר. מנוע האקסון ומסופו הם המכוסים בSCS. במהלך העשורים האחרונים, מספר עכברים הטרנסגניים כבר נוצר כדי לחזות הנוירונים מוטוריים וSCS, לדוגמא 1 Thy1-XFP ו PLP-GFP עכברים 2, בהתאמה. לאורך האקסונים מוטוריים, SCS axonal myelinating מסודר בהלא חופף internodes, מופרד על ידי צומת של Ranvier, כדי לאפשר התקדמות פוטנציאל פעולה קופצנית. בניגוד לכך, SCS טרמינל הסינפסה הם תאי גליה מיוחדים, אשר לפקח ולקדם עצביים, לעכל האקסונים מדריך מתחדש ופסולת. NMJs מכוסה היטב על ידי עד חצי תריסר הלא myelinating SCS מסוף - אלה, עם זאת, לא ניתן לפתור באופן אישי על ידי מיקרוסקופ אור, כפי שהם נמצאים בקשר ישיר קרום 3. כמה גישות קיימות בנפרד לדמיין SCS מסוף. אף אחד מאלה הם ללא רבב, אם כי. לדוגמה, מילוי צבע, שם תאים בודדים הם משופדים עם microelectrode צבע מלא, דורש להרוס את תאים שכותרתו לפני מילוי שנייה אחת. זה אינו תואם עם הקלטות זמן לשגות באות 3. תיוג בעל רפאים &quot;Brainbow&quot; של SCS הושג באמצעות ביטוי קומבינטורית של חלבוני ניאון 4. עם זאת, טכניקה זו דורשת שילוב של מספר transgenes ומוגבל על ידי דפוס הביטוי של היזמים בשימוש. בעתיד, ביטוי של חלבונים &quot;צילום&quot; בהחלפת SCS יכול להיות עוד 5 חלופיים. כאן אנו מציגים צילום הלבנה רציף, שבו תאים בודדים המולבנים, ותמונתם מתקבלת על ידי חיסור. אנו מאמיניםכי גישה זו - בשל הקלות והרבגוניות שלו - מייצגת תוספת קיימא לפלטת הטכנולוגיה של הנוירולוג, במיוחד כפי שהוא יכול להיות בשימוש בגוף חי והועבר לתאים מסוגים אחרים, אתרים או מינים 6 אנטומיים. בפרוטוקול הבא, אנחנו פירוט היישום של מיקרוסקופיה confocal הלבנה רציפה ולאחר הזמן לשגות לSCS מסוף בexplants השרירים sterni triangularis. הכנה זו דקה, שטחית ונתחה בקלות עצבי שרירי 7,8 הוכיחה שימושית ללימודים של NMJ פיתוח, פיזיולוגיה והפתולוגיה 9. לבסוף, תסבירו כיצד שרירי sterni triangularis מוכנים לאחר הקיבוע לבצע קורלציה רזולוציה גבוהה confocal הדמיה, או בדיקות אימונוהיסטוכימיה ultrastructural.

