אנו מודים לפ. וריג'ייזר, ג'יי יוהנסן ה., אוקהורה על נוגדנים וא. דבק, מרכזי המניות של בלומינגטון וינה לזבובים. תודה לסי ג'קסון על הצעות ודיונים מעוררים.

1. אוסף האשכים של דרוזופילה
הערה: זכרים צעירים (0-15 שעות לאחר eclosion) נחוצים לבדיקת תאי נבט דיפלואיד (כלומר, זרעונים וזרע).
<ol><li>בחר זבובים צעירים ככל האפשר כדי למזער את ההפרעה מפיתוח spermatids.</li>
	<li>הרדמה זבובים על ידי חשיפה קצרה פחמן דו חמצני ולהעביר כרית זבוב14,15.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ מנתח (הגדלה 10x), השתמש במלקחיים כדי להסיר את הראש.</li>
	<li>העבר 5 עד 10 זבובים ערופים ל 100 μL של חיץ של רינגר (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 מ"מ EDTA, מעכב חלבון מלא, pH 6.8) על שקופית זכוכית מצופה סיליקון על תמיכה ברקע שחור.</li>
	<li>עם ניתוח מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40, השתמש בזוג אחד של מלקחיים מספר 5 כדי להחזיק זבוב בין בית החזה לבטן, ועם מלקחיים אחרים, משוך את הבטן מבית החזה. לבודד במהירות את האשכים ואת הרקמות הסמוכות מן פגר זבוב15 ומניחים טיפה חדשה של חיץ של רינגר על אותה שקופית.</li>
	<li>לאחר כל האשכים מוכנים, לנקות את האשכים מן הרקמות הנותרות (בלוטת עזר ואברי מין חיצוניים).</li>
	<li>הסר מאגר עודף מהשחרור המכיל את האשכים המנותחים. בדרך כלל, השתמש פיפטה p200 עם קצה μL 10 מצויד על גבי קצה 200 μL. זה מאפשר הסרת עודף נוזלי דרך צמצם קטן. מניחים טיפה של 4% תיקון paraformaldehyde על גבי טיפה המכילה את האשכים מנותח, ולאחר מכן להעביר במהירות את האשכים לצינור המכיל פתרון קיבוע טרי.</li>
</ol>2. קיבעון פרפורמלדהיד
<ol><li>הכן 2 מ"ל של פתרון קיבוע ממש לפני השימוש: 600 μL של 4% paraformaldehyde מדולל מלוחים אגירה פוספט (PBS) עם 30 μL של NP40 20% בתוספת 1200 μL של heptane בצינור מיקרוצנטריפוגה סיליקון 2 mL. השתמש 4% paraformaldehyde ב PBS מוכן 600 μL aliquots ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. זהירות: הפטן ופרפורמלדהיד רעילים ויש לטפל בהם במכסה המנוע. יש להשליך אותם בהתאם לתקנות המכון המארח.</li>
	<li>העבר את האשכים באמצעות מיקרופיפט p200 עם קצה צמצם רחב לפתרון PFA / NP40 / heptane. לנער את הצינור למעלה ולמטה במשך 30 s ביד. ממשיכים לתקן את האשכים על מערבל סיבובי בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
	<li>עצרו את המיקסר הסיבובי והניחו את הצינור בארון תקשורת צינורי כדי לאפשר הפרדת פאזה ואת האשכים להתיישב לתחתית הצינור.</li>
	<li>הסר את כל heptane ואת הפתרון התיקון ולשטוף את האשכים במהירות שלוש פעמים עם 1x PBS.</li>
	<li>העבר לצינור בודד נקי של 200 μL. בצע את כל הדגירות בצינורות קטנים אלה כדי למזער את כמויות הנוגדנים המועסקים.</li>
	<li>הסר מאגר עודף באמצעות מיקרופיפט 200 μL עם P200 וגם קצה P10 מצורף. היזהר לא לשאוף אשכים.</li>
	<li>יש לשמור את האשכים ב-1x PBS על הקרח עד שכל הדגימות יהיו מוכנות.</li>
</ol>3. כתמי נוגדנים בתמיסה
<ol><li>להשליך את PBS ולהשאיר אשכים ב 0.3% PBS-T במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל קרום התא.</li>
	<li>טרום דגירה באותו חיץ בתוספת 5% סרום עיזים רגיל (NGS) במשך 1 שעות.</li>
	<li>הוסף 200 μL של הנוגדן העיקרי מדולל ב 0.3% PBS-T בתוספת 5% NGS(שולחן החומרים).</li>
	<li>דגירה הנוגדן העיקרי לילה ב 4 °C (או טמפרטורת החדר) עם תסיסה עדינה על נדנדה.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים ב 0.3% PBS-T במשך 15 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. אפשר האשכים להתיישב לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה.</li>
	<li>הוסף 200 μL של נוגדן משני מדולל 1:500 מהסדרה מצומד DyLight.</li>
	<li>דגירה הנוגדן המשני בתא כהה במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף 0.3% PBS-T במשך 15 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן חזרו על הפעולה עם 0.2% PBS-T ו-0.1% PBS-T, בכל פעם למשך 30 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. בצע שטיפה סופית ב 1x PBS במשך 30 דקות כדי להסיר את חומר הניקוי.</li>
	<li>הוסף 180 μL של פתרון DAPI ב 1 מיקרוגרם / מ"ל ב 1x PBS במשך 15 דקות. פתרון המניה הוא 10 מ"ג / מ"ל ב H2O. הימנעו מפתרון מלאי ב- PBS, אשר יכול להפחית את אות הכתמת DAPI על כרומטין מפוזר בזרע גדול יותר.</li>
