עבודה זו נתמכה על ידי מענק (R01GM098394) מ-NIH והמכון הלאומי למדעי רפואה כלליים, כמו גם מענק 1,121,176 מקרן הלאומית למדע.

1. הכנת א אחר אשכים בשידור חי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBS על ידי המסת 8.0 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na 2 HPO 4, 0.24 גרם KH 2 PO 4 ב800 מיליליטר של מים מזוקקים ולהתאים את ה-pH 7.4. תביא את הנפח לL 1 ולעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את האשכים כ27 שתוארו קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ מכתים DAPI על ידי דילול 1 מ&quot;ג / מיליליטר מניות ל1 מיקרוגרם / מיליליטר PBS. השתמש בנייר אלומיניום כדי להגן על הצינור מפני אור ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בידוד האשכים, לטבול את הדגימה ב6 μl של חיץ מכתים DAPI על גבי מטען חשמלי חיובי שקופיות הזכוכית מיקרוסקופ ל10 דקות. אשכים לדבוק גם לשקופיות טעונות חיובי זמינות באופן מסחרי, המאפשרים מניפולציה קלה של הדגימה. שקופיות במטען חיובי קוולנטית שונו להקנות מטען חיובי סטטי למשטח הזכוכית. בדומה לציפוי polylysine, זה מקדם את האינטראקציה של wi האשכיםה פני השטח של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף DAPI העודף על ידי החלפת החיץ מכתים פעמיים עם 6 μl של PBS. השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם החיץ לאחר כל שלב כביסה. השתמש בזהירות כמו שלא להסיר בטעות את האשכים יחד עם החיץ במהלך כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 μl של PBS לדגימה. הסכום של חיץ המשמש צריך להיות מותאם לגודל של coverslip. הכרכים הניתנים בפרוטוקול זה הם עבור coverslip מ&quot;מ 18 x 18. אופציונאלי: מומלץ לנקב את האשכים קרובים את המיקום היחסי של סוג התא של עניין. זה יבטיח כי יש לחץ מינימאלי על תאים אלה במהלך השלב למעוך, ובכך שמירה על שלמותם. פירסינג של האשכים יכול להתבצע באמצעות סכין מנתחים חדים, נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום coverslip על גבי הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצוות של coverslip באמצעות לק ברור כדי להבטיח שהמאגר לא מתאדה מן דגימת החיה בעת imהזדקנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סמן כדי לייעד את העמדה של האשכים על מנת להקל באיתור הדגימה בשקופית ולהמשיך להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חיץ מכתים DAPI עודף על ידי החלפת החיץ פעמיים עם 6 μl של PBS. השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם החיץ לאחר כל שלב כביסה. היזהר שלא להסיר בטעות הדגימה יחד עם החיץ במהלך כל שטיפה. </li></ol> 2. מסלול ב &#39;הכנת אשכים קבועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ תקן על ידי דילול 37% מניות פתרון פורמלדהיד ב PBS לריכוז סופי של פורמלדהיד .3.7% ב 1x PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ מכתים DAPI על ידי דילול מניות 1 מ&quot;ג / מיליליטר DAPI עד 1 מיקרוגרם / מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את האשכים בירידת μl 6 של PBS על גבי מטען חשמלי חיובי שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני לכוון את האשכים באופן ליניארי או אחרת מועדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם PBS ולהחליף אותו עם 6 μl של תקןחיץ במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם חיץ תקן ולטבול את הדגימה ב6 μl של חיץ מכתים DAPI 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום coverslip מ&quot;מ 18 x 18 על גבי הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצוות של coverslip באמצעות לק ברור כדי להבטיח שהמאגר לא מתאדה מן הדגימה בזמן ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סמן כדי לייעד את העמדה של האשכים על מנת להקל באיתור הדגימה בשקופית ולהמשיך להדמיה. </li></ol> 3. מסלול ג הכנת אשכי immunostained siliconization coverslip: לטבול את coverslips מ&quot;מ מרובה 18 x 18 במגש קטן המכיל פתרון siliconizing דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת חדר מתחת למכסת מנוע קטר. ודא כי coverslips נחשפים באופן מלא ולא נערם על גב אחד את השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימה ב5 טיפת μl של PBS על coverslip siliconized. אוריינטאשכים כרצויים ולנקב את האשכים באמצעות אזמל חד. מניח בעדינות במטען חיובי שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית מעל coverslip, המאפשר PBS להפוך מפוזר באופן שווה בין coverslip והשקופיות. השתמש בפיסה קטנה של נייר סינון לפתיל משם עודפי החיץ בין coverslip והשקופיות. כחיץ הוסר על ידי נייר הסינון, העלייה בלחץ תהיה למחוץ את האשכים. צריכה להיות מוכנות דגימות רבות בו זמנית, כפי שחלקם עשוי להיות אבד או ניזוקו