דוגמה לexplant sterni triangularis המוכן לצלחת הדמיה מוצגת באיור 1G. explant זה מתאים במיוחד עבור vivo ההדמיה NMJs לשעבר כשרירי triangularis מורכבים מכמה שכבות של סיבי שריר בלבד. זה מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה מexplants נגזר מקווי עכבר מהונדסים שגולת הכותרת או SCS (PLP-GFP 2) ו / או אקסונים (1 Thy1-XFP). גורמים קריטיים להדמיה באיכות גבוהה כוללים: (i) הימנעות מלגעת בשרירי triangularis במהלך הכנת explant כדי למנוע פגיעה בסיבי שריר (ii) בחירת סינפסות שטחיות ושטוחות כדי לצמצם סטיות עומק הקשורים, (iii) לא התחממות יתר המדגם (&gt; 37 ° C) ושמירת הדגימה גם מחומצן, (ד) שעלול לעצור superfusion במהלך הדמיה להפחתת סחף או רטט; (v) הצבת צינורות superfusion ובדיקות טמפרטורה בזהירות כדי להימנע ממגע המדגם, כמו גם keeping התחתון של התבשיל היבש למניעת סחף; (vi) איזון מקיף הלבנה עם הימנעות אובדן &quot;ביטחונות&quot; אות בSCS מחוץ ליעד למקסם את הניגוד. עוויתות שרירים ופיצול האקסון לעתים קרובות נצפו תופעות, אם explant פגום ולא בריא. חוסר יציבות של תוצאות ההכנה בתחזיות מטושטשות של ערימות confocal. עם זאת, ברגע שטכניקה המתוארת הרציפה צילום ההלבנה עובדת היטב, היא חושפת את המורפולוגיה של SC מסוף היחיד בפירוט רב (האיור 2F). המורפולוגיה גילתה של SCS מסוף היחיד יכולה להיות די מפתיעה ולא צפויה בקלות לפני ההלבנה. יתר על כן, מידת תנועתיות SC בתוך NMJ לא יכולה להתגלות ללא תיוג תאים בודדים. בעקבות מיקרוסקופי חי, explant sterni triangularis יכול להיות קבוע ומוכתם לכל סמן של ריבית (איור 3). לשם כך, לחיות תאי הדמיה ניתן לעקוב בחזרה באמצעות מפת Creaטד מראש (איור 2G-I) ונסרק ברזולוציה גבוהה ברקמות הקבועות. בדרך שיטות סטנדרטיות לאימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש - אזהרה אחת כאן היא העובדה שחדירת הנוגדן יכולה להיות מוגבלת למדי באקסונים myelinated ודורשת פעמי דגירת נוגדנים ארוכות מאוד. שוב, בחירת NMJs השטחי והסרת שאריות שומן משריר הקבוע היטב (בלי לגזול ממך את העצבים) מסייעת למנוע זאת מלכודת. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.4in" fo:src="/files/ftp_upload/4460/4460fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4460/4460fig1.jpg" /> איור 1. הכנת Triangularis sterni explant. () להכין explant עצבי שרירי triangularis יש צורך לנתח את הקיר השלם הקדמי החזה של העכבר (גבי סכמטי על עכבר). (ב) קיר בית חזה קדמי רק לאחר נתיחה. ( <stronז&gt; C) צד הפנימי של קיר בית החזה הקדמי. שים לב לשרידי התימוס ועל הסרעפת שיש להסיר. (D, E) קיר בית חזה קדמי לאחר הסרת בלוטת התימוס (ד &#39;) וסרעפת (E). אדום קווים מקווקווים מציינים את נקודתי כניסה לחתכים כדי להסיר את כל הצלעות שלא להכניס לעצם החזה. (F) Explant מוכן להיות מוצמד למטה לתוך הצלחת המצופית 3.5-סנטימטר Sylgard. (ז) explant sterni Triangularis משפדים ומוכנים להדמיה. שים לב למיקום של הפינים (עיגולים אדומים) ולוקליזציה שריר sterni triangularis (מסומן בקו מקווקו אפור). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4460/4460fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4460/4460fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4460/4460fig2.jpg" /><br<html> /&gt; איור 2. SC הרציף הלבנה בעכבר PLP-GFP. () התקנת Confocal מצוידת למיקרוסקופיה זמן לשגות עם מערכת superfusion. (ב) NMJ עם 3 SCS מסוף אשר קורצף ברצף ב (CE). (F) תמונת חיסור באמצעות פוטושופ תוכנה וכיסוי פסאודו צבעוני מאפשר לדמיין שטחי SC בודדים. מפה (GI) של SCS הדמיה למעקב אחר SC הדמיה בחזרה לאחר אימונוהיסטוכימיה. (CE) הנקודות הכתומות המודגשות על ידי חצים כתומים מציינות את המיקום והגודל של האזור של עניין משמש להלבנה (כאן דפוס &quot;טורנדו&quot; סריקה שמש) המקורב. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4460/4460fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. נתיחה של השריר הקבוע triangularis sterni ותמונה של NMJ הקבוע. () Explant הקבוע triangularis sterni ב PBS בצלחת תרבית תאים מצופים Sylgard. (BD) חתכים בוצע במספרי האביב לבודד שרירי sterni triangularis. (EG) הצמדה של חתיכת explant המכילה שריר sterni triangularis והסרת שריר מפני שטח. (H, אני) תצוגה קבועה של NMJ מאוד שצלם באיור 2. הכתמה לקולטנית אצטילכולין עם bungarotoxin מצמיד Alexa 647 (אדום) ועל שלפוחית ​​סינפטיים עם נוגדן אנטי synaptophysin (לבן). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4460/4460fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Visualizing תאים בודדים ברקמות דחוסות, כגון תאים סופניים שוואן (SCS) בneuromuscular צמתים (NMJs), מאתגר. &quot;משכית תמונת הלבנה-&quot; מאפשר תיחום SCS מסוף היחיד, למשל בexplant triangularis sterni השריר, הכנה נוחה עצבי שרירים, שם ניתן לשלב הלבנה רציפה עם הדמית זמן לשגות ו<em&gt; פוסט הוק</em&gt; Immunostainings.

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

sequential-photo-bleaching-to-delineate-single-schwann-cells-at

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Views.  Technische Universität München. Visualizing תאים בודדים ברקמות דחוסות, כגון תאים סופניים שוואן (SCS) בneuromuscular צמתים (NMJs), מאתגר. "משכית תמונת הלבנה-" מאפשר תיחום SCS מסוף היחיד, למשל בexplant triangularis sterni השריר, הכנה נוחה עצבי שרירים, שם ניתן לשלב הלבנה רציפה עם הדמית זמן לשגות ו פוסט הוק Immunostainings.

Video: Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

הקלטה אופטית של פעילות עצבית suprathreshold עם רזולוצית תא בודד ויחיד ספייק

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

זיהוי של<em&gt; באתר</em&gt; מכלולי חלבון-חלבון ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...