	<li>לשטוף 3x במשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול על שקופית נקייה.</li>
	<li>שאפתן אשכים ולשים אותם על השקופית. שטיפת קצה הצמצם הרחב ב-0.1% PBS-T מונעת מה האשכים להידבק לקצה. הסר PBS עודף.</li>
	<li>הוסף טיפה (כ 100 μL) של Citifluor AF1.</li>
	<li>מניחים בעדינות כיסוי זכוכית על הרקמה, מקפידים להימנע מלכידה של בועות אוויר.</li>
	<li>לאטום את הכיסוי לשקופית באמצעות לק ברור.</li>
	<li>שים לב לשקופיות במיקרוסקופ.</li>
</ol>4. ניתוחי קולוקליזציה
<ol><li>השג תמונות קונפוקל. השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקל Zeiss LSM 710 (63x Plan שמן אפוכרומטי) ברזולוציית z של 0.5 או 1 מיקרומטר.</li>
	<li>בחר תאים שונים מתוך אשכים עצמאיים.</li>
	<li>יבא תמונות לתוכנת עיבוד (למשל, Imaris).</li>
	<li>הגדר את הגרעין לפי פילוח ידני כדי לא לכלול את הגרעינים השכנים. השתמש בתוכנת קולוק; הוא אוסף את מקדמי המתאם (PCCs) של פירסון בתוך כל אמצעי האחסון בין 2 פלואורופורים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinas-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 71-148 (1993).</li><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program.">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li><li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAD1:+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms.">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).</li><li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores.">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li><li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase.">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, 953-963 (2001).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila.">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li><li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development.">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).</li><li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup154,+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene.">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li><li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling.">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li><li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells.">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), 102-104 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis.">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li><li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation.">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li><li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מספק שיטה לאימונולאבלינג מוצלח של אשכי דרוזופילה בוגרים בכל ההר. כפי שדווח בהליכים אחרים יש להשתמש בזכרים צעירים (אפילו קיצרנו את הגיל לפחות מ -20 שעות לאחר eclosion) כדי למזער את נוכחותם של זרע מתפתח, אשר מסתכן בשיבוש הזרע. הניתוח צריך להיות מהיר ואת דילול הנוגדן חייב להיות מותאם כדי לייעל את יחס אות לרעש21,22,23. מכיוון ששימוש בפרוטוקולים אחרים, לא ראינו כתמים לאורך כל עומק האשכים, פיתחנו שיטת קיבוע המשלבת PFA יחד עם NP40 והפטן. עכשיו אנחנו משתמשים באופן שגרתי 600 μL של 4% paraformaldehyde ב PBS עם 30 μL של 20% NP40 ועוד שני כרכים של heptane. זה קריטי כדי לאפשר חדירה מספקת. הפחתת כמות NP40 עד 10 μL מפחיתה באופן ניכר את התיוג. כל השלבים הבאים בוצעו בהשעיה והחוצץ העודף הוסר על ידי מתן אפשרות לאשכים לרדת בעדינות לתחתית הצינור בכוח הכבידה. עבור השלב האחרון בהעברת דגימות לשקופית, אנו שוטפים את הקצה ב- 0.1% PBS-T כדי למנוע מה האשכים להידבק לקונוס. על פי תצפיות, פרוטוקול הכתם האימונוהיסטולוגי עובד היטב עם מגוון חלבונים גרעיניים, כולל הסמנים המשמשים כאן, כמו גם בדיקות של שינויים היפונטים אפיגנטיים, למין וגרעינים. נציין כי הפרוטוקול יכול לשמש גם עבור אשכי זחל, ובמקרה זה heptane צריך להיות מושמט, כפי שהוא עושה את האשכים קשה יותר להתאושש ללא פגע.