במהלך הפרוטוקול. חרט זכוכית ניתן להשתמש כדי לתייג את השקופיות אם סוגים שונים של דגימות יהיו מוכנים בו זמנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips 3x דקות 1 כל אחד במים, ואחריו 3x דקות 1 כל אחד ב70% אתנול, ולשטוף סופי ל1 דקות במים. לאפשר את coverslips siliconized אוויר יבש מתחת למכסת מנוע קטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק את השקופיות לתוך חנקן נוזלי ולאפשר את הדגימה להקפאה ל5-10 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מliquid חנקן באמצעות מלקחיים גדולים. השתמש באזמל כדי להסיר את coverslip במהירות. הדגימה צריכה להישאר בשקופית. היזהר שלא למרוח את הדגימה במהלך תהליך זה על ידי הזזה coverslip לאורך השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות במתנול prechilled בצנצנת מכתים Coplin הזכוכית ב -20 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השקופיות לצנצנת מכתים Coplin זכוכית המכילה אצטון prechilled ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שקופיות דקות 1 ב PBS בטמפרטורת חדר באמצעות צנצנת מכתים Coplin זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBST-B על ידי השלמת PBS עם 0.1% Triton-X100 ו1% סרום חלבון שור (BSA). 5% בסרום נורמלי מאותו מין המארח כנוגדנים משני (משלב 3.14) עשוי לשמש במקום BSA כדי להפחית את רעשי רקע המופקים משני נוגדנים ספציפיים מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות עבור 10 דקות בPBST-B בצנצנת מכתים Coplin זכוכית לחסום אתרים ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הבארות שלתא הלחות עם מים. לחות בתוך החדר תהיה למזער את האידוי של פתרונות נוגדן מהדגימה במהלך שלבי הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBST-BR ידי להשלים PBST-B עם 100 מיקרוגרם / מיליליטר RNase א RNase מדרדרת RNA בדגימה ומשמש גם כסוכן חסימה נוסף על ידי קליטה חזקה למשטח הזכוכית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חתיכת סנטימטר כ 1x1 של Parafilm על גבי הדגימה כדי להפיץ את פתרון הנוגדנים באופן שווה ולהגן על פתרון נוגדנים ממתאדים. סגור את תא הלחות ודגירת הדגימה בנוגדן הראשוני במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מPBST-B. השתמש בפיסת נייר סינון לייבש את האזור של השקופית סביב הדגימה, תוך שימוש בזהירות לא לייבש את הדגימה עצמו. לבסוף, במקום להחליק בתא הלחות עם הדגימה פונה כלפי מעלה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף של נוגדן ראשוני 100 μl בדילול מלא בPBST-BR על גבי המפרטimen (1:200 הוא בדרך כלל ריכוז התחלה טוב לנוגדני uncharacterized). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את הדגימה עם פיסת 1 סנטימטר x 1 כ של Parafilm ולסגור את תא הלחות. דגירה הדגימה בשני נוגדנים במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תא הלחות ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בעדינות Parafilm מהשקופיות. דגירה השקופיות במשך 5 דקות בPBST בצנצנת מכתים Coplin זכוכית בטמפרטורת חדר לשטוף. חזור על תהליך זה עבור סכום כולל של שלושה שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מPBST-B ולמקם אותם בתא הלחות עם הדגימה פונה כלפי מעלה. בעדינות להוסיף של נוגדנים משני 100 μl בדילול מלא בPBST-BR בחלק העליון של הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תא הלחות ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בעדינות Parafilm מהשקופיות. שוב, לשטוף 3x הדגימה במשך 5 דקות כל אחד בPBST בצנצנת מכתים Coplin זכוכית ואחריו 3x עבור 5 דקות כל אחד ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Kimwipe ונייר סינון כדי<html> לייבש היטב את פני השטח של השקופית, להיות זהיר, כדי למנוע מגע או ייבוש הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 μl של מדיה הרכבה לדגימה, מכסה בcoverslip נקי (לא מצופה סיליקון), ואת חותם קצוות עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סמן כדי לייעד את העמדה של האשכים על מנת להקל באיתור הדגימה בשקופית ולהמשיך להדמיה. </li></ol> 4. הערות הדמיה הדמיה יכולה להיות מושגת באמצעות זקופה או הפוכה מיקרוסקופ אור רגילה או מיקרוסקופ confocal. זה חשוב שיהיה מצויד במיקרוסקופ שלב בניגוד, במיוחד עבור ההדמיה של דגימות אשכים חיים (מסלול א &#39;). תכונה זו הפכה זמינה לאחרונה על מיקרוסקופים confocal. כאשר האשכים לפרוץ באופן ספונטני (המסלול א &#39;), הקצה (נובע אזור תא) נשמר בדרך כלל בשלמות, והוא קל לזיהוי, המספק סמן טוב בתחילה לאתר ולהשתמש לשם התמצאות. _content &quot;&gt; Centrioles הם מבנים קטנים למדי ויש לקחת תמונות ולכן באמצעות 63X או 100X יעדים, גורם זום של 4-6X, ורזולוציה של לפחות 512 x 512 פיקסלים במידת האפשר.

