Системы AAV и мышиные модели для исследования эктопической экспрессии Neurod1 в трансдуцированных клетках при подостром и хроническом периоде постишемического инсульта

Мы изучаем AAV-опосредованную эктопическую экспрессию нейрогенных транскрипционных факторов в качестве потенциального лечения ишемического инсульта. Наша цель состоит в том, чтобы выяснить, увеличивает ли экспрессия Neurod1 в GFAP-экспрессирующих клетках во время подострой и хронической фаз после инсульта трансдуцированные нейроны и коррелирует с улучшением двигательных функций. Наши исследования показали, что промотор GFAP более активен в медиальной префронтальной коре, чем в моторной коре, что указывает на то, что трансдуцированные клетки по-разному реагируют на конкретные промоторы.

Таким образом, терапия с использованием нейрогенных факторов транскрипции должна быть адаптирована к целевой области мозга. Текущие проблемы включают вариабельность размеров инсультных поражений из-за таких переменных, как скорость инъекций ET-1 и эффективность трансдукции между областями мозга. Титры AAV и тропизм в областях мозга и у мышей могут влиять на эффективность трансдукции, влияя на клеточную оценку экспрессии эктопического Neurod1 после инсульта.

Основная проблема при преобразовании астроцитов в нейроны заключается в том, чтобы отличить перепрограммированные нейроны от уже существующих. Наша лаборатория стремится подтвердить, что это перепрограммирование происходит in vivo, путем разработки новых инструментов. В конечном счете, мы стремимся понять, как эктопическая экспрессия нейронального транскрипционного фактора способствует восстановлению у животных с поврежденным мозгом.

Для начала извлеките животное под наркозом из камеры и положите его на чистую поверхность. После очистки хирургической области мыши поместите ее нос в стереотаксический носовой конус и стабилизируйте череп с помощью ушных планок. С помощью лезвия скальпеля номер 10 сделайте вертикальный разрез параллельно сагиттальной плоскости от середины глаз до теменной кости.

Затем аккуратно втяните кожу, чтобы обнажить череп. Затем используйте ватную палочку, чтобы разрушить фасцию на черепе и дать черепу высохнуть, чтобы полностью обнажить брегму. С помощью высокоскоростного стереотаксического сверла просверлите три отверстия для заусенцев по координатам в правой сенсорно-моторной коре.

Затем замените дрель шприцем 26-го калибра, оснащенным иглой длиной 0,375 дюйма. Загрузите в шприц 1,5 мкл 400 микромолярного раствора эндотелина-1, растворенного в стерильном PBS. Выпустите небольшой объем эндотелина-1, чтобы наблюдать за каплей на кончике иглы, обеспечивая хороший поток.

Опустите кончик иглы мимо черепа в среднее отверстие для заусенцев, не прокалывая твердую мозговую оболочку. После выравнивания опустите иглу на один миллиметр в мозг. Используя шприц Гамильтона, дозируйте по 0,1 микролитра за раз и подождите одну минуту, прежде чем вводить следующие 0,1 микролитра.

Чтобы предотвратить закупорку иглы между инъекциями и после них, выпускайте небольшой объем эндотелина-1 до тех пор, пока на кончике иглы не появится капля. С помощью стерильной ватной палочки перед инъекцией сотрите избыток эндотелина-1. Наконец, зашите вышележащую кожу на черепе с помощью стерильного шва 4-0, чтобы закрыть рану.

После обезболивания мыши, обработанной эндотелином-1, перенесите мышь в стереотаксическую рамку. С помощью хирургических ножниц разрежьте швы на ране. С помощью щипцов удалите струп и втяните кожу, чтобы обнажить череп.

Затем используйте стерильную ватную палочку, чтобы высушить поверхность черепа и найти отверстия от заусенцев. Установите манипуляторные рычаги стереотаксического аппарата. Поместите иглодержатель со шприцем 26-го калибра с иглой длиной 0,375 дюйма.

Теперь загрузите в шприц 3,4 микролитра раствора AAV. Опустите кончик иглы мимо черепа в первое, самое переднее отверстие для заусенца. Следите за тем, чтобы игла не проколола твердую мозговую оболочку, затем опустите ее на один миллиметр в мозг.

Используя шприц Гамильтона, введите один микролитр раствора AAV, дозируя 0,1 микролитра за раз, как было показано ранее. Затем зашить вышележащую кожу на черепе, чтобы закрыть рану, используя шов из полиэстера Polysorb 4-0. Извлеките мышь из стереотаксической рамки и перенесите ее в чистую, предварительно нагретую клетку для животных в зоне восстановления.