הפרוטוקול תוכנן במיוחד כדי לשמור על ערימות ניזוק של spermatocytes יחד עבור תיוג יעיל ואחיד של האשכים. הדגמנו את הפרוטוקול עם הזרעונים הגדולים בשלב מאוחר, שגרעינים המעוותים הופכים אותם בין התאים הקשים ביותר לשימור. יתר על כן, ב spermatocytes אלה תיוג גרעיני לעתים קרובות הופך לדלל כנראה בגלל הגודל של הגרעינים. לדוגמה, הוא ציין בדרך כלל כי DAPI או למין תיוג חזק יותר בתאים בשיא האשכים הופך בהדרגה חלש יותר ויותר לפזר כמו spermatocytes גדלים3,24. זה גם יכול להיות אחת הסיבות כי התפלגות של נוקליאופורינים תוארה רק בתאי שלב מוקדם יותר (זרע ו spermatocytes מוקדם)17.
תמונות מצוינות של immunostaining של זרע S5 Drosophila פורסמו, במיוחד עבור t-BRD ספציפי לאשכים וחלבונים דני25,26 באמצעות פרוטוקול נתרן deoxycholate 0.3% או בעקבות מעוך של הרקמה21,22. בידינו, סקווש מוביל לאי אחידות משמעותית של כתמים במעמקי האיבר וגם להקריב את המבנה 3D. גם אם השימוש של 0.3% נתרן deoxycholate נתן תוצאות טובות יותר, עדיין ראינו אי אחידות. לכן, אנו מעדיפים NP40 עבור הרבייה שלה ואיכות התיוג. התמונות confocal לאפשר שחזור של תמונות 3D עבור חלבונים גרעיניים. לדוגמה, יישמנו בהצלחה שיטה זו באמצעות בדיקות רבות ושונות, מאויר כאן על ידי תחום MINT תוך גרעיני, הקשורים קשר הדוק עם מסות כרומטין אוטוזומלי ורשת הנקבוביות הגרעינית. הפצה תלת מימדית מסקרנת של נקבוביות גרעיניות של גרעיני זרע אלה זמינה כעת למחקרים נוספים. התמונות מאפשרות כימות לשחזור של קולוקליזציה מזרעונים שונים מאותם אשכים ומאשכים שונים. למיטב ידיעתנו זו הפעם הראשונה שכימות מדויק על ידי מקדם המתאם פירסון נמדד על דגימות כאלה. זה נותן את הביטחון הנדרש עבור השוואת רמות חלבון immunolabelled מדויק של אשכים שונים.

אשכי דרוזופילה הם מודל בעל ערך לחקר האדריכלות הגרעינית. בתאי זרע מיטוטיים, הנפח הגרעיני תפוס במידה רבה על ידי כרומטין. תאים אלה עוברים ארבעה סבבים של חלוקה, לייצר ציסטה של 16 זרעונים ראשוניים. במהלך הימים הבאים, spermatocytes לעבור 6 שלבים התפתחותיים (S1-S6), גדל מאוד בנפח, בקירוב 20-פי1,2. הם גם משנים את המורפולוגיה הגרעינית שלהם. קווי המתאר של הגרעין, המתגלה על ידי למין Dm0, הופך לא סדיר ומראה invaginations עמוק1,3. זה מלווה בשינויים ושינויים נרחבים בביטוי גנים בארגון כרומטין1,4,5,6,7. הכרומוזומים הבין-פאזיים מוגדרים היטב בשלב S4-S5, ויוצרים שלוש מסות נפרדות המתאימות ל-2 האוטוסומים הדו-כיווניים העיקריים ולזוג ה-X-Y המעוגן בגרעין.