<ol>
	<li>Blachon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proximal+centriole-like+structure+is+present+in+Drosophila+spermatids+and+can+serve+as+a+model+to+study+centriole+duplication.">A proximal centriole-like structure is present in Drosophila spermatids and can serve as a model to study centriole duplication.</a> Genetics. 182, 133-144 (2009).</li><li>Hennig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+Drosophila.">Spermatogenesis in Drosophila.</a> The International journal of developmental biology. 40, 167-176 (1996).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+gene+regulation+during+Drosophila+spermatogenesis.">Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis.</a> Reproduction. 139, 11-21 (2010).</li><li>Davies, E. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+self-renewal+and+differentiation+in+adult+stem+cell+lineages:+lessons+from+the+Drosophila+male+germ+line.">Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from the Drosophila male germ line.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 137-145 (2008).</li><li>Belote, J. M., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplicated+proteasome+subunit+genes+in+Drosophila+and+their+roles+in+spermatogenesis.">Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis.</a> Heredity. 103, 23-31 (2009).</li><li>Xiao, X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+dynamics+during+spermatogenesis+and+its+significance.">Actin-based dynamics during spermatogenesis and its significance.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 8, 498-506 (2007).</li><li>Hennig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+proteins+in+the+spermatogenesis+of+Drosophila.">Chromosomal proteins in the spermatogenesis of Drosophila.</a> Chromosoma. 111, 489-494 (2003).</li><li>Wakimoto, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doubling+the+rewards:+testis+ESTs+for+Drosophila+gene+discovery+and+spermatogenesis+expression+profile+analysis.">Doubling the rewards: testis ESTs for Drosophila gene discovery and spermatogenesis expression profile analysis.</a> Genome research. 10, 1841-1842 (2000).</li><li>Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+centriole.">Building a centriole.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2012).</li><li>Blachon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+asterless+and+vertebrate+Cep152+Are+orthologs+essential+for+centriole+duplication.">Drosophila asterless and vertebrate Cep152 Are orthologs essential for centriole duplication.</a> Genetics. 180, 2081-2094 (2008).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+Centrioles.">Flies without Centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li><li>Mottier-Pavie, V., Megraw, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+bld10+is+a+centriolar+protein+that+regulates+centriole,+basal+body,+and+motile+cilium+assembly.">Drosophila bld10 is a centriolar protein that regulates centriole, basal body, and motile cilium assembly.</a> Mol Biol Cell. 20, 2605-2614 (2009).</li><li>Rodrigues-Martins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSAS-6+Organizes+a+Tube-like+Centriole+Precursor,+and+Its+Absence+Suggests+Modularity+in+Centriole+Assembly.">DSAS-6 Organizes a Tube-like Centriole Precursor, and Its Absence Suggests Modularity in Centriole Assembly.</a> Curr Biol. 17, 1465-1472 (2007).</li><li>Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Brunk, K., Franz, A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ana2+is+a+conserved+centriole+duplication+factor.">Drosophila Ana2 is a conserved centriole duplication factor.</a> J Cell Biol. 188, 313-323 (2010).</li><li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sas-4+provides+a+scaffold+for+cytoplasmic+complexes+and+tethers+them+in+a+centrosome.">Sas-4 provides a scaffold for cytoplasmic complexes and tethers them in a centrosome.</a> Nat Commun. 2, 359 (2011).</li><li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+nucleotide+status+controls+Sas-4-dependent+pericentriolar+material+recruitment.">Tubulin nucleotide status controls Sas-4-dependent pericentriolar material recruitment.</a> Nat Cell Biol. 14, 865-873 (2012).</li><li>Riparbelli, M. G., Callaini, G., Megraw, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+persistence+of+primary+cilia+in+dividing+Drosophila+spermatocytes.">Assembly and persistence of primary cilia in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Dev Cell. 23, 425-432 (2012).</li><li>Maines, J. Z., Wasserman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+the+meiotic+Cdc25+protein+Twine+by+the+Dazl+orthologue+Boule.">Post-transcriptional regulation of the meiotic Cdc25 protein Twine by the Dazl orthologue Boule.</a> Nat Cell Biol. 1, 171-174 (1999).</li><li>Herrmann, S., Amorim, I., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+POLO+kinase+is+required+at+multiple+stages+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">The POLO kinase is required at multiple stages during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Chromosoma. 107, 440-451 (1998).</li><li>Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+asymmetric+stem+cell+division+by+the+APC+tumor+suppressor+and+centrosome.">Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome.</a> Science. 301, 1547-1550 (2003).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+Recruits+PCM+to+the+Sperm+Centriole,+but+Is+Dispensable+for+Centriole+Duplication.">Drosophila Spd-2 Recruits PCM to the Sperm Centriole, but Is Dispensable for Centriole Duplication.</a> Curr Biol. , (2007).</li><li>Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Wainman, A., Gergely, F., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ana3+is+a+conserved+protein+required+for+the+structural+integrity+of+centrioles+and+basal+bodies.">Ana3 is a conserved protein required for the structural integrity of centrioles and basal bodies.</a> J Cell Biol. 187, 355-363 (2009).</li><li>Giansanti, M. G., Bucciarelli, E., Bonaccorsi, S., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+SPD-2+Is+an+Essential+Centriole+Component+Required+for+PCM+Recruitment+and+Astral-Microtubule+Nucleation.">Drosophila SPD-2 Is an Essential Centriole Component Required for PCM Recruitment and Astral-Microtubule Nucleation.</a> Curr Biol. , (2008).</li><li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome.">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat Commun. 2, 243 (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+misorientation+reduces+stem+cell+division+during+ageing.">Centrosome misorientation reduces stem cell division during ageing.</a> Nature. 456, 599-604 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> J. Vis. Exp. , e2641 (2011).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-174 (1993).</li><li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J Cell Sci. . 107 (Pt. 12), 3521-3534 (1994).</li><li>White-Cooper, H., Schafer, M. A., Alphey, L. S., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+post-transcriptional+control+mechanisms+coordinate+the+onset+of+spermatid+differentiation+with+meiosis+I+in+Drosophila.">Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila.</a> Development. 125, 125-134 (1998).</li><li>Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+inheritance+of+mother+versus+daughter+centrosome+in+stem+cell+division.">Asymmetric inheritance of mother versus daughter centrosome in stem cell division.</a> Science. 315, 518-521 (2007).</li><li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytodifferentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Electron Microscope Study. , (1971).</li><li>Baker, J. D., Adhikarakunnathu, S., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory-defective,+male-sterile+unc+mutants+identify+a+novel+basal+body+protein+required+for+ciliogenesis+in+Drosophila.">Mechanosensory-defective, male-sterile unc mutants identify a novel basal body protein required for ciliogenesis in Drosophila.</a> Development. 131, 3411-3422 (2004).</li><li>Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J., Blachon, S., Polyanovsky, A., Schatten, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Centrosome: Cell and Molecular Mechanisms of Functions and Dysfunctions in Disease. , (2012).</li><li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+SAS-6+multimer+is+a+core+centriole+building+block.">Self-assembling SAS-6 multimer is a core centriole building block.</a> J Biol Chem. 285, 8759-8770 (2010).</li><li>Hassell, J., Hand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+fixation+with+diimidoesters+as+an+alternative+to+aldehydes.+I.+Comparison+of+cross-linking+and+ultrastructure+obtained+with+dimethylsuberimidate+and+glutaraldehyde.">Tissue fixation with diimidoesters as an alternative to aldehydes. I. Comparison of cross-linking and ultrastructure obtained with dimethylsuberimidate and glutaraldehyde.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 223-229 (1974).</li><li>Pisano, C., Bonaccorsi, S., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kl-3+loop+of+the+Y+chromosome+of+Drosophila+melanogaster+binds+a+tektin-like+protein.">The kl-3 loop of the Y chromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein.</a> Genetics. 133, 569-579 (1993).</li></ol>

