虚血性脳卒中後の亜急性および慢性の時期に形質導入細胞におけるNeurod1の異所性発現を調査するためのAAVシステムとマウスモデル

私たちは、虚血性脳卒中の潜在的な治療法として、神経原性転写因子のAAV媒介性異所性発現を調査しています。私たちの焦点は、脳卒中後の亜急性期および慢性期にGFAP発現細胞におけるNeurod1の発現が、形質導入されたニューロンを増加させ、運動機能の改善と相関しているかどうかを確認することです。最近の知見は、皮質における遺伝子発現が同じAAVを持つ領域によって異なることを示している 私たちの研究では、GFAPプロモーターは運動皮質よりも内側前頭前皮質でより活性が高いことを発見し、形質導入された細胞が特定のプロモーターに対して異なる反応を示すことが示されました。

したがって、神経原性転写因子を含む治療法は、標的となる脳領域に合わせて調整する必要があります。現在の課題には、ET-1の注射速度や脳領域間の形質導入効率などの変数による脳卒中病変のサイズの変動が含まれます。脳領域やマウス系統にわたるAAV力価と親和性は、形質導入効率に影響を及ぼし、脳卒中後の異所性Neurod1発現の細胞評価に影響を与える可能性がある。

アストロサイトをニューロンに変換する際の主な課題は、再プログラムされたニューロンを既存のニューロンと区別することです。当研究室では、このリプログラミングが生体内で起こることを、新しいツールの開発により確認することを目指しています。最終的には、脳損傷動物のニューロン転写因子の異所性発現がどのように回復を促進するかを理解しようとしています。

まず、麻酔をかけた動物をチャンバーから取り出し、清潔な表面に置きます。マウスの手術部位を清掃した後、マウスの鼻を脳定位固定装置のノーズコーンに置き、イヤーバーを使用して頭蓋骨を安定させます。10番のメスの刃を使用して、目の中点の後ろから頭頂骨まで矢状面に平行に垂直に切開します。

次に、皮膚をそっと引っ込めて頭蓋骨を露出させます。次に、Qチップを使用して頭蓋骨の筋膜を乱し、頭蓋骨を乾かしてブレグマを完全に露出させます。高速定位固定装置ドリルを使用して、右感覚運動野の座標に3つのバリ穴を開けます。

次に、ドリルを長さ26インチの針を備えた0.375ゲージのシリンジと交換します。滅菌PBSに溶解した400マイクロモルのエンドセリン-1溶液1.5マイクロリットルをシリンジにロードします。少量のエンドセリン-1を放出して針の先端に滴を観察し、良好な流れを確保します。

針の先端を頭蓋骨を過ぎて、硬膜に穴を開けずに中央のバリ穴に下げます。位置が揃ったら、針を脳の1ミリメートル下に下げます。ハミルトンシリンジを使用して、一度に0.1マイクロリットルを分配し、次の0.1マイクロリットルを注入する前に1分間待ちます。

注射間および注射後に針が詰まるのを防ぐために、針の先端に滴が現れるまで少量のエンドセリン-1を放出します。.滅菌済みのQチップを使用して、注射前に余分なエンドセリン-1を拭き取ります。最後に、4-0滅菌縫合糸を使用して頭蓋骨の上にある皮膚を縫合し、傷を閉じます。

エンドセリン-1で処理したマウスに麻酔をかけた後、マウスを定位固定装置フレームに移します。手術用ハサミを使用して、傷口の縫合糸を切断します。鉗子でかさぶたを取り除き、皮膚を引っ込めて頭蓋骨を露出させます。

次に、滅菌済みのQチップを使用して頭蓋骨の表面を乾燥させ、バリ穴を見つけます。脳定位固定装置のマニピュレーターアームをセットします。長さ26インチの針が付いた0.375ゲージの注射器を運ぶニードルホルダーを置きます。

次に、3.4マイクロリットルのAAV溶液をシリンジにロードします。針の先端を頭蓋骨を過ぎて、最初の最も前方のバリ穴に下げます。針が硬膜に穴を開けないようにしてから、脳の1ミリメートルで下げます。

ハミルトンシリンジを使用して、前に示したように一度に0.1マイクロリットルを分注することにより、1マイクロリットルのAAV溶液を注入します。.次に、頭蓋骨の上にある皮膚を縫合し、4-0 Polysorb ポリエステル縫合糸を使用して傷を閉じます。マウスを定位固定装置フレームから取り外し、回復エリアの清潔で予熱された動物用ケージに移します。