Mad1 היה מבודד במקור כמרכיב מרכזי במחסום המיטוטי (נבדק בשנת8). ב interphase, הוא מתואר כממוקם בעיקר על המעטפה הגרעינית, אלא גם בגרעין9,10,11. במבחן דרוזופילה, דיווחנו כי Mad1 בולט בגרעין, הקשור באופן אינטימי עם שתי מסות כרומטין אוטוזומליות גדולות ובמידה פחותה עם כרומטין XY. הגדרנו מבנה זה הקשור לכרומטין כ- MINT (טריטוריה תוך-גרעינית המכילה Mad1)12. ארבעה חלבונים אחרים היו קשורים MINTs ב spermatocytes: הגרעין Mtor / Tpr, פפטידאז SUMO Ulp1, חלבון מחסום מיטוטי Mad2 ו subunit של קומפלקס דמוי פוליקומב Raf212.
כדי להשלים את התיאור של MINTs, היינו צריכים להשתמש בנוגדנים והתמודדנו עם הבעיות הטכניות שנתקלו בדרך כלל עם immunostaining ב testis: חדירות ירודה וכתוצאה מכך אי אחידות משמעותית של כתמים בעומק האשכים, במיוחד בזרעונים הגדולים. ההכנות המודלגות הגבירו את הגישה לנוגדנים אך הובילו לתמונות דחוסות, הגבילו את הניתוחים התלת-ממדיים ומניעת מדידה של פלואורסצנטיות כמותית, כולל קולוקליזציה. הבעיה של חדירת נוגדנים יכולה להיות מטופלת גם על ידי סוכנים מחלחלים כגון 0.3% Na deoxycholate13, אבל הליך זה לא בידיים שלנו להניב תוצאות לשחזור. מכיוון שביצענו ניסויים רבים בתיוג משותף, חיפשנו לשפר את פרוטוקול ההחלחלה. השילוב של 1% NP40 בתוספת הפטאן הביא לשחזור רב יותר, במיוחד בחקר הזרעונים הגדולים.
פרוטוקול זה מבצע קיבעון ו immunostaining של האשכים בהשעיה, שיפור איכות המדגם, כמו גם שיפור הרבייה, ועיבוד זה מתאים מיקרוסקופיה confocal. השתמשנו בפרוטוקול כדי להגדיר טוב יותר את היחסים המרחביים של חלבוני מעטפה גרעינית מסוימים עם המבנים הגרעיניים של זרעונים גדולים. שיטה זו תאפשר חקירות טובות יותר של השינויים המלווים את התפתחות הזרע, למשל השינויים המבניים הדינמיים של הגרעין כולל כרומטין, גרעין והנקבוביות הגרעיניות.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Drosophila srains&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td><td></td><td></td><td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td></tr><tr><td>Mad1-GFP</td><td></td><td></td><td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td></tr><tr><td>Mtor RNAi&amp;nbsp;</td><td>VDRC</td><td>ID 110218</td><td>Vienna Drosophila RNAi Center</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td>Stock solution must be prepared in H2O</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fine Forseps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBP Wide Bore Pipette Tips</td><td>Fisherbrand</td><td>11917744</td><td>Wide aperture tip</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;0.2 mL Individual Tube</td><td>Thermo</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>2 ml micro centrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T3531-200EA&amp;nbsp;</td><td>Siliconized 2ml tube</td></tr><tr><td>Citifluor AF1</td><td>Citifluor</td><td>AF1</td><td></td></tr><tr><td>Dakopen&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Sigma</td><td>NS02L-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 4%</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G&amp;nbsp;</td><td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&amp;nbsp;; aliquot by 600 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo</td><td>14190094</td><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td></tr><tr><td>0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS 1X&amp;nbsp; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td></tr><tr><td>Triton X-100, for molecular