גישה חופשית לפרסום זה נתמכה על ידי Leica Microsystems.

לומד ביולוגיה centrosome באשכים לטוס באמצעות סמנים גנטי centrosomal מתויגים הוא שיטה יעילה להערכת תפקוד ופעילות centrosome בשני הקשר wild-type ו מוטציה. בפרט, המסלול מתאים לסינון מהיר של ליקויים centrosomal כגון מום, misegregation, חוסר יציבות, או אורך חריג במאמץ לזהות מוטציות חדשות. יתר על כן, cilia spermatid בהכנות חיות יישאר ניעה כ 15 דקות לאחר הנתיחה והשימוש באשכים חיים במסלול א &#39;מאפשר גם תנועתיות זרע להיות לטפל בקלות. מאז הפעילות של cilia ניעתי זרע קשור באופן ישיר לתפקוד centrosome, ניתן לבצע מבחני כדי לקבוע את ההשפעות של מוטציות centrosomal שונות על תפקוד הריסים. מסלול ב &#39;יכול לשמש לתצפיות ספציפיות יותר במיוחד כאשר הנתונים סטטיסטיים נדרשים כגון לספירת מספר centrioles לכל תא ואו מספר התאים לציסטה. מסלול C הוא הכי useful לתצפיות מפורטות הדורשות צביעה עם נוגדנים. דוגמאות כוללות תיוג של סוג תא מסוים, כגון תאי גזע, מכתים של חלבון שאין לו תג זמין כגון טובולין acetylated, או כדי לאמת את העדר או mislocalization של חלבון שבעבר מוטציה. כאשר ההדמיה centrosomes ומבנים הקשורים בcentrosome, באמצעות סמנים גנטי מתויגים ולא נוגדנים היא לא רק באופן ניסיוני קלה יותר, אלא גם מספק תוצאות חזקות יותר ושחזור. לכן, השימוש בחלבוני centrosomal גנטי מתויגים הוא גישה אמינה לניתוחים מכניסטית וכמותיים הדורשים סט נתונים גדול. לדוגמא, השימוש בסמנים גנטי centrosomal מתויגים כבר בעל ערך במיוחד עבור כימות של אורך centriole. ניתוח כזה גילה כי מוטציות שונות יכולות להיות מסווגת לשתי קטגוריות המבוססות על ההשתנות באורך centriole. קטגוריה אחת כוללת מוטציות שchanאורך centriole ge אך אינו משפיע על סטיית תקן 1 והקטגוריה השנייה כולל מוטציות שמשפיעות הן אורך centriole וסטיית התקן באורך 11. נתונים כמותיים מסוג זה יכול לספק תובנות שימושיות לפונקציה של גנים centrosomal מסוימים. מוטציות centrosomal כי תערוכת אורך centriole פגום עם עלייה בסטיית התקן עשויות להיות בשל התערערות מבנה centriolar. עם זאת, אורך centriole פגום עם שגיאה סטנדרטית רגילה עשוי להצביע על כך שהמוטציה אינה מבנית לערער centriole ויש יותר סיכוי להיות בגלל שינוי במנגנון ויסות שליטה אורך centriole. בשל חוסר עקביות בimmunostaining, ניתוחים כמותיים קשים עם השימוש בסמני נוגדן לבד. Centrosome הוא מבנה גדול ומורכב חלבוניים ורבים מהחלבונים שלה נמצאים רק בתוך הפנים שלה. שימוש centrosomal גנטי מתויגסמנים ולא הנוגדנים מאפשר לתייג באופן עקבי ברכיבים פנימיים של centrosome שאפיטופים עשויים להיות נגיש בדרך אחרת לסמני נוגדן. לדוגמא, מחקרי לוקליזציה של Bld10 באמצעות נוגדנים מוצאים את החלבון להיות מועשרים בקצות דיסטלי ופרוקסימלי של centriole 13, בעוד Bld10-GFP מציג התפלגות אחידה יותר 1. עם זאת, חשוב גם לקחת בחשבון את רמת ביטוי של חלבון גנטי בתיוג מסוים, כמו זה יכול להשפיע על חלוקת חלבון. לוקליזציה של Sas-4-GFP ו-SAS-6-GFP הביעה תחת אנדוגני מוגבל לקצוות הפרוקסימלי של centriole 1,16,35 מצד השני, Sas-4-GFP ו-SAS-6-GFP הביעו תחת אמרגן היוביקוויטין חזק הם נקודתיים לאורך כל אורכו של 12,14 centriole. שיקול חשוב נוסף הוא ההשפעה של התג הגנטי על תפקוד חלבון. ניתוח אם חלבונים גנטיים מתויגים הם פונקציונליים יכול להיות tesטד על ידי החדרת החלבון המהונדס לתוך רקע מוטציה ובודק אם החלבון המהונדס מציל פנוטיפ מוטנטי. קיבוע של האשכים דרוזופילה יכול להתבצע באמצעות מגוון של fixatives הכימי. כאן, אנו מתארים קיבעון עם שני פורמלדהיד (מסלול ב &#39;) ומתנול אצטון (המסלול C). עם זאת, גם מקבע ניתן להשתמש לסירוגין ומאז fixatives השונים עלול לשבש כימי אפיטופים נוגדנים מקומיים, מבחר של המקבע המתאים לimmunostaining חייב להיקבע באופן ניסיוני. Fixatives ותנאי הדגירה הבאים בדרך כלל מועסקים: פורמלדהיד .3.7%, 5 דקות בטמפרטורת חדר; מתנול, 15 דקות ב -20 מעלות צלזיוס; אצטון, 10 דקות ב -20 ° C; מתנול, 15 דקות ב -20 ° C. אחרי אצטון, 30 שניות ב-20 מעלות צלזיוס; אתנול, 20 דקות ב -20 ° C. למרות קיבעון עם אצטון, מתנול, אתנול ואינו דורש צעד permeabilization מורחב עבור immunostaining, wi קיבעוןפורמלדהיד ה צריך להיות מלווה דגירה 1 שעות בPBST-B בטמפרטורת חדר כדי permeabilize קרום תא ומאפשר גישת נוגדנים לאפיטופים תאיים. יתר על כן, fixatives מסוים הם מתאים יותר לאנטיגנים מסוימים. לדוגמא, פונקציות פורמלדהיד גם לקיבוע של חלבונים קטנים, ואילו מתנול ואצטון הם מתאימים היטב לקיבעון של קומפלקסים מולקולריים גדולים 36. Immunostaining של האשכים דרוזופילה כבר תואר בעבר על קיום מבני הכרומטין וmicrotubule שלד תא 29,37. כאן (המסלול C), ההליך כבר מותאם לניתוח של מבני centrosomal המכילים חלבונים גנטיים מתויגים. אנו מספקים תיאור מפורט של הליך זה כדי להנחות את האנשים שהם חסרי ניסיון בעבודה באשכי דרוזופילה. הליך זה כולל גם שינויים כדי לשפר את השימור ומורפולוגיה של אשכים, כגון על ידי שימוש שלiliconized coverslips ומטען חשמלי חיובי שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית.

האשכים דרוזופילה הם מערכת איברים מתאימה ללמוד מגוון רחב של תהליכים תאיים והתפתחותית וכבר נסקרו בהרחבה לאורך השנים 1-9. כתב יד זה מתמקד בשימוש באשכי דרוזופילה ללמוד centrosome, אברון סלולארי שימור. כמו במערכות אחרות, centrosome של פונקצית האשכים דרוזופילה במיטוזה, מיוזה, וciliogenesis 10. Centrosomes מורכב של זוג מבנים מבוסס microtubule המכונים centrioles המוקף ברשת חלבון מורכבת התייחסה לחומר pericentriolar כ( PCM). צמד centriole מורכב מcentriole אמא מבוגרת וcentriole בת צעירה יותר. כתא מתקדם לקראת מיטוזה, שני centrioles להפריד, לשכפל, ולרכוש כמות גדולה של PCM כדי ליצור סופו של דבר שני centrosomes מובחן. Centrosome מכיל centriole אמא המקורית שמכונה centrosome האמא וcentrosome מכיל centriole הבת המקורית שמכונה centrosome הבת. האשכים דרוזופילה הם אידיאליים ללימוד הבסיס המולקולרי של הביולוגיה centrosome ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור מגוון רחב של סיבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוב חלבוני דרוזופילה הנדרשים לביולוגיה centrosome באשכים הם נשמרים בין אאוקריוטים, המצביעים על כך תובנה רלוונטית לביולוגיה centrosome בבני אדם ומינים אחרים יכולה להיות שנרכשו על ידי לימוד centrosome בדרוזופילה אשכים 1,11-14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח שעבר מוטציה בדרוזופילה מספק יתרון משמעותי שכן, שלא כמו דגמים רבים אחרים, מוטציות centrosomal בדרוזופילה אינן עובריים קטלניות, ובכך מאפשרות לניתוח גנטי קלאסי של תפקוד centrosome. תכונה ייחודית זו של דרוזופילה היא בשל נוכחותם של תרומה אימהית שנמשכת בשלבים הקריטיים של develo העובריpment. 1,11-14. לכן, אפשר) מוטציות מחקר שמונעות לחלוטין היווצרות centrosome וב) ללמוד את גורלו של centrosome נורמלי שהוקם בעובר המוקדם על ידי תרומה אימהית בהקשר מוטציה לאחר התרומה האימהית מוצתה עד תום (העיקרון של השיטה מתואר ב11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transgenes פונקציונלי עם תגי ניאון מקודדים גנטי שתווית centrosome זמין. רבים מקווים אלה להשתמש אמרגנו של החלבון לנהוג שעתוק של transgene כדי למנוע ביטוי יתר חזק. הדבר חשוב במיוחד משום שביטוי יתר של חלבונים לעתים קרובות תוצאות חפצים המפריעים לניתוח של תפקוד centrosome 1,11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centriole וcentrosome הם ייחודי ארוך לאורך spermatogenesis דרוזופילה, ובכך מאפשר לניתוח מהיר וקל של centrosome ידי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעדים רצופים בתאי זרע וב centrosomeiology מאורגן כרונולוגי לאורך האשכים, שמתחיל בקצה האשך עם centrosomes של תאי גזע זרע ומסתיים בחלק התחתון של האשכים עם גודל מופחת centrosome ופעילות בתאי זרע בוגרים (איורים 1 ו -2). זה מאפשר זיהוי קל וניתוח של פונקצית centrosome במהלך שלבים שונים של התפתחות זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשכים בקלות גזורים מזחלי זכר, גלמים, ומבוגרים 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך spermatogenesis, centrosome וcentrioles להמשיך דרך הלחנה מרובה, מבנית ותפקודיות מדינות לתפקד במיטוזה, מיוזה, והיווצרות cilium. במהלך תהליכים אלה, מרכיב centrosome, כפילויות, נודד, עוגנים לחלקים ספציפיים של התא, מתבגר, חילוק, ויוצר cilium. יתר על כן, centriole של spermatid הבוגר מוליד מבשר centriolar בשם PCL 1. גם בspermatid הבוגר, centrosome עובר תהליך גalled הפחתת centrosome לפיה היא מאבדת את מרכיבים רבים של PCM וcentriole (איורים 1 ו -2). לפיכך, מחקרים באשכים לאפשר אחד כדי לטפל בהיבטים רבים של החיים centrosome כגון שמירת centrosome בתאי הגזע, שכפול centriole, יציבות centriole, התארכות centriole, הפרדה והפרדת centriole, גיוס PCM, ciliogenesis, היווצרות PCL, הפחתת centrosome, ו התגרענות microtubule האסטרלי בין יתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, מחקרים של הביולוגיה centrosome נעזרים במאפיינים ידועים האחרים של דרוזופילה שהפכו אותו לאורגניזם מודל מועדף למחקרים ביולוגיים. אלה כוללים זמן דור קצר, קל גנטיקה, כמו גם mutagenesis האקראי ומכוון באתר. </li></ol> יחד, המאפיינים שצוינו לעיל של האשכים דרוזופילה מספק מודל שבו centrosome ניתן ללמוד על ידי הדמיה קלה, מהירה, ומפורטת. הטכניקות מתוארותבמאמר זה יושמו כדי לחקור היבטים רבים של הביולוגיה centrosome הכוללים השקעת centriole 11, שכפול centriole 15, גיוס PCM 16, הרגולציה centrosome 17, וciliogenesis 18. טכניקות אלה גם יושמו ללמוד centrosome בתחומים אחרים של ביולוגיה כגון ויסות meiotic 19, הרכבה ציר 20, ופעילות centrosome בתאי גזע סימטרי חלוקת 21 בקרב רבים אחרים. הדמיה של אשכים בהתחלות centrosome עם קבלת זבובים המבטאים חלבוני centrosomal גנטיים מתויגים ולבודד את האשכים מזחלי זכר, גלמים, או זבובים בוגרים. זבובים אלה זמינים ממספר קבוצות מחקר 1,11,15,22-25. האשכים הזחל מכילים את כל השלבים של תאי זרע לפני מיוזה ושימושיים בעת ניתוח מוטציות שאינן קטלניים בגולם או מבוגר. עם זאת, גלמים המאוחר או אדיו צעיריםהאשכים LT הם חזקים ביותר ומכילים את כל מראש ופוסט meiotic השלבים של תאי זרע, ובכך הופכים אותם עדיפים לניתוח. מאז את מספר תאי זרע יורד ככל שהגיל לטוס, השימוש באשכים למבוגרים מתאים גם ללימוד centrosome בהקשר של הזדקנות. 