biology,&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td>gba488</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Mouse anti-Mtor</td><td></td><td></td><td>1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td></tr><tr><td>Rat anti-Nup62</td><td></td><td></td><td>1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td></tr><tr><td>Guinea-pig anti-Ulp1</td><td></td><td></td><td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Raf2</td><td></td><td></td><td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td></tr><tr><td>DyLight conjugated series&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&amp;nbsp; rabbit or rat) as second antibodies</td></tr></tbody></table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

אשכי דרוזופילה הם מערכת מודל רבת עוצמה לחקר תהליכים ביולוגיים כולל ביולוגיה של תאי גזע, ארכיטקטורה גרעינית, מיוזיס והתפתחות זרע. עם זאת, immunolabeling של האשכים Drosophila כולו קשורה לעתים קרובות עם אי אחידות משמעותית של כתמים עקב חדירת נוגדנים. ההכנות מעוכות רק חלקית להתגבר על הבעיה שכן הוא מקטין את איכות 3D של הניתוחים. בזאת, אנו מתארים פרוטוקול הרכבה שלם באמצעות NP40 והפטן במהלך הקיבעון יחד עם immunolabeling במדיה נוזלית. הוא משמר את עוצמת הקול המתאימה למיקרוסקופיה קונפוקלית יחד עם תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו מראים דוגמאות שונות של שחזור תלת מימדי של גרעיני זרע מחלקים קונפוקליים. השחזור התוך-אשכים והבין-אשכים מאפשר כימות תלת-ממדי והשוואה של פלואורסצנטיות בין תאים בודדים מגנוטיפים שונים. השתמשנו ברכיבים שונים של מבנה MINT תוך-גרעיני (הטריטוריה הגרעינית התוך-גרעינית המכילה Mad1) כמו גם בשני רכיבים הקשורים למתחם הנקבוביות הגרעיניות כדי להמחיש פרוטוקול זה ויישומים שלו על התאים הגדולים ביותר של האשכים, הזרעונים S4-S5.

המכשול העיקרי להשגת כתמים נאותים של אשכי Drosophila הוא חדירה מוגבלת של נוגדנים, אשר נפתרה חלקית באמצעות הכנות מעוכות אבל במחיר של גרימת הגבלה של ניתוחים 3D (למשל ייצוג 3D או מידה של colocalization). הנוהל מאפשר תיוג אחיד ומשמר את נפח כל תאי האשכים. כאן מיקדנו את האיור של השיטה על ייצוג 3D של זרע S4-S5, כפי שהם התאים הגדולים ביותר ולכן רגישים יותר עיוות מן הסקווש. השתמשנו בסמנים גרעיניים שונים, כולל נוקלאופורינים ותיוג תחום MINT תוך-גרעיני (הטריטוריה הגרעינית התוך-גרעינית המכילה Mad1) המתואר על ידי החלבון המיטוטי Mad112. כמו MINTs יכול להתגלות על ידי מספר נוגדנים שונים, השתמשנו בהם כדי לבדוק את החוסן של הפרוטוקול עבור colocalization 3D כמותי, שיטה המחייבת רזולוציה מרחבית נכונה.
הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר רכישה של תמונות confocal באיכות מספקת כדי להיות מטופלים לאחר מכן עבור שחזור 3D. באיור 1Aמתוארים ארבעה קטעים סדרתיים סמוכים של שלב S5, המציגים חיסון מייצג של MINT (אימונולאבלינג Mad1 באמצעות מאיץ GFP באדום) יחד עם DAPI (בציאן). הכרומוזומים מאורגנים ב-3 הצבירים השונים העיקריים ומבנה MINT מוצג בפירוט רב סביב הדנ"א, הקשור באופן אינטימי לגושי הכרומטין האוטוסומליים. ההחלטה מאפשרת גם גילוי נוכחות של Mad1 בפריפריה הגרעינית, כמו גם בין מסות אוטוזומליות של כרומוזומים 2 ו -3. השתמשנו בתוכנת אימריס לייצוג תלת מימדי. המשטח הגרעיני הוגדר על ידי נוכחות ברמה נמוכה של Mad1 במעטפה הגרעינית (באפור) ו- MINT הוגדר על ידי הצטברות ברמה גבוהה של Mad1 בתוך הגרעין (באדום) יחד עם כתמי DAPI (בכחול)(איור 1A). סרט ההשבה התלת מימדית ממחיש היטב את עוצמת הקול ואת מערכת היחסים של Mad1 (במעטפת הגרעינית ובמטבעה) יחד עם הכרומוזומים בשלב S4-S5 זרעונים.
התפלגות הגרעינים תוארה רק בצורה גרועה בתאים אלה, ככל הנראה בשל הקושי לזהות אותם בגרעיני מעוותים גדולים אלה. ההתפלגות של Nup154 דווחה רק פעם אחת בעבר16 ו Nup153 ו Nup98 נחקרו רק זרעונים קטנים, זרע מוקדם17. שחזורים תלת-ממדיים של זרעונים S5 גדולים מוכתמים על ידי nucleoporin Nup62 ועל ידי יבוא β (תוצר של הגן ketel) היו ריאליים מיוצגים באיור 1C ואיור 1D, בהתאמה. רכיבים גרעיניים אלה הקשורים לנקבוביות מופיעים באופן לא אחיד מפוזרים על שפת הגרעין כנקודות בגודל לא סדיר. לדוגמה, β היבוא מתכנס סביב הכרומטין האוטוסומלי בדומה למקום שבו רשת למין כבר תוארה3. סוג זה של הפצה עם אזורים עשירים בנקבוביות ואזורים גדולים ללא נקבוביות תואר על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים בזרע מכרסמים18. הבנת השינויים בחלוקת למין וגרעיני הגרעין תסייע להבין את מבנה המעטפה הגרעינית בתאי G2 אלה ממש לפני מיוזיס זכר.
תוך שמירה על נפח 3D של התאים פרוטוקול זה גם מאפשר נוגדנים לחדור באופן אחיד לתוך העומק של כל תא, המאפשר ניתוח כמותי כגון קולוקליזציה. מקדם המתאם פירסון (PCC) הוא מדד מבוסס היטב. זה יכול לנוע בין +1 (המציין מתאם חיובי מושלם) ל -1 (מתאם שלילי מושלם)19. כדי להעריך את לוקליזציה של חלבונים שותפים MINT יחסית Mad1 ב spermatocytes, הערכנו בעבר את PCC על קטע אחד של 0.5 מיקרומטר באמצעות ImageJ ב S5זרעונים 12 (איור 2A,B). בדקנו את הפרוטוקול לעומק על ידי שימוש בקולוקליזציה תלת-ממדית על כל הגרעינים במקום רק על משטח. נפח הגרעינים הוגדר על ידי פילוח ידני וה- PCC נמדד באמצעות כלי הקולוקציה. ניתחנו שמונה גרעיני זרע S5, מאותם אשכים או אשכים שונים. איור 2B מציג ייצוג תלת-ממדי של גרעין ששימש למדידת ה-PCC. איור 2D מציג את המדידה של ה-PCC בשמונה גרעיני זרע S5 שונים משלושה אשכים שונים. ערכי PCC אינם שונים, משתנים בין 0.6 ו- 0.75, המציין ערך גבוה עבור colocalization. אלה אינם ניתנים להבחנה מה- PCC המוגדר במקטע יחיד. לפיכך, ההליך מאפשר תיוג אחיד לשחזור ושומר על נפח טוב של כל תאי האשכים.
מכיוון שהפרוטוקול מאפשר מדידה אמינה של קולוקליזציה מניסויים עצמאיים, הוא התיר השוואה של כתמים מגנוטיבים שונים של זבובים. זה הומחש כאן על ידי השוואה של זבובים זבובים WT וזבובים RNAi מדולדל עבור Mtor (נוצר על ידי ביטוי של קווי DSRNA UAS ואת הנהג באם-Gal4 להשיג דלדול משמעותי זרע מאוחר spermatogonia ו spermatocytes מוקדם20). כפי שתואר בניסויי קולוקליזציה, אשכים מרוקנים Mtor-RNAi ואשכים מסוגי בר נותחו ותוקנו יחד והתמונות הקונפוקל נרכשו תחת הגדרות קבועות. כיבוד תנאים אלה, ההשוואה של תאים בודדים הופכת לאפשרית. ראינו כי MINT מושפע יותר מאשר המעטפה הגרעינית על ידי אובדן Mtor כפי שמוצג על ידי נציג Mtor RNAi מדולדל (העליון) ו wt (התחתון) תאים (איור 3)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig01.jpg"> איור 1: איור של חיסון גרעיני זרע S4-S5 של דרוזופילה באמצעות בדיקות שונות. (A) תמונות של גרעין זרע שלב יחיד 5 immunostained עם נוגדן α-GFP (GFP המאיץ) גילוי מבנה MINT על ידי Mad1-GFP (אדום) יחד כדי כתמי DAPI (כחול). זה מראה בדיוק את היחסים בין Mad1 לבין שני מסות כרומטין אוטוזומלי (מיוצג כ כוכביות). Mad1 מזוהה גם במעט בפריפריה של הגרעין. כל התמונות הן הקרנות Z טוריות של ערימה של 3 (0.5 מיקרומטר) פרוסות קונפוקל רצופות. תמונות קונפוקל נרכשו על מיקרוסקופ confocal (63x, תוכנית שמן אפוכרומטי DIC עדשה אובייקטיבית). סרגלי קנה המידה הם 5 מיקרומטר. (B) מסגרת מתוך עיבוד סרט של אותו גרעין זרע. המשטח הגרעיני הוגדר על ידי ביטוי נמוך של Mad1 במעטפה הגרעינית (באפורים) ו MINT הוגדר על ידי ביטוי גבוה של Mad1 בתוך הגרעין (באדום). (A, B) הודפס מחדש באישור מאיור שפורסם בעבר (מ-12). (C)תמונה תלת-ממדית של גרעין זרע שלב 5 עם חיסון בו זמנית של Nup62 (צהוב) ו- MINT (זריקת GFP באדום). סרגל קנה המידה הוא 4 מיקרומטר.(D)3D תמונה של גרעין זרע שלב 5 עם immunostaining בו זמנית של יבואן-β קטל (צהוב) יחד עם DNA (DAPI בכחול). סרגלי קנה המידה הם <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61061/61061fig01large.jpg" target="_blank"></a> 5 מיקרומטר.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig02.jpg"> איור 2: כימות קולוקליזציה דו-ממדי ותלת-ממדי של Mad1 יחד עם Ulp1. (A) תמונות ממוזגות של גרעין זרע שלב 5 immunostained עם נוגדן המאיץ GFP גילוי Mad1 (ירוק) ועם נוגדן אנטי Ulp1 (אדום) מיוצג כערימה עבה 1 מיקרומטר של גרעין זרע. בצד ימין מצוין מקדם מתאם עוצמת פירסון מחושב באמצעות תוסף Coloc-2 ImageJ. ה-PCC הוערך ב-0.73 (הודפס מחדש באישור רייך12). (B) תמונה ממוזגת של גרעין זרע שלב 5 (המקביל לגרעין G בטבלה הסמוכה) immunostained עם נוגדן המאיץ GFP גילוי Mad1 (ירוק) ועם נוגדן אנטי Ulp1 (אדום) מיוצג בהקרנה 3D. נפח הגרעין הוגדר על ידי פילוח ידני. מימין, הטבלה מפרטת את מקדמי המתאם בעוצמת פירסון המחושבים על 8 זרעונים שונים (A עד H) מ-3 אשכים שונים (1 עד 3). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61061/61061fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig03.jpg"> איור 3: ניתוח כשל חיסוני של זרעונים שטופלו ב-Mtor RNAi בהשוואה לסוג הבר. תאים מרוקנים של Mtor באמצעות MtorRNAi (מזהה 110218) תאים (לוחות עליונים) ותאי סוג בר (לוחות נמוכים) היו מוכתמים עבור חלבוני Mad1, Raf2 ו Mtor. האשכים היו קבועים ומוכתמים יחד, רכובים על אותה שקופית ותמונות שנרכשו באותם פרמטרים. ניתן להבחין בין תאי RNAi לבין WT על ידי היעדרות או נוכחות בהתאמה של Mad1-GFP. האיור מייצג תחזיות מרביות של 4 x 0.5 μm ערימות. סרגל קנה המידה הוא 5 מיקרומטר (הודפס מחדש עם הרשאה מאיור שפורסם בעברב- 12). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61061/61061fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes at JoVE.com

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

4.1K Views.  Université de Paris, F 75006, Paris, France. אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

Video: Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

ניתוח בסיוע Transillumination של שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי של העכבר לניתוחים Immunostaining במורד הזרם

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדמיה זקופה של