26. שיטה של בידוד אשך מזבובים בוגרים כבר תוארה בעבר 27. הדמיה של centrosomes ותפקודם באשכי דרוזופילה יכולה להיות מושגת באמצעות שלושה מסלולים נלווים שמוצגים כאן (איור 3). בחירת המסלול שהוא מתאים ביותר תלויה באופי השאלה החוקר הוא פונה. המסלול כולל הדמיה של אשכים בשידור חי. זה המהיר ביותר מבין שלושת המסלולים, אבל יכול להיות מיושם רק כאשר דגימות לא צריכה להישמר וכאשר immunostaining אינו נדרש. במסלול א &#39;, אשכים הם רכובים (שלמים, פירסינג או לחתוך) בשקופיותומעך בזהירות מתחת coverslip כדי ליצור שכבה אחת של תאים לזיהוי בקלות. לאחר מכן התאים מדגימים בעזרת שני מיקרוסקופ שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. השימוש בשלב בניגוד חשוב במיוחד עבור הניתוח של האשכים דרוזופילה משום שהוא חושף מידע סלולארי שאינו גלוי עם צורות אחרות של תאורה משודרת ובכך מאפשר זיהוי מהיר של שלבים שונים של התפתחות זרע 28,29. עם זאת, יש לעקוב אחר שני חסרונות עיקריים. ראשית, את השלמות הצורנית של תאים היא לעתים קרובות בסכנה ברגע שהאשכים מקרע. שנית, תאים מבולבל לעתים לנוע בתוך הדגימה, מה שהופך את ההדמיה של שכבות confocal מרובות בתוך אזור מוגדר קשה. על מנת לקדם את הניתוח של סוגי תאים ספציפיים, אשכים עשויים להיות פירסינג או לחתוך כדי לכוון את דרך קרעי האשך כזה שמועך תחת מינימאלי coverslip משפיע על המורפולוגיה של סוג התא של עניין. מסלול ב &#39;כולל קיבוע כימי של האשכים. מסלול זה דורש סכום ביניים של זמן להכנת דגימה ויש לו היתרון כי דגימות קבועות ניתן לשמור לניתוח מאוחר יותר. יתר על כן, קיבוע משמש להכנת מבנים תאיים נוקשה יותר, צמצום תנועה של הדגימה במהלך הדמיה. עם זאת, במיקרוסקופ שלב בניגוד הופך להיות הרבה פחות אינפורמטיבי לאחר קיבוע כימי, מה שהופך כמה שלבים של התפתחות הזרע קשה לזהות. מסלול C הוא הזמן האינטנסיבי ביותר, אבל יש יתרון הנוסף שמבנים הסלולר הם קבועים וimmunostained, המאפשר ההדמיה של חלבונים שאינם זמינים עם תגי הגנטיקה המתאימים. יש נוגדנים רבים זמינים באופן מסחרי והן מקבוצות מחקר שונות לimmunostaining centrosomes ומבנים הקשורים בcentrosome באשכי דרוזופילה.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/ Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments/Description</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D1306</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positively Charged Slides</td>
 <td>AZER Scientific</td>
 <td>EMS200A+</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feather Microscalpel</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>72045-30</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37% Formaldehyde or Paraformaldehyde</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP531-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
 <td>Boston Bioproducts</td>
 <td>BM-220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18x18 mm coverslips number 1.5</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48366 205</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nail Polish</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>72180</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>SL2-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>A412-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>A949-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton-X100</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T9284-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Jackson ImmunoResearch</td>
 <td>001-000-162</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse A</td>
 <td>5 prime</td>
 <td>2900142</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter paper</td>
 <td>Whatman</td>
 <td>1001-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass engraver</td>
 <td>Dremel</td>
 <td>290-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCS SP5 confocal microscope</td>
 <td>Leica </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounting Media</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>17985-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immuno Stain Moisture Chamber, Black</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62010-37</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70315</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

imaging centrosomes in fly testes

Centrosomes הם נשמרים האברונים מבוססי microtubule מבנו ותפקודו שינוי באופן דרמטי לאורך מחזור התא והתמיינות תאים. Centrosomes הם חיוני כדי לקבוע את ציר חלוקת תאים במהלך מיטוזה וכדי nucleate cilia בשלבי ביניים. זהותם של החלבונים המתווכים שינויים הדינמיים אלה נותר ידועים רק באופן חלקי, ותפקודם של רבים מהחלבונים שהיו מעורבים בתהליכים אלה הוא עדיין בסיסי. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאי זרע דרוזופילה מספק מערכת רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לתפקוד והיווצרות centrosome כמו גם לקבל תובנות לתוך הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליכים הקשורים לcentrosome. דרוזופילה היא אורגניזם מודל גנטי שהוקם בו מוטציות ב ניתן להשיג בקלות גנים centrosomal בקלות ובנותחו. יתר על כן, ההתקדמות ברגישות וברזולוציה של מיקרוסקופ אורפיתוח של סמני centrosomal מתויגים גנטי חזקים הפכו את היכולת להשתמש באשכי דרוזופילה כמערכת מודל פשוטה ונגישה ללמוד centrosomes. מאמר זה מתאר את השימוש בסמנים גנטי centrosomal מתויגים לבצע מסכי גנטיים למוטציות centrosomal חדשות ולקבל תובנות לתוך התפקיד הספציפי של גנים שזוהו לאחרונה.

Centrosomes לעבור טרנספורמציות מורפולוגיות ופונקציונליות מרובות במהלך spermatogenesis. תכונה זו של תאי זרע הופכת את האשכים מערכת שימושית ללמוד היבטים שונים של הביולוגיה centrosome. תהליך נצפה בקלות אחד כזה הוא התארכות centrosome. בspermatogonia, סמן centriolar Ana1-GFP מסמן (איור 4 א) 0.6 מיקרומטר centriole הארוך. centriole זה מתארך במהלך spermatogenesis ומגיע באורך של 2.5 מיקרומטר בspermatids כמעט בוגר. מאז centrioles בזרע דרוזופילה הוא ארוך באופן ייחודי, הדמיה יכולה לשמש כדי להפוך את ההצהרות כמותיים לגבי התארכות centrosome (איור 4). ניתוח של אורך centriole יכול גם להתבצע ברקע מוטציה ומוטציות שונות זוהו לשנות צמיחת centriole (איור 5). דוגמאות לכך הן תמיד מוקדם (aly) ותותח (יכול), מוטציות שarresתאי זרע לא לפני תחילת המיוזה 30 אך לא לחסום את התארכות centriole. במוטציות האלה, centrioles של spermatocyte הבוגר לגדול לכ ~ מיקרומטר 2.4 בהשוואה לcentrioles של תאי שליטה בי להגיע למקסימום של 1.8 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1highres.jpg"/> איור 1. תאי זרע וביולוגיה centrosome. א) פיתוח של תאי גזע וSpermatogonia. כל תאי הזרע שמקורם בתאי גזע נמצאו בקצה הקודקוד של האשכים. כל תא גזע מתחלק סימטרי כדי ליצור תאי גזע שיורש את centrosome אמו ואב זרע אב שיורש את centrosome בת 31 ב. כצורת Spermatogonia, הם הופכים להיות מוקפים 2 תאי ציסטה, שממשיכים להקיף את Spermatocytes וSpermatids ברחבי spermatogenesis. פעמים פער Spermatogonia 4 לייצר 16 Spermatogonia, המכיל שתי centrioles. B) פיתוח Spermatocytes ומיוזה. במהלך פיתוח Spermatocyte, centrioles לשכפל פעם נוספת כדי לייצר ארבע centrioles מאורגן בשני זוגות לכל תא ו64 centrioles לציסטה. מוקדם במהלך התפתחות Spermatocyte, כל centriole עובר לקרום הפלזמה, רציפים לזה, ומתארך ליצור מבנה שדומה לcilium עיקרי 18,32-34. בSpermatocytes הבוגר, אורך centriole מגיע ~ 1.8 מיקרומטר. Centrosomes לשחק תפקיד חיוני במיוזה. במהלך אני מיוזה, זוגות centriole שעדיין מחוברים למהלך קרום פלזמה לכיוון מרכז התא וליצור invaginations קרום תא בקצה הדיסטלי שלהם. PCM סביב centrioles גדל, nucleates microtubules האסטרלי, וcolocalizes עם מוט הציר. במהלך המעבר למיוזה השני, צמד centriole מפריד כך שרק centriole בודד presenלא בכל מוט ציר. C) Spermiogenesis. בסוף המיוזה השני, יש לו את סיבוב המוקדם Spermatid centriole אחד מצורף קרום הפלזמה invaginated. נגזר המיטוכונדריה עגולה גדול נמצא בקרבת הגרעין ומאוחר יותר מתחיל להאריך לאורך axoneme גדל בSpermatids העגול בהמשך. במהלך spermatogenesis, צורות axoneme ומתארך בתוך הציטופלסמה. בנוסף מבנה centriolar חדש המכונה PCL (הפרוקסימלי Centriole כמו) מופיע ליד centriole קיים מראש 1. בסופו של תאי זרע, תאי שיתוף ציסטה נפוצה להפריד אחד מהשני כדי להפוך זרע נעים לבגרות מלאה. דיאגרמות של פיתוח Spermatocyte (B) וSpermiogenesis (C) מתארת ​​רק תא אחד מתוך 16 Spermatocytes ו64 Spermatids, בהתאמה לציסטה, ולא מתארת ​​את תאי ציסטה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50938/50938fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גדול</a><html> דמות r. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2highres.jpg"/> איור 2. אשכי דרוזופילה. כיסוי של מיקרוסקופ שלב בניגוד וקרינת ה-GFP של אשך כל ההר המבטא את הסמן הפאן centriolar אנה-1-GFP. האזור נפרד המתאים ללוחות 1-3 של איור 1 מופרדים על ידי קו אדום מקווקו) בתאי גזע וSpermatogonia, B) Spermatocytes ומיוזה, C) Spermiogenesis. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3.jpg" alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3highres.jpg"/> איור 3. מסלולים לקראת centrosomes ההדמיה בדרוזופילה אשכים. : לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4.jpg" alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4highres.jpg"/> איור 4. Centrosome התארכות במהלך spermatogenesis. א) כל שלב מציג תמונת שלב בניגוד (משמאל), תמונת הקרינה (באמצע), ותמונה מוגדלת של centrosome (מימין). תמונת שלב בניגוד מדגימה את שלב תא המסוים המבוסס על המיקום והמורפולוגיה של התא, גרעין, הגרעינון, ומיטוכונדריה. תמונת הקרינה תערוכות DNA מוכתם בDAPI (כחול). תמונת centrosome תערוכות centrosomes מתויג על ידי Asterless-GFP (ASL, תמונות למעלה) וAna1-GFP (Ana1, תמונה למטה). עיגול לבן מדגיש את קרום התא בשני תמונות שלב בניגוד וקרינה. העיגולים לבנים המקווקו והעיגול האפור בתמונה הקרינה להדגיש את עמדתו של הגרעין והגרעינון, בהתאמה. נקודות חץ צהובה לY-כרומוכמה לולאות. אדום מקווקו חוגים לסמן את המיטוכונדריה. השלבים 1-6 מתייחס ל29 ושלבי 13-17 מתייחס לתיאור של שלבי תא ב32. שלב 1: היסודי Spermatocyte. זוהה כתאים קטנים קצה של האשך. 2a שלב: פולאר Spermatocyte. שזוהה על ידי נוכחותו של כובע מיטוכונדריה בצד אחד של הגרעין. שלב 3: Apolar Spermatocyte. זוהה על ידי הגודל הגדול יחסית שלה מאשר spermatocyte וחוסר כובע מיטוכונדריה העיקריים. שלב 4: היסודי Spermatocyte. שזוהה על ידי המראה של כל: כל 3 לולאות כרומוזום Y. שלב 5: למבוגרים ראשוניים Spermatocyte. Spermatocyte הגדול ביותר המיוצר בתאי זרע שנוצר על ידי עלייה נוספת בגודל גרעיני. שלב 6: Premeiotic הראשי Spermatocyte. לולאות כרומוזום Y להתפורר והגרעין נעלם. שלב 13: בצל שלב Spermatid. תא עגול המכיל גרעין ומיטוכונדריה שווה בגודלן. שלב 17: spermatid המאוחר. זוהה כspermatid מוארך שנשאר חלק מbundlדואר של 64 spermatids עם גרעינים שנמצאו ליד הבסיס של האשכים., גרעינים הם מעט רחבים יותר מבוגר spermatids נמצא בשלפוחית ​​הזרע. ברים סולם, 10 מיקרומטר ו1 מיקרומטר. B) גרף מתאר סטייה עבור כל שלב ממוצעת וסטנדרטית, כפי שנמדד על ידי Asterless-GFP (כחול) וAna1-GFP (ירוק). בשלב 6, Asterless-GFP (כחול) וAna1-GFP ממוצעים (ירוקים) וסטיות תקן החפיפה וAsterless-GFP בלבד (כחול) הוא נראית לעין. החל מהשעה 13 השלב, Asterless-GFP לא לקשט את כל centriole ומדידות לא נקבעו (ND). <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5.jpg" alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5highres.jpg"/> איור 5. Centrioles באופן חריג לזמן בשלב מוטאנטים 6 Spermatocytes של aly ויכול. AC) מיקרוסקופ אור של אשכים כולו ולוח ניאון של la centrosome נציגbeled ידי Ana1-GFP. שים לב לצורה נורמלית של האשכים בaly ויכול מוטציות, הנובעת ממחסור בspermatids כתוצאה ממעצר meiotic. ד) גרף מתאר ממוצע, סטיית תקן, והפצת נתונים של אורך centriole בwild-type, אליי ויכול . מספר לדוגמא עבור כל נקודת נתונים הוא בסוגריים. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Centrosomes in Fly Testes at JoVE.com

Imaging Centrosomes in Fly Testes

הדמיה של חלבוני centrosomal במהלך spermatogenesis דרוזופילה היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לביולוגית centrosome, כמו גם על מנת להבהיר את הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליך זה.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cell Division

SCIENTISTS IN ACTION

15.9K Views.  University of Toledo.  הדמיה של חלבוני centrosomal במהלך spermatogenesis דרוזופילה היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לביולוגית centrosome, כמו גם על מנת להבהיר את הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליך זה. 

Video: Imaging Centrosomes in Fly Testes

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

השרשה של Ferumoxides תווית אדם בתאי גזע mesenchymal ב פגמים